Summary
Um protocolo para a quantificação de proteínas em fluidos biológicos complexos usando tecnologia automatizada imuno-MALDI (iMALDI) é apresentado.
Abstract
Espectrometria de massa (MS) é uma das tecnologias mais utilizadas para quantificar proteínas em amostras complexas, com especificidade de excelente ensaio em resultado da detecção direta de relação massa-de-carga de cada molécula do alvo. No entanto, proteômica baseada em MS, como a maioria das outras técnicas analíticas, tem um viés para medição alta abundância analitos, então é um desafio para atingir limites de deteção de baixo ng/mL ou pg/mL em amostras complexas e isto é o intervalo de concentração para muitos doença-relevantes proteínas em biofluids tais como plasma humano. Para auxiliar na detecção de baixa abundância analitos, imuno-enriquecimento foi integrado no ensaio para concentrar-se e purificar o analito antes da medição do MS, melhorando significativamente a sensibilidade do ensaio. Neste trabalho, a imuno - Matrix-Assisted Laser dessorção/ionização (iMALDI) tecnologia é apresentada para a quantificação de proteínas e peptídeos em biofluids, com base em imuno-enriquecimento em grânulos, seguida por MALDI-MS medição sem prévia eluição. Os anticorpos antipeptídeos são acrescidos em grânulos magnéticos e incubados com amostras. Após a lavagem, os grânulos são transferidos diretamente em uma placa de destino MALDI, e os sinais são medidos por um MALDI-tempo de instrumento de voo (MALDI-TOF) após a solução de matriz foi aplicada aos talões. O procedimento de preparação de amostra é simplificado em comparação com outros ensaios imuno-MS, e a medição de MALDI é rápida. A preparação de toda a amostra é automatizada com um manuseio sistema, com reprodutibilidade do ensaio melhorada e uma taxa de transferência de líquidos. Neste artigo, o ensaio de iMALDI é usado para determinar a angiotensina peptídeo eu (Ang eu) concentração no plasma, que é usado clinicamente como leitura da atividade de renina do plasma para o rastreio de aldosteronismo primário (PA).
Introduction
Espectrometria de massa tornou-se uma ferramenta indispensável em proteômica quantitativa. Espectrometria de massa pode determinar as massas de alvo proteínas ou peptídeos, portanto, os sinais obtidos do analito podem ser altamente específicos em comparação com os imunoensaios. Dois métodos de ionização, electrospray e MALDI, são mais comumente utilizados para a detecção de proteínas e peptídeos1,2,3,4. Um grande desafio na quantificação da proteína baseada em MS situa-se na detecção de proteínas de baixo-abundância em amostras complexas, em concentrações ng/mL ou pg/mL, na presença de proteínas de alta-abundância, e muitos biomarcadores de candidato proteína encontradas no plasma humano são dentro desta escala5. Esse problema é causado pela maior parte pelo inerentemente ampla faixa dinâmica e complexidade do proteoma humano6.
Para superar esses desafios de deteção, foram desenvolvidos métodos imuno-MS para enriquecer o alvo proteínas ou peptídeos partir das soluções de amostra em uma superfície sólida, seguido por eluição dos analitos e MS medição7,8 , 9 , 10. através de imuno-enriquecimento, os analitos são purificados de amostras complexas e, por conseguinte, os efeitos do íon-supressão de outras moléculas são minimizados. Entre vários suportes sólidos, grânulos magnéticos são atualmente mais amplamente utilizados como eles têm as vantagens da capacidade de ligação do anticorpo alta e facilidade de manuseio. Esferas magnéticas com functionalizations diferentes e tamanhos foram desenvolvidas e comercializadas para experimentos de imunoprecipitação. Até à data, imuno-enriquecimento em grânulos tem sido interfaceado com ionização electrospray (ESI) e MALDI-MS para medição de proteínas e peptídeos. Em padrões de isótopo estável e captura pela tecnologia de anticorpos antipeptídeo (SISCAPA), proteínas nas amostras são digeridas, seguido de incubação com grânulos de anticorpo-revestido para imuno-enriquecimento. No SISCAPA "clássica", os peptídeos proteotypic capturados são eluídos dos grânulos e medidos pelo líquido cromatografia-ESI-MS (LC-MS), ou por infusão direta ESI-múltiplas reação monitoramento-MS (ESI-MRM-MS)11,12. Imuno-enriquecimento melhorou a sensibilidade do ensaio MRM, por 3-4 ordens de magnitude, atingindo os de gama baixa ng/mL13.
Em comparação com electrospray-MS, MALDI-MS é mais rápido e não envolve a limpeza e a re-equilibração de colunas LC então não há problemas reportes e contaminação, tornando-o mais adequado para estudos de alta produtividade14. Imuno-MALDI tecnologia foi desenvolvida em nosso laboratório para combinar imuno-enriquecimento com MALDI-MS para quantificação de sensível e específica de peptídeos e proteínas (com base na quantificação de peptídeos proteotypic)15,16 ,17. Depois imuno-enriquecimento, os grânulos são depositados sobre uma placa MALDI-alvo, a solução de matriz é adicionado à grânulos e o prato está pronto para análise por um MALDI-TOF-MS após a secagem. Eluição dos peptides da missanga não é executada como uma etapa separada, mas ligados a afinidade analitos são eluídos por solução de matriz a MALDI quando ele é adicionado aos pontos do grânulo, desse modo simplificando a preparação da amostra e minimizando a perda de amostra. A tecnologia de iMALDI tem sido aplicada em uma variedade de aplicações de18,19e recentemente foi automatizada e utilizada para a medição da angiotensina eu (Ang eu) para a determinação de plasma renina atividade (PRA)20. Este protocolo irá demonstrar o procedimento utilizado para realizar um ensaio iMALDI automatizado. O ensaio PRA a tomar como exemplo, inter dias CVs de menos de 10% foram obtidos por meio da automação, com a capacidade de medir 744 amostras por dia20.
O ensaio PRA iMALDI demonstrado neste manuscrito não requer digestão de proteínas, como a molécula alvo (Ang eu) é um peptídeo com um peso molecular de 1295.7 Da. Em outros ensaios, onde a digestão de proteínas é necessário e um peptídeo é usado como o substituto para a proteína intacta, o peptídeo selecionado para iMALDI deve ser exclusivo e específico para a proteína do alvo, com uma massa mais de 800 Da então que ele pode ser distinguido facilmente o c hemical ruído a partir da solução de matriz MALDI. Anticorpos antipeptídeos são necessários para o imuno-enriquecimento dos peptides. O protocolo para um ensaio de iMALDI medição PRA consiste em quatro etapas: 1) geração de Ang I em plasma humano; 2) imuno-enriquecimento de Ang I usando grânulos anticorpo-revestido; 3) transferência de contas para uma placa-alvo MALDI e adicionando solução de matriz; e 4) aquisição de sinal por uma análise de dados e MALDI-TOF-MS20.
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Protocol
as quantidades dos reagentes descritos abaixo são baseadas na medição de 20 amostras de plasma do paciente. O protocolo apresentado abaixo segue as orientações do Universidade de Victoria ' Comissão de ética de pesquisa humana s.
1. geração de Ang I em Plasma humano
- descongelar amostras de plasma (≥ 200 µ l) em uma sala de temperatura água banho por 5 min e em seguida, colocar as amostras no gelo até completamente derretido.
- Transferência de 200 µ l de cada amostra de plasma manualmente para separar poços de uma placa de poço profundo 1,1 mL (placa da amostra) e centrifugar a placa em uma centrífuga para 10 min a 2 ° C e g. de x 1278
- Usar um líquido automatizado sistema de manipulação para diluir em série 500 fmol / µ l Ang I NAT solução padrão para preparar seis soluções de Calibrador com albumina de ovo de galinha (0.1, 0.2, 0.6, 1.9, 5.7, 17,2 fmol / µ l).
- Pipetar 200 µ l de cada Calibrador para um bem e 125 µ l da geração buffer para a placa da amostra.
Nota: O CEWA no buffer de solução salina tamponada (PBS) precisa ser preparado no dia do experimento de fosfato. - Usando um líquido automatizado sistema de manipulação, em um novo prato misture 125 µ l de plasma sobrenadante ou 125 µ l de CEWA em PBS com 25 µ l de Ang eu buffer de geração, que contém 1 M Tris, ácido de 0,2 mM ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e 1 mM fluoreto de phenylmethylsulfonyl (PMSF).
Nota: Preparar o Ang eu buffer de geração através da mistura de um 1 M Tris/0.2 mM EDTA aquosa de tampão (ajustar o pH 5.5 usando ácido acético) e uma solução PMSF (100mm em metanol). Ambas as soluções podem ser armazenadas 1 mês em soluções de mistura os dois 4 ° C. no dia do experimento. - Automaticamente transferir as soluções para uma placa de 96 poços, 3 repetições por solução, 34 µ l por bem. Incubar a placa a 37 ° C por 3 h.
2. Imuno-enriquecimento de Ang eu grânulos revestidos usando anticorpo
- conjugação do anticorpo em grânulos de proteína G magnéticos
Nota: conjugação do anticorpo com os grânulos é executada manualmente durante a 3h Ang eu período de geração na dia do experimento. Para outros analitos, os grânulos conjugados podem ser capazes de ser armazenado no buffer PBS contendo 0.015% CHAPS (PBSC) em 4 ° C, durante três meses ou mais, dependendo das propriedades e estabilidade do anticorpo.- µ L 110 de transferência de dejetos de talão (o suficiente para medir 20 amostras e fazendo uma curva padrão de 6 pontos) em um tubo de 1,5 mL. Lave os grânulos sete vezes com 1 mL de acetonitrila/PBSC de 25% e três vezes com 1 mL de PBSC. Use um suporte magnético para granular os grânulos entre cada etapa de lavagem. Retire o tampão de lavagem após a última lavagem.
Nota: Lavar 7 vezes com 25% acetonitrila/PBSC é crítica para a remoção dos aditivos incompatível com a MS no chorume do grânulo, tais como Tween-20. Se não houver nenhum desses aditivos em grânulos selecionados, esta etapa de lavagem extensa pode não ser necessária. - Resuspend os grânulos no 110 µ l de PBSC e adicionar 110 µ l de anti-Ang eu anticorpo (concentração do anticorpo final: 100 µ g/mL). Misture a solução e grânulos pipetando e então eles incubar à temperatura ambiente durante 1 h, girando a 8 rpm.
- Lave os grânulos 3 vezes com 1 mL de PBSC e Resuspenda em µ l 1100 de PBSC.
Nota: Se qualquer solução de grânulo fluiu na tampa do tubo durante a incubação, spin para baixo a solução usando uma centrífuga de bancada em 2680 g. x - Transferir a solução de talão manualmente para uma placa de 96 poços (grânulo placa padrão). Usar o líquido automatizado sistema de alíquota de manipulação as contas para a mesma placa de 96 poços, 120 µ l por bem..
- µ L 110 de transferência de dejetos de talão (o suficiente para medir 20 amostras e fazendo uma curva padrão de 6 pontos) em um tubo de 1,5 mL. Lave os grânulos sete vezes com 1 mL de acetonitrila/PBSC de 25% e três vezes com 1 mL de PBSC. Use um suporte magnético para granular os grânulos entre cada etapa de lavagem. Retire o tampão de lavagem após a última lavagem.
- imuno-enriquecimento em grânulos
- após a 3h Ang período de geração, coloco a placa de incubação na gelo durante 10 minutos terminar a geração de Ang I.
- Automaticamente diluir a solução-mãe SIS peptídeo (10 pmol/μL) 100-fold com PBS buffer e ainda mais automaticamente alíquota a diluição do padrão de peptídeo isoptope estável para um prato PCR de 96 poços. Transferência de 1,5 µ l de uma solução de peptídeo de padrões (SIS) isótopo estável (contendo 100 fmol) em cada poço da placa de incubação e misture com as amostras de plasma ou a CEWA nos buffers de PBS.
- Automaticamente transferir o conteúdo da placa de incubação para a solução do grânulo, 10 mL por bem, misturar a.
- Rodando a 8 rpm, incubar a placa a 4 ° C, durante 1 h.
- Lave os grânulos três vezes automaticamente com solução de bicarbonato de amónio (AmBic) de 5 mM, 100 µ l por alvéolo por lavagem. Após a última lavagem, resuspenda os grânulos em 7 µ l de solução AmBic em cada poço de 5 mM. Use um ímã para puxar os grânulos para o fundo após a última lavagem.
3. Transferência de contas em um prato de alvo de MALDI e adicionando a solução de matriz
- transferência 7 µ l do chorume grânulo automaticamente em um prato de alvo MALDI com um tamanho de ponto de 2.600 µm. Deixe secarem os grânulos.
Nota: Um pequeno ventilador alimentado por USB pode ser usado para acelerar o processo de secagem de talão. - Automaticamente adicionar 2 µ l de ácido α-cyano-4-hidroxicinâmicos (HCCA)-solução de matriz (contendo 3 mg/mL HCCA, citrato de amónio de 1,8 mg/mL, acetonitrilo 70% e 0,1% o ácido trifluoroacético) da matriz bem para cada amostra local sobre a placa-alvo .
4. Aquisição por uma MALDI-TOF-MS e análise de dados de sinal
pontos- analisar a amostra com um instrumento de MALDI-TOF usando modo positivo refletor. Executar a calibração interna, suavização de dados e subtração de base automaticamente com o software específico do fornecedor.
Nota: O modo (linear/positivo/negativo, refletor) selecionado para medição de MALDI-TOF depende a peptídeos alvo ou proteínas. - Calcular a taxa de resposta relativa (relação de intensidade de Nat/SIS) e compará-lo com a curva padrão para determinar do Ang eu concentração em cada amostra. Calcular PRA usando a equação (1), onde Δt Ang eu geração representa o tempo usado para a geração de Ang I.
PRA = [Ang eu] / Δt Ang eu geração (1)
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Representative Results
Um procedimento iMALDI automatizado para medição de Ang é mostrado na Figura 1. Peptídeos de alvo (endógenos ou peptídeos de proteínas digeridas) são enriquecidos em grânulos magnéticos antipeptídeos, e em seguida as contas são transferidas para uma placa-alvo para a medição de MALDI. Todo o processo é simplificado em comparação com outras tecnologias de imuno-MS que exigem etapas de eluição de peptídeo adicionais. Automação do ensaio iMALDI permite a análise da elevado-produção de um grande número de amostras com um dia Interamericano de coeficiente de variação (CV) abaixo de 10% 20. Representante espectros obtidos pela medição Ang I em amostras de plasma humano são mostrados na Figura 2. A função de peptídeos SIS como padrão interno para quantificação de peptídeo. Correlação de valores PRA de 188 amostras de pacientes, obtidas com o ensaio de iMALDI automatizado com PRA valores obtidos por meio de uma clínica de procedimento de LC-MS/MS17 é mostrada na Figura 3. Os dois métodos têm um coeficiente de correlação de 0,98; a diferença entre as encostas pode ser causada pelo uso de diferentes padrões internos nos dois métodos, ou pelo uso de anticorpos diferentes no iMALDI procedimento20. O intervalo linear do ensaio e a precisão do ensaio são mostradas na Figura 4 e Figura 5.
Figura 1: Esquema de fluxo de processo de um ensaio PRA automatizado iMALDI. Adaptado da referência20, com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Representante espectros da NAT e SIS Ang eu peptídeos medido a partir de uma amostra de plasma humano.
Figura 3: Valores de correlação da PRA medido por iMALDI e por LC-MS/MS de 188 amostras. Adaptado da referência20, com permissão.
Figura 4: Linear varia do ensaio PRA iMALDI no refletor (A) e (B) de modo linear. Adaptado da referência20, com a permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Precisão de interday (B) de iMALDI e intradiário precisão (A) PRA ensaios sobre pools de plasma com valores PRA baixos, médios e altos. Adaptado da referência20, com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Comparado a quantificação de proteína convencional baseada em MS, iMALDI utiliza anticorpos para enriquecer os analitos e purificá-los de amostras complexas, portanto, tornando possível quantificar proteínas ou peptídeos em baixas concentrações. Um passo crítico no protocolo iMALDI é o imuno-enriquecimento dos peptides alvo. Para este efeito, devem ser selecionados anticorpos com alta especificidade e afinidade. Em SISCAPA, relatou-se que seriam necessários para atingir alta sensibilidade em baixa ng/mL21afinidades de anticorpo em 10-9 M ou melhor. Além disso, grânulos com capacidade de ligação do anticorpo alta são preferidos para enriquecimento ideal.
Também é importante gerar espectros relativamente "limpos" para as moléculas-alvo com níveis de fundo mínimo. Rácios de sinal-ruído altos podem ser alcançados através de extensa do grânulo de lavagem após a etapa de imuno-enriquecimento. Além disso, nós encontramos que lavando as manchas do grânulo na placa de destino após a adição e a solução de matriz de secagem podem reduzir significativamente os sinais de ruído e, assim, melhorar a relação sinal-ruído.
O ensaio PRA iMALDI demonstrado neste trabalho não exige as etapas de proteólise, como a molécula alvo Ang I é um peptídeo. Para quantificar as moléculas de proteína em uma amostra, a proteína é normalmente digerida em peptídeos antes imuno-enriquecimento, embora para epítopo contendo peptídeos, a digestão pode ser executada em proteína capturado22,23. Neste caso, um protocolo de digestão de proteínas existentes pode ser facilmente inserido iMALDI fluxo de trabalho. Dependendo o buffer de digestão, um passo do desalting pode ser necessário antes da captura dos peptides em grânulos, para evitar a interferência com a ligação do anticorpo-peptídeo.
Semelhante a outros métodos de imuno-MS, a produção de anticorpos antipeptídeos é um grande desafio no desenvolvimento de ensaios iMALDI. Recentemente, Triple X Proteomics tecnologia foi desenvolvida para produzir fichários de afinidade que podem atingir vários peptídeos por fichário24. Isto pode reduzir o custo de anticorpos antipeptídeos e facilitaria o desenvolvimento de ensaios multiplexados simultâneos, usando uma única incubação. Além disso,25 de fragmentos de anticorpos ou sintético aptamers26 pode ser alternativas ao uso de anticorpos intactos e teria a vantagem de produção mais fácil. Aptamers sintéticos têm sido relatados como mostrando níveis inferiores fundo anticorpos intactos quando usado por afinidade-enriquecimento26.
iMALDI tecnologia combina as vantagens de imunoensaios com espectrometria de massa MALDI, permitindo a análise de proteína/peptídeo rápida, alta produtividade em um grande número de amostras complexas, com alta sensibilidade e especificidade. Ao contrário de outros métodos de imuno-MS, após imuno-captura, o alvo de peptídeos não são eluídos no tubo, mas os grânulos escriturados analitos são transferidos para a placa-alvo MALDI para MS-análise, evitando assim a perda de peptídeos devido sua adsorção de plástico tubos. Em comparação com ferramentas de proteomic amplamente utilizado como borrão ocidental ou ELISA, somente um anticorpo é necessária em iMALDI, reduzindo significativamente o tempo de desenvolvimento de ensaio e o custo. O limite inferior de detecção que temos obtido no ensaio PRA é comparável ao ELISA convencional e bem dentro da faixa fisiológica. O anticorpo e a relação de massa-de-carga fornecem um processo de seleção dupla, que garante a alta especificidade do ensaio. Aplicações de iMALDI não é limitadas aos ensaios PRA, mas pode ser aplicado para quantificação de qualquer expressão de proteínas e até mesmo a quantificação da modificação de proteína em amostras complexas. Notavelmente, o iMALDI elevado-produção automatizada pode ser uma poderosa ferramenta clínica para a descoberta e a validação de biomarcadores de proteína em uma variedade de doenças, devido à presença de bancada MALDI instrumentos actualmente utilizados em clínicas para bacteriana identificação.
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Disclosures
C.H.B detém a patente sobre a tecnologia iMALDI.
Acknowledgments
Agradecemos o apoio financeiro de Canadá do genoma e genoma da Colúmbia Britânica para operações (204PRO) e desenvolvimento de tecnologia (214PRO) através de rede de inovações o genoma (gim). Agradecemos a plataforma de descoberta de drogas do Instituto de pesquisa do centro de saúde de Universidade McGill para a utilização do instrumento MALDI-TOF para as filmagens. H.L. é grato pelo apoio de uma bolsa de pós-doutorado do nacional de ciência e engenharia pesquisa Conselho de Canadá (NSERC). C.H.B é grato pelo apoio de fundo de dotação a Leading Edge (Lopes). C.H.B. é grato pelo apoio da cadeira McGill Segal em Oncologia Molecular da McGill University (Montreal, Quebec, Canadá). M.X.C. e C.H.B. estão gratos pelo apoio de Warren Y. Soper Charitable Trust e o Alvin Segal Family Foundation para o Hospital Geral judaico (Montreal, Quebec, Canadá).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Healthy control human plasma | Bioreclamation | HMPLEDTA2 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 09830 | |
| Ammonium citrate dibasic | Sigma Aldrich | 09833 | |
| CHAPS (>=98%) | Sigma Aldrich | C9426 | |
| Albumin from chicken egg white (>98%) | Sigma Aldrich | A5503 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | EDS | |
| Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma Aldrich | 70990 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma Aldrich | 78830 | |
| Trifluoroacetic acid | Thermo Fisher Scientific | 85172 | LC-MS grade |
| acetonitrile | Fluka | 34967 | LC-MS grade |
| water | Fluka | 39253 | LC-MS grade |
| acetic acid | Fluka | 320099 | LC-MS grade |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Roche Diagnostics | 3118169001 | |
| Dynabeads Protein G magnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 10003D | 2.8 μm, 30 mg/mL |
| anti-Ang I goat polyclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-7419 | |
| Nat and SIS Ang I | synthesized at the University of Victoria-Genome BC Proteomics Centre | ||
| Automated liquid handling system | Agilent | 16050-102 | Agilent Bravo robotic workstation |
| Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Invitrogen DynaMag-2 magnet |
| Tube rotator | Theromo Scientific | 400110Q | Labquake Tube Rotator |
| Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12027 | DynaMag-96 side skirted magnet |
| Magnet | VP Scientific | 771RM-1 | used to pull the beads to the bottom of the well |
| MALDI-TOF | Bruker | Bruker Microflex LRF instrument |
References
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