Summary
Epidermala keratinocyter bildar en funktionell hudbarriär och är placerade på framsidan av värdförsvar mot externa miljöskador. Här beskriver vi metoder för isolering och primärkultur av epidermala keratinocyter från neonatal och vuxen mushud och induktion av terminal differentiering och UVB-utlöst inflammatoriskt svar från keratinocyter.
Abstract
Keratinocyt (KC) är den dominerande celltypen i epidermis, det yttersta skiktet i huden. Epidermal KCs spelar en viktig roll för att skydda huden genom att bilda en intakt hudbarriär mot miljöbelastningar, såsom UVB-bestrålning eller patogener, och även genom att initiera ett inflammatoriskt svar på de förolämpningarna. Här beskriver vi metoder för att isolera KC från neonatal mushud och från vuxen mushalshud. Vi beskriver också odlingsbetingelser med hjälp av definierade tilläggstillväxt (dGS) i jämförelse med chelexed fetalt bovint serum (cFBS). Funktionellt visar vi att både neonatala och vuxna KCs är starkt mottagliga för högkalciuminducerad terminal differentiering, snäv förbindning och stratifiering. Dessutom är odlade vuxna KCs mottagliga för UVB-utlösad celldöd och kan frisätta stora mängder TNF vid UVB-bestrålning. Tillsammans kommer metoderna som beskrivs här vara användbara för forskare för installationen av in vitro- modellenS att studera epidermisk biologi i neonatalmusen och / eller den vuxna musen.
Introduction
Huden är det största organet i kroppen med epidermis som yttersta lagret. Epidermis spelar en kritisk roll för att bilda en intakt epidermärbarriär för att separera kroppen från miljön och därigenom förhindra vattenförlust och skyddar mot miljöbelastningar, såsom allergener, patogener och UVB-exponering. Epidermis utvecklas från ett enda lager av odifferentierade basala keratinocyter (KCs) till ett flerskiktat stratifierat epitel som består av ett basalskikt följt av ett spinöst skikt, granulärt skikt och stratum corneum. Basala KCs, som består av både epidermala stamceller och transitionsförstärkande celler, är proliferativa och odifferentierade. När basala KCs lämnar cellcykeln, begår cellerna differentiering och migreras gradvis mot ytan av epidermis, åtföljd av mognad av cellcellsförbindelser och bildande av en epidermal permeabilitetsbarriär (EPB). KC: erna vid det roterande skiktet uttrycker tidig differentiärJonmarkörer såsom Keratin 10 (K10); När KC: erna migrerar till det granulära skiktet uttrycker cellerna sena differentieringsmarkörer såsom Filaggrin (FLG), Loricrin (LOR) och Involucrin (INV). Vid stratum corneum blir KC: erna terminalt differentierade corneocyter, vilka slutligen avlägsnas genom desquamation då nya celler ersätter dem.
Kalcium anses vara det mest fysiologiska medlet i epidermis och utlöser differentiering in vitro och in vivo på ett liknande sätt. I normala hudutfall bildar kalciumjoner en karakteristisk "koncentrationsgradient", vilket ökar i koncentrationen mot hudytan 1 , 2 , 3 . Kalciumkoncentrationen stiger från låga nivåer i de lägsta underlagen (basala och spinösa lager) till en topp i det övre granulära skiktet och faller sedan till försumliga nivåer i det mest ytliga skiktet (stratum corneum). Kalciumgradienten utvecklas också tillfälligt med uppkomsten av en komponentpermeabilitetsbarriär, vilket stöder att kalciumsignaleringen spelar en kritisk roll för KC-differentiering. In vitro upprätthåller lågt kalcium (0,02-0,1 mM) proliferationen av basala KC som ett monoskikt, medan högt kalcium (> 0,1 mM) inducerar ett snabbt och irreversibelt åtagande av cellerna till terminal differentiering, såsom demonstreras genom snävkopplingsbildning och induktion Av LOR och INV på högkalciumbehandling till basala KCs 4 , 5 .
Förutom barriärbildning är epidermala KC också en viktig del av hudens medfödda immunsystem. Som svar på patogener eller skadade associerade molekylmönster (DAMP) som frisätts vid UVB-bestrålning eller skada kan KCs producera stora mängder inflammatoriska cytokiner, såsom TNFa, IL6 och IFNp, vilket leder till immunsystemaktivering> 6 , 7 , 8 , 9 . Även om korrekt inflammatorisk signalering från KC är nödvändig för patogenavstånd kan okontrollerat inflammatoriskt svar utlösa utvecklingen av autoinflammatoriska hudsjukdomar, såsom psoriasis och rosacea 6 , 8 .
Sammantaget spelar KCs en viktig roll för att upprätthålla den intakta hudbarriären och initiera ett immunsvar vid patogeneration eller miljöinsatser. Därför är primärkultur av epidermala KCs en användbar teknik för att studera epitelial biologi, KC-differentiering, såväl som KC-stimulerade medfödda immunsvar. Isoleringen och kulturen av primära musepidermala KC kan vara en utmanande process på grund av KC: s mottaglighet och känslighet för olika externa stimulanser. Här beskrivs en metod för att isolera och odla KC från antingen neonatal mushud ellerVuxen mus svans hud. För isolering av vuxna KC använder vi inte musens dorsala hud eftersom isolering av tillräckliga mängder av livskraftiga KC från denna vävnad kan vara svårt av följande skäl: För det första består den vuxna dorsala huden i vilafasen av hårcykeln (telogen) av en Tunn epidermis med endast 1-2 lager av celler, vilket leder till lågcellsutbyte och ineffektiv separation av epidermis från dermis, vilket är det kritiska steget för framgångsrik KC-isolering. För det andra bidrar den höga hårfollikeldensiteten som är närvarande på vuxen dorsal hud ytterligare svårigheten att separera epidermier från dermis. I stället använder vi rutinmässigt svanshud som källa för vuxna muskolor, eftersom detta epitel är tjockare med 3-5 lager av epidermala KC. Det har också en lägre hårfollikeltäthet, vilket inte stämmer överens med epidermiseparationen, vilket möjliggör KC-isolering från vilken som helst vuxen mushals, oberoende av musens ålders- och hårcykeltrafik. Den isolerade neonaTal KCs utsöndras till gelatinbelagda odlingsrätter medan kollagenbelagda rätter används för att frö isolerade vuxna KCs på grund av den vuxna cellens nedsatta förmåga att vidhäfta jämfört med deras neonatala motsvarigheter. För att odla mus-KCs kompletteras lågt kalciumbasalt medium med dGS, som innehåller epidermal tillväxtfaktor (EGF), bovint transferrin, insulinliknande tillväxtfaktor1 (IGF1), prostaglandin E2 (PGE2), bovint serumalbumin (BSA) och hydrokortison. Mellan 2-4 dagar efter den initiala pläteringen kan de flesta av de differentierade KC: erna tvättas bort under dagliga mediumförändringar och de återstående vidhäftande cellerna visar typisk kullerstenmorfologi 4 , prolifererar och uttrycker inte den tidiga differentieringsmarkören K10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök är godkända av UCSD Institutionella djurvård och användningskommitté.
1. Primär mus-KC-isolering och -kultur från neonatal hud
- Offra postnatala dag 0-2 nyfödda från C57B / 6 vildtypsmusstammen genom dekapitation med användning av sax. Klipp av lemmarna strax ovanför handleden och fotled, och skära sedan av svansen helt och lämna ett litet hål.
- För att avlägsna hela huden, sätt in en vass sax genom hålet i svansen och skär huden längs kroppens dorsala mittlinje till öppningen på nacken. Använd sedan en tång för att ta tag i den exponerade kroppen och de andra tången för att ta tag i huden, och skölj försiktigt hela huden från kroppen och över benstubborna med en kontinuerlig rörelse.
- Skala av huden som ett intakt stycke och var försiktig så att inte huden sönderdelas, eftersom detta kommer att leda till cellförlust under avskiljningssteget.
<Li> Skölj den avskalade huden med 15 ml steril PBS i en 10 cm petriskål och placera sedan huden från varje pup i ett 2 ml rör fyllt med iskall avgivningsbuffert som innehåller 4 mg / ml dispas i KC-tillväxtmedium (KC basmedium har 0,06 mM CaCl2, DGS och antibiotika / antimykotika). - Se till att huden inte viks i röret, eftersom det kommer att leda till otillräcklig exponering av den vikta regionen i dispaslösningen.
- På nästa dag (efter 12-18 h i dispash), överför huden tillsammans med dispaslösningen till en petriskål. Överför varje vävnadsstycke till en ny petriskål med 15 ml sterilt PBS för att tvätta bort överskott.
- Använd två par tångar, ta tag i huden från PBS,Lyft huden och överför till en ny petriskål med epidermal sidan ner och dermisidan uppåt. Sträcka noggrant hudvecken så att den är helt utsträckt på petriskålen.
- Placera 500 μL av en trypsinbaserad digestionslösning för varje hud i en ny petriskål. Med hjälp av pincett lyfter du långsamt upp dermis och bort från epidermis, medan du håller epidermis ner. Kassera dermis som biohazardiskt material. Överför den separerade epidermis och flyta på varje droppe trypsinlösning med basalskiktet nedåt.
- Om epidermis viks på trypsinlösningen, ta bort eventuella veck med hjälp av pincett för att säkerställa effektiv smältning av basala KC från epitelet.
- Inkubera huden på en petriskål i trypsinlösning vid rumstemperatur (med locket täckt) på en horisontell skakning med försiktig omröring i 20 minuter.
- Tillsätt 2 ml tillsatt KC-tillväxtmedium per epidermis (ca 1 tum i storlek perEpidermis) till petriskålen. Ta tag i epidermis med tang och kraftigt gnida epidermis fram och tillbaka för att släppa ut enstaka celler från det epidermala arket.
- Titta på mediet blir alltmer grumligt, eftersom cellerna lossnar från epidermis. Luta upp Petri-skålen för att samla in och överföra cellsuspensionen till ett nytt rör som lämnar det återstående epidermiska arket på skålen.
- Upprepa två gånger gnidningen av epidermärskiktet efter tillsats av 2 ml KC-tillväxtmedium och kombinera cellssuspensionerna i samma rör.
- Pipa celllösningen upp och ner försiktigt ett par gånger för att bryta några cellklumpar med lämplig serologisk pipett och sedan passera genom ett 100 μm filter till ett nytt 50 ml centrifugrör.
- Centrifugera de filtrerade cellerna i 5 minuter vid 180 x g.
- Aspirera av supernatanten och försiktigt resuspendera cellpelleten i 1 ml kallt KC-tillväxtmedium / epidermis.
- Räkna cellerna med en hemocytometer.
- Frö cellerna i en densitet av 5 x 10 4 / cm 2 i KC-tillväxtmedium i odlingsskålar som är förbehandlade med en extracellulär matris (ECM) -produkt som främjar cellinfästning.
OBS: Vi använder ett kommersiellt tillgängligt (t.ex. vidhäftningsfaktor, som är ett gelatinbaserat beläggningsmaterial (se tabellen för material för detaljer) Celler odlades i fuktad inkubator med 5% CO2 vid 37 ° C, och färskt medium var. Fylls på varannan dag.- För beläggning belägger du kultiveringsskålen med cellfästningsbeläggningsmaterialet uppvärmt till rumstemperatur i 10 minuter till 2 timmar före cellsåningen. Ta bort bifogningsfaktorn precis innanTillsats av cellsuspensionen.
- Byt mediet 24 h efter den första pläteringen för att avlägsna oattacherade celler och byt mediet dagligen tills cellerna når den önskade konfluensen före experimentet.
OBS: Flera hudisoler kan kombineras och inkuberas i ett 15 ml rör (upp till 5 skinn per rör) innehållande 12 ml dispaslösning. Inkubera huden röret över natten i ett 4 ° C kylskåp på en rotator.
2. Primär mus KC-isolering från vuxenhalshud
- Uppoffera en vuxen C57BL / 6-mus (helst mellan 6-15 veckor, antingen man eller kvinna) enligt djurföreskrifterna. Klipp av svansen från kroppen från svansbasen och skär av ~ 2 mm av svansspetsen så att det finns ett synligt hål på spetsen.
- För att avlägsna svanshuden, använd först ett skarpt blad för att skära längs svanshuden från basen till svansspetsen. Använd sedan en tång för att ta tag i det exponerade svansbenet och de andra tången för att ta tag i huden, och skölj försiktigt svanshuden från benet med en kontinuerlig rörelse. Skär den skalade huden från mittlinjen så att varje bit är mindre än 2-3 cm lång.
- Skölj avskalad hudvitaH 15 ml steril PBS i en 10 cm petriskål, placera sedan huden från varje svans i ett 2 ml rör fyllt med iskallt spjälkningsmedelsbuffert (4 mg / ml dispas i KC-tillväxtmedium).
OBS: Flera huddelar kan också kombineras och inkuberas i ett 15 ml rör (upp till 5 svans per rör) innehållande 12 ml dispaslösning.- Inkubera huden röret över natten i ett 4 ° C kylskåp på en rotator.
- Utför steg 1,4 till 1,13 för att isolera enkelcellsuspensionen från svanshuden.
- Ympa vuxna celler vid en densitet av 10 x 10 4 / cm 2 (räknas av en hematocytometer) i KC tillväxtmedium i odlingsskålar i förväg belagda med kollagen.
OBS! Vi använder ett kommersiellt tillgängligt kollagenbaserat beläggningssats (se materialtabellen för detaljer). Cellerna odlades i fuktad inkubator med 5% CO2 vid 37 ° C, och färskt medium var fylls varannan dag. I allmänhet är cOdlingsrätter bör beläggas med kollagen i 30 min till 1 h före cellsåningen. Vi observerar att det finns en signifikant förbättring av Vuxen KC-fästning i skålen när den är belagd med kollagen jämfört med bindningsfaktorn, vilket är ett gelatinbaserat beläggningsmaterial. - Byt mediet 24 h efter den första pläteringen för att avlägsna oattacherade celler och byt mediet dagligen tills cellerna når den önskade konfluensen före experimentet.
3. In Vitro Differentiering av KCs med högt kalcium
- Att inducera terminal differentiering, tillsätt CaCl2 till 0,2 mM i odlingsmediet.
- Alternativt svälta de odlade KC: erna över natten utan tillsatta tillväxttillskott i lågkalcium KC basalt medium före tillsats av högt kalcium.
OBS: Tillväxtfaktorns svält kommer att öka cellåtagandet till tidig differentiering och induktion av tidiga differentieringsmarkörer, såsom K10 5
4. UVB-bestrålningsmedierad celldöd och TNFa-frisättning från KCs
- Kultur musen KCS i KC tillväxtmedium (i humidifierad inkubator med 5% CO 2 vid 37 ° C) med daglig mediumbyte tills cellerna når konfluens. Omedelbart före UVB-bestrålningen, ta bort tillväxtmediet och ersätt med 500 μl PBS. Därefter utsätt cellerna för 25 mJ / cm 2 UVB eller mock kontroll (ingen UVB).
OBS: UVB-bestrålning utförs med handhållna UVB-lampor med två 8W-lampor (312 nm) som tidigare beskrivits 10 . Efter UVB-bestrålning aspireras PBS och färskt medium tillsättes. - Mät och kvantifiera cellens bärbarhet genom CCK-8-celllevarabilitetsanalys vid 6, 8 och 24 h efter UVB-behandling enligt tillverkarens instruktioner 11 .
- Samla det konditionerade mediet från KC: erna som behandlats med UVB vid önskade tidspunkter och mäta frisättningen av TNFaI det konditionerade mediet av Mouse TNF (Mono / Mono) ELISA-kit enligt tillverkarens instruktioner 7 , 12 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Högkalciuminducerad terminal differentiering av neonatala och vuxna KCs. Den primära mus epidermal KCS pläterade och hölls vid 0,06 mM CaCl 2 växte som ett monoskikt, och individuella celler hade en polygonal form med distinkta intercellulära utrymmet, som visar en gatsten utseende när konfluenta (Figur 1A och Figur 2A). Upphöja CaCl2 till 0,2 mM inducerade en snabb morfologi förändring av cellerna. Inom 8 h efter den höga kalciumomkopplaren blev cellerna platta och det distinkta intercellulära utrymmet blev mindre uppenbart och vid 24 timmar blev cellcelladhesionen med snäva korsningar uppenbara ( Figur 1A och Figur 2B ). Bildningen av det kornade cellkuvertet och vertikal cellstratifiering startade omkring 48-72 timmar efter den höga kalciumomkopplaren ( Figur 2B). Att analysera aktin ombyggnad och cell-cell-tight junction bildning under den höga kalcium omkopplaren, behandlades KCS med 0,2 mM CaCla 2 färgades med falloidin (Figur 1B) för att mäta aktin remodellering under KC differentiering 13. Bildandet av de aktinfiberrika filopodiala utsprången mellan de intilliggande cellerna detekterades så tidigt som 3 timmar efter kalciumomkopplaren och aktinfiberreformeringen fortsatte vidare mellan 6-24 timmar och vid 48 timmar blev cellstratifieringen framträdande ( Figur IB ).
Känslighet för mus-KC till UVB-utlösad celldöd och frisättning av TNFa . De odlade vuxen mus KCS exponerades för 25 mJ / cm 2 UVB-bestrålning, och cellviabiliteten och TNFa frisätts i odlingsmediet analyserades. Såsom visas av faskontrastbilderna ( FiguRe 3A), såväl som celllevarabilitetsanalysen ( Figur 3B ), utlöste UVB en tidsberoende död för KC: erna. Efter 24 timmar avrundades huvuddelen av cellerna och avskiljdes från skålen ( Figur 3A ). Som kvantifierad av celllevnadsbarhetsanalysen var ~ 90% av cellerna döda inom 24 timmar efter UVB-behandling ( Figur 3B ; p <0,001 som beräknat genom envägs ANOVA-multiplikationstest). Slutligen visade vi att TNFa, en viktig cytokin som induceras av UVB och driver KC-apoptos efter UVB-bestrålning 14 , utsöndrats rikligt (~ 250 pg / ml inom 24 timmar efter UVB-bestrålning, p <0,001) i odlingsmediet av UVB-behandlade KCs på ett tidsberoende sätt ( Figur 3C ).
Figur 1: Primärkultur av neonatalmus-KCs och högkalciuminducerad terminelldifferentiering och tät cellcellsförbindningsformation. ( A ). Primära neonatal mus KCS behandlades med hög kalcium (0,2 mM CaCl2) och faskontrastbilder vid 4X förstoring togs vid 0 timme (ctrl) och vid 8 timmar efter behandling. Skalstång = 100 μm. ( B ). Neonatala KCS differentierades i närvaro av 0,2 mM CaCl2, och cellerna färgades med falloidin (röd) för att visualisera bildningen av aktin fiberrika filopodial utsprång mellan de intilliggande cellerna under differentiering. Kärnor motverkades med DAPI, och aktinfibrer färgades med rhodaminfalloidin. Skala bar = 25 μm. Bilder togs vid 20X förstoring med användning av ett fluorescensmikroskop inställt på DAPI-kanalen (för kärnfärgning) och RFP-kanal (för aktinfärgning). Lank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Primärkultur och högkalciuminducerad Terminal Differentiering av KCs med vuxna mus. ( A ). Faskontrastbilder vid 10x förstoring av primära vuxna mus-KCs vid 8 timmar, 1 dag, 2 dagar och 3 dagar efter initial plätering. Övre panelen representerar celler odlade i dGS, och den nedre panelen representerar celler odlade i 10% chelexed FBS (cFBS) med 8 ng / ml rekombinant mus EGF. Skalstång = 100 μm. ( B ). Konfluenta vuxna mus KCS differentierades i närvaro av 0,2 mM CaCl2, och faskontrastbilder vid 10X förstoring togs vid 0 (ctrl), 8, 24, 48, och 72 h efter högt kalcium omkopplare. Skalstång = 100 μm.Nk "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Primärkultur av vuxna mus-KCs och mottaglighet av vuxna KCs till UVB-inducerad celldöd och frisättning av TNFa. Primära vuxna mus KCS odlades till sammanflytning, exponerades sedan för 25 mJ / cm 2 UVB-bestrålning. ( A ) Faskontrastbilder vid 10X förstoring vid 12 och 24 timmar efter UVB-exponering visade en tidsberoende UVB-inducerad celldöd. Skalstång = 100 μm. ( B ) Celllevarabiliteten kvantifierades genom CCK-8-celllivabilitetsanalys vid 6, 8 och 24 h efter UVB-behandling. ( C ) UVB-inducerad frisättning av TNFa till media vid angivna tidpunkter mättes med ELISA. Alla felstavar anger medelvärdet ± SEM. P-värdena beräknades genom enkelriktad ANOVA multipel jämförelseTest (***, p <0.001) Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Huden epidermis fungerar som en kritisk barriär för att separera och skydda kroppen från omvärlden och skador från vattenförlust, patogener, värme och UV-bestrålning. KC: erna är övervägande celllinje av epidermis, och primära kulturen av epidermala KC är ett användbart verktyg för att studera och förstå de biologiska processerna för barriärbildning och KCs respons på miljöbelastningar in vitro .
Här beskriver vi metoder för att isolera och odla primära epidermala KC från neonatal och vuxen mushud. Medan primärmus-KC kan isoleras bekvämt från neonatal mushud anses isoleringen och framgångsrik odling av vuxna KCs svåra på grund av uttunning av epidermis och den höga hårfollikeldensiteten hos den vuxna musens dorsala hud. Metoden som beskrivs här använder vuxen mushalshud som en bekväm och riklig källa till basala KCs. På grund av närvaron av en tjock epidermis och låg Hårfollikeldensitet i svansskinnet blir det kritiska steget att isolera KCs genom att separera epidermis från dermis möjlig efter överdrivning av spjälkning av svanshuden. Däremot misslyckades vårt försök att isolera KCs från vuxen dorsal hud med detta protokoll, vilket resulterade i lågcellsutbyte efter isolering och lågcellsförslutning efter plätering. Emellertid har framgångsrik isolering och odling av KCs från vuxen dorsal hud rapporterats efter överdriven trypsindelning av den pälsfria huden 15 , vilket tyder på att avskiljning ensam inte kan vara tillräcklig för att extrahera follikulära KC från dermis av den vuxna dorsala huden.
I detta protokoll odlades de primära KC: erna i lågt kalciummedium kompletterat med dGS istället för den kalciumutarmade chelexed-FBS, vilken användes allmänt i flera tidigare publicerade muskulturkampanjprotokoll 4 , 15 , "> 16 , 17 , 18. I denna studie observerades att dGS är överlägsen chelexed FBS för att odla vuxna mus-KCs och för att upprätthålla KC: s basalcellmorfologi ( Figur 2A ). Det är emellertid troligt att effektiviteten hos chelexed-FBS För att upprätthålla KC: s basala morfologi kan bero på det FBS-parti som användes i varje studie.
Med hjälp av de metoder som presenteras här visade vi att både epidermal KCs med neonatal och vuxen mus svarade på högkalciumutlösad terminal differentiering, snäva cellförbindelser och stratifiering ( Figur 1 Och figur 2 ). I allmänhet ökar den extracellulära kalciumnivån till större än 0,1 mM utlösande terminal differentiering av basala KCs 4 , 5 , 17 ,Röv = "xref"> 19. Det har rapporterats att en mellanliggande nivå av kalcium (0,1-0,16 mM) väsentligen inducerade uttrycket av tidiga differentieringsmarkörer, såsom K1 och K10, under de första 24 timmarna efter kalciumomkopplaren, medan K1 och K10 endast inducerades i en liten Fraktion av celler när de behandlades med högre kalciummedium (1 mM) 19 , 20 . Det högre kalciummediet (≥1 mM) har emellertid använts i många andra studier för att snabbt och robust inducera KC-stratifiering och uttrycket av sena differentieringsgener, såsom INV och LOR 4 , 21 , 22 , 23 . Baserat på vår erfarenhet, en mellanliggande nivå av kalcium, såsom 0,2 mM CaCl2, leder till en gradvis och långsammare igångsättning av terminal differentiering, medan en högre kalciumnivåer (≥ 1 mM) drastiskt påskynda uppkomsten av KC teRminal differentiering, vilket leder till ett kortare tidsfönster för att studera cellförändringarna under differentiering. Därför använde vi 0,2 mM CaCl2 för att inducera KC terminal differentiering, och vi har visat att denna mellanliggande kalciumnivån ledde till en gradvis förändring av det basala cellmorfologin till en skiktad corneocyte morfologi inom 72 h efter det att kalcium omkopplaren (Figur 2B).
Vår grupp har tidigare visat att epidermala KCs också spelar en viktig roll för att initiera inflammatoriska reaktioner på patogener eller DAMPs som frigörs vid skada och / eller UVB-bestrålning 6 , 7 , 8 , 9 , 10 . I överensstämmelse med de in vivo observationerna visade vi här att odlade vuxna mus-KCs var mycket mottagliga för UVB-utlösad celldöd och UVB-behandlade KCer släppte en storMängd TNFa, vilken är en nyckel inflammatorisk cytokin som aktiverar immunsystemet.
Sammanfattningsvis tillhandahåller den primära mus-epidermala KC-cellodlingen en användbar in vitro- modell för att studera epidermalbarriärbildning och medfödd immunsvar hos KCs, och de metoder som beskrivs här kommer att vara av intresse för forskare som utför studier i kutan biologi i neonatalmusen som Såväl som i den vuxna musen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NATIONAL INSTITUT OF ARTHRITIS AND MUSCULOSKELETAL AND SKIN DISEASES grant (R01AR069653 till Zhang LJ) och National Institutes of Health Support (5T32AR062496-03 till CA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 neonates or adult wildtype mice | Jackson Laboratory | 000664 | Wildtype mice (originally purchased from Jackson Laboratory) are breeded and maintained in animal vivarium at UCSD. |
| KC basal medium (EpiLife) | Invitrogen, Carlsbad, CA | MEPICF500 | basal medium for keratinocyte culture with 0.06 mM CaCl2 |
| Defined Growth Supplement (dGS) | Invitrogen, Carlsbad, CA | S0125 | defined growth supplements for culture medium |
| Dispase powder | Invitrogen, Carlsbad, CA | 17105041 | enzyme to dissociate the epidermis from dermis |
| Attachment Factor | Invitrogen, Carlsbad, CA | S006100 | gelatin-based coating material |
| Coating Matrix | Invitrogen, Carlsbad, CA | R011K | Collagen-based coating material |
| TrypLE | Invitrogen, Carlsbad, CA | 12604-013 | A gentle trypsin-like enzyme to dissociate keratinocytes from epidermal sheet |
| 100 μm Cell Strainer Nylon mesh | Corning | 352360 | |
| CCK-8 cell viability Kit | Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD | CK04-11 | |
| Mouse TNF (Mono/Mono) ELISA Set II | BD Biosciences, San Jose, CA | 555268 | |
| Corded Hand-Held UV Lamps | Spectronics, Westbury, NY | EB-280C | |
| 8-watt UV tubes | Spectronics, Westbury, NY | BLE-8T312 | |
| Light Inverted Microscope for cell culture | ZEISS, Jena, Germany | Axio Observer | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | BX41 |
References
- Mauro, T., et al. Acute barrier perturbation abolishes the Ca2+ and K+ gradients in murine epidermis: quantitative measurement using PIXE. J Invest Dermatol. 111 (6), 1198-1201 (1998).
- Menon, G. K., Grayson, S., Elias, P. M. Ionic calcium reservoirs in mammalian epidermis: ultrastructural localization by ion-capture cytochemistry. J Invest Dermatol. 84 (6), 508-512 (1985).
- Elias, P. M., et al. Formation of the epidermal calcium gradient coincides with key milestones of barrier ontogenesis in the rodent. J Invest Dermatol. 110 (4), 399-404 (1998).
- Hennings, H., et al. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture. Cell. 19 (1), 245-254 (1980).
- Zhang, L. J., Bhattacharya, S., Leid, M., Ganguli-Indra, G., Indra, A. K. Ctip2 is a dynamic regulator of epidermal proliferation and differentiation by integrating EGFR and Notch signaling. J Cell Sci. 125 (Pt 23), 5733-5744 (2012).
- Lai, Y. P., et al. Commensal bacteria regulate Toll-like receptor 3-dependent inflammation after skin injury. Nat Med. 15 (12), 1377-1382 (2009).
- Bernard, J. J., et al. Ultraviolet radiation damages self noncoding RNA and is detected by TLR3. Nat Med. 18 (8), (2012).
- Zhang, L. J., et al. Antimicrobial Peptide LL37 and MAVS Signaling Drive Interferon-beta Production by Epidermal Keratinocytes during Skin Injury. Immunity. 45 (1), 119-130 (2016).
- Borkowski, A. W., et al. Toll-Like Receptor 3 Activation Is Required for Normal Skin Barrier Repair Following UV Damage. J Invest Dermatol. 135 (2), 569-578 (2015).
- Borkowski, A. W., et al. Toll-like receptor 3 activation is required for normal skin barrier repair following UV damage. J Invest Dermatol. 135 (2), 569-578 (2015).
- Zillessen, P., et al. Metabolic role of dipeptidyl peptidase 4 (DPP4) in primary human (pre)adipocytes. Sci Rep. 6, 23074 (2016).
- Wells, C. A., et al. The macrophage-inducible C-type lectin, mincle, is an essential component of the innate immune response to Candida albicans. J Immunol. 180 (11), 7404-7413 (2008).
- Vasioukhin, V., Bauer, C., Yin, M., Fuchs, E. Directed actin polymerization is the driving force for epithelial cell-cell adhesion. Cell. 100 (2), 209-219 (2000).
- Zhuang, L., et al. TNF receptor p55 plays a pivotal role in murine keratinocyte apoptosis induced by ultraviolet B irradiation. J Immunol. 162 (3), 1440-1447 (1999).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nat Protoc. 3 (5), 799-810 (2008).
- Dlugosz, A. A., Glick, A. B., Tennenbaum, T., Weinberg, W. C., Yuspa, S. H. Isolation and utilization of epidermal keratinocytes for oncogene research. Methods Enzymol. 254, 3-20 (1995).
- Jones, J. C. Isolation and culture of mouse keratinocytes. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Pirrone, A., Hager, B., Fleckman, P. Primary mouse keratinocyte culture. Methods Mol Biol. 289, 3-14 (2005).
- Yuspa, S. H., Kilkenny, A. E., Steinert, P. M., Roop, D. R. Expression of murine epidermal differentiation markers is tightly regulated by restricted extracellular calcium concentrations in vitro. J Cell Biol. 109 (3), 1207-1217 (1989).
- Yuspa, S. H., et al. Signal transduction for proliferation and differentiation in keratinocytes. Ann N Y Acad Sci. 548, 191-196 (1988).
- Fang, N. X., et al. Calcium enhances mouse keratinocyte differentiation in vitro to differentially regulate expression of papillomavirus authentic and codon modified L1 genes. Virology. 365 (1), 187-197 (2007).
- Kolly, C., Suter, M. M., Muller, E. J. Proliferation, cell cycle exit, and onset of terminal differentiation in cultured keratinocytes: pre-programmed pathways in control of C-Myc and Notch1 prevail over extracellular calcium signals. J Invest Dermatol. 124 (5), 1014-1025 (2005).
- Marcelo, C. L., Gold, R. C., Fairley, J. A. Effect of 1.2 mmol/l calcium, triamcinolone acetonide, and retinoids on low-calcium regulated keratinocyte differentiation. Br J Dermatol. 111, Suppl 27. 64-72 (1984).
