Imagerie en direct de la souris Fusion de palais secondaire

Summary

Ici, nous présentons un protocole pour l'imagerie en direct de la fusion palatine secondaire de souris à l'aide d'une microscopie confocale. Ce protocole peut être utilisé en combinaison avec une variété de lignes de souris rapporteurs fluorescentes et avec des inhibiteurs de voie pour une vision mécaniste. Ce protocole peut être adapté pour l'imagerie en direct dans d'autres systèmes de développement.

Abstract

La fusion des étagères palatines secondaires pour former le palais secondaire intact est un processus clé dans le développement de mammifères et sa perturbation peut conduire à une fente de palais secondaire, une anomalie congénitale commune chez l'homme. La fusion du palais secondaire a été largement étudiée, ce qui a mené à plusieurs mécanismes cellulaires proposés qui peuvent servir de médiation à ce processus. Cependant, ces études ont été principalement réalisées sur des tissus embryonnaires fixes à des points de temps progressifs pendant le développement ou dans des cultures d'explants fixes analysées à des points de temps statiques. L'analyse statique est limitée pour l'analyse des processus morphogénétiques dynamiques, telle que la fusion palatine et les types de comportements cellulaires dynamiques médiates de la fusion palatine est incomplètement comprise. Nous décrivons ici un protocole pour l'imagerie en direct de la fusion de palais secondaire ex vivo dans des embryons de souris. Pour examiner les comportements cellulaires de la fusion palatine, la Kératin14 -cre spécifique à l' épithélium a été utilisée pour étiqueter les cellules épithéliales du palais dans ROSA26-mTmG ^flox reporter des embryons. Pour visualiser l'actine filamenteuse, des souris journalistes Lifeact-mRFPruby ont été utilisées. L'imagerie en direct de la fusion palatine secondaire a été réalisée en disséquant des étagères palatins secondaires récemment adhérentes d'embryons de stade embryonnaire (E) 14,5 et de culture dans des milieux contenant de l'agarose sur un plat de verre pour permettre l'imagerie avec un microscope confocal inversé. En utilisant cette méthode, nous avons détecté une variété de nouveaux comportements cellulaires lors de la fusion palatine secondaire. Une appréciation de la façon dont les comportements cellulaires distincts sont coordonnés dans l'espace et le temps contribue grandement à notre compréhension de ce processus morphogénétique dynamique. Ce protocole peut être appliqué à des lignées de souris mutantes ou à des cultures traitées avec des inhibiteurs pharmacologiques afin de mieux comprendre la façon dont la fusion palatine secondaire est contrôlée.

Introduction

La fusion tissulaire est une étape importante dans le développement d'organes multiples. Les principaux défauts de naissance humains tels que la fente de la lèvre et du palais, la spina bifida et les malformations du cœur peuvent résulter de défauts de fusion tissulaire ¹ . La fusion secondaire du palais de la souris a été largement étudiée pour identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires contrôlant la fusion tissulaire dans le développement ^{2 , 3 , 4} . À la souris, le développement secondaire du palais commence à environ E11.5 avec la décroissance d'une étagère palatine secondaire de chacun des processus maxillaires bilatéraux. La croissance initiale des étagères palatines se produit verticalement le long de la langue, jusqu'à environ E14.0, date à laquelle les étagères palatines sont élevées horizontalement au-dessus de la langue. La croissance axée sur la médiation entraîne un contact physique entre l'épithélium des deux étagères palatines, formant l'épithélium de la ligne médianeAl seam (MES) à E14.5. Les MES intermédiaires doivent être éliminés entre les étagères palatines secondaires pour permettre la confluence mésenchymateuse et le développement d'un palais secondaire intact, complètement fusionné par E15.5 ³ .

La façon dont une couche cellulaire MES épithéliale partagée est formée entre deux étagères palatines distinctes, puis retirée pour atteindre la confluence mésenchymateuse, a été une question centrale dans le développement du palais. Sur la base d'études de microscopie histologique et électronique à la souris (EM), d'études de culture d'explants et d'expériences génétiques de génétique de souris, plusieurs comportements cellulaires fondamentaux ont été impliqués dans ce processus. Les projections semblables à celles de Filopodia provenant de l'épithélium de bord médian MEE de chaque étagère palatine facilitent le contact initial ^{5 , 6} , suivie de l'intercalation de ces cellules épithéliales à un MES ^{6 , 7} partagé. Suppression du MES partagé résultantA été proposé de procéder par trois mécanismes non exclusifs. Les premières études utilisant l'observation histologique et le traçage de lignage ex vivo avec des colorants vitaux ont indiqué que le MES pourrait être éliminé par la transition épithéliale à la mésenchyme (EMT) des cellules MES ^{8 , 9} , bien que plus récemment, le traçage génétique des cellules épithéliales avait soulevé une incertitude quant à La contribution à long terme des cellules épithéliales au mésenchyme palatins ^{10 , 11 , 12} . Un nombre important de cellules apoptotiques et une réduction de leur nombre dans certains mutants qui ne subissent pas une fusion appropriée du palais ont conduit à l'idée que l'apoptose peut être un facteur majeur de dissolution MES ^{2 , 3} . Enfin, basé initialement sur des études portant sur l'étiquetage épithélial et l'observation statique à des points de temps progressifs, les cellules MESOnt été proposés pour migrer dans les dimensions oronasales et antéro-postérieures ^{11 , 13} , mais ces comportements cellulaires dynamiques étaient initialement non confirmés en raison d'une incapacité à les observer dans le tissu palatal vivant. Récemment, nous avons pu observer directement ces comportements en développant une nouvelle méthodologie d'imagerie en direct qui combine les méthodes génétiques de souris du marquage fluorescent avec l'imagerie radiale confocale des étagères palatines explantées.

Tout d'abord, pour visualiser les comportements cellulaires dynamiques dans les cellules épithéliales du palais lors de la fusion palatine, nous avons généré une souris journalière épithéliale spécifique en traversant des souris ROSA26-mTmG ^flox avec des souris Keratin14-cre ^{14 , 15} . L'imagerie confocale en direct de la culture d'explants de palais des embryons résultants a confirmé certains comportements cellulaires précédemment proposés et identifié des événements nouveaux dans le processus de fusion ⁶ </Sup>. Les protubérances de la membrane cellulaire épithéliale ont précédé le contact cellulaire initial et la convergence épithéliale par intercalation cellulaire et déplacement de cellules oronasales. Notamment, nous avons également découvert que l'extrusion cellulaire, un processus signalé pour jouer un rôle important dans l'homéostasie épithéliale, était un mécanisme majeur qui conduisait la fusion du palais secondaire à la souris ^{6 , 16} . Cette méthode d'imagerie peut être utilisée avec d'autres lignes de journalistes; Nous avons utilisé des souris transgéniques Lifeact-mRFPruby ^{17 , 18} pour examiner la dynamique du cytosquelette de l'actine pendant le processus de fusion. D'autres reporters peuvent également être utilisés pour observer d'autres aspects spécifiques de la fusion du palais, et cette méthode peut être adaptée soit à la microscopie confocale à balayage laser, soit à la microscopie confocale, selon les besoins d'imagerie et la disponibilité du microscope. L'imagerie en direct devient de plus en plus une approche clé dans la biologie du développement. PartiEn particulier, la morphogenèse craniofaciale est complexe et les anomalies congénitales humaines qui affectent le visage sont fréquentes. Cette méthode d'imagerie en direct confocal aidera à mieux comprendre les mécanismes fondamentaux de développement de base ainsi que les origines des anomalies craniofaciales humaines.

Protocol

Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées conformément aux protocoles de l'Université de Californie au Comité de soins et d'utilisation des animaux institutionnels de San Francisco. 1. Préparation des supports d'imagerie en direct Préparation de milieux de culture liquide Ajouter 20% de sérum bovin fœtal (FBS), 2 mM de L-glutamine, 100 U / mL de pénicilline, 100 μg / mL de streptomycine, 200 μg / mL d'acide L-…

Representative Results

L'imagerie vivante de la culture d'explants de palais a révélé de multiples processus cellulaires médiant la fusion du palais 6 . Les contacts initiaux entre deux cellules épithéliales sont réalisés par protrusion membranaire ( figure 2 B-2E ). Lorsque deux couches épithéliales se rencontrent, elles forment une MES multicouches multicouches suivie d'une intercalation pour réaliser une MES intég…

Discussion

L'imagerie en direct de la morphogenèse des tissus avec la culture d'explants organiques en 3D peut fournir des informations détaillées concernant les processus cellulaires qui ne peuvent pas être démontrés dans l'analyse de coloration conventionnelle des coupes de tissus fixes. En utilisant la culture d'explants in vitro du palais secondaire embryonnaire de souris, nous avons observé plusieurs comportements cellulaires intéressants qui nous conduisent à proposer un nouveau mé…

Materials

Reagents
DMEM/F12	Life technology	11330-032
Fetal Bovine Serum	Life technology	16000-044
L-glutamine	Life technology	25030-081
L-Ascorbic acid	Sigma	A4544-100G
Pennicillin/Streptomycin	Life technology	15140-122
Low melting agarose	BioExpress	E-3111-125
35mm glass bottom dish	MatTek	P35G-1.5-10-C
Petrolieum Jelly (Vaseline)	Sigma	16415-1Kg
Mice
Keratin14-cre		MGI: J:65294	Allele = Tg(KRT14-cre)1Amc
ROSA26mTmG		MGI: J:124702	Allele = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo
Lifeact-mRFPruby		MGI: J:164274	Allele = Tg(CAG-mRuby)#Rows
Microscope
White Light SP5 confocal microscope	Leica Microsystems
Cell Observer spinning disk confocal microscope	Zeiss Microscopy