Imágenes en vivo de la fusión secundaria del paladar del ratón
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para la imagen en vivo de la fusión del paladar secundario de ratón mediante microscopía confocal. Este protocolo puede usarse en combinación con una variedad de líneas de ratón fluorescentes de reportero, y con inhibidores de vía para una visión mecánica. Este protocolo puede ser adaptado para imágenes en vivo en otros sistemas de desarrollo.
Abstract
La fusión de los estantes palatales secundarios para formar el paladar secundario intacto es un proceso clave en el desarrollo de los mamíferos y su alteración puede conducir a la hendidura del paladar secundario, una anomalía congénita común en los seres humanos. La fusión del paladar secundario ha sido ampliamente estudiada conduciendo a varios mecanismos celulares propuestos que pueden mediar en este proceso. Sin embargo, estos estudios se han realizado principalmente en tejidos embrionarios fijos en puntos de tiempo progresivos durante el desarrollo o en cultivos de explantes fijos analizados en puntos de tiempo estáticos. El análisis estático es limitado para el análisis de los procesos morfogenéticos dinámicos tales como una fusión del paladar y qué tipos de comportamientos celulares dinámicos median en la fusión palatal se entiende incompletamente. Aquí se describe un protocolo para la imagen en vivo de fusión de paladar secundario ex vivo en embriones de ratón. Para examinar los comportamientos celulares de la fusión del paladar, Keratin14 -cre específico epitelial se utilizó para etiquetar las células epiteliales del paladar en ROSEmbriones reporter flox A26-mTmG. Para visualizar la actina filamentosa, se utilizaron ratones reporteros Lifeact-mRFPruby . La imagen en vivo de la fusión del paladar secundario se realizó mediante la disección de estanterías palatales secundarias recientemente adheridas de embriones embrionarios de día (E) 14.5 y el cultivo en medios que contenían agarosa en un plato inferior de vidrio para permitir la formación de imágenes con un microscopio confocal invertido. Usando este método, hemos detectado una variedad de nuevos comportamientos celulares durante la fusión palatina secundaria. Una apreciación de cómo distintos comportamientos celulares se coordinan en el espacio y el tiempo contribuye en gran medida a nuestra comprensión de este proceso dinámico morfogenético. Este protocolo se puede aplicar a líneas de ratones mutantes, o cultivos tratados con inhibidores farmacológicos para avanzar en la comprensión de cómo se controla la fusión de paladar secundaria.
Introduction
La fusión de tejidos es un paso importante en el desarrollo de múltiples órganos. Los principales defectos de nacimiento humanos, tales como labio leporino y paladar hendido, espina bífida y malformaciones del corazón pueden ser resultado de defectos en la fusión de tejidos 1 . La fusión del paladar secundario del ratón ha sido ampliamente estudiada para identificar los mecanismos celulares y moleculares que controlan la fusión de tejidos en el desarrollo 2 , 3 , 4 . En el ratón, el desarrollo del paladar secundario comienza alrededor de E11.5 con el crecimiento de un estante palatino secundario de cada uno de los procesos maxilares bilaterales. El crecimiento inicial de los estantes palatales se produce verticalmente a lo largo de la lengua, hasta aproximadamente E14.0, momento en el cual los estantes palatales se elevan horizontalmente por encima de la lengua. El crecimiento medialmente dirigido da como resultado el contacto físico entre los epitelios de las dos estanterías palatinas, formando el epitelio de la línea mediaAl costura (MES) en E14.5. El MES intermedio debe ser removido de entre los estantes palatales secundarios para permitir la confluencia mesenquimal y el desarrollo de un paladar secundario intacto, completamente fusionado por E15.5 3 .
La forma en que se forma una capa epitelial compartida de células MES entre dos estantes palatales separados, y luego se eliminan para lograr la confluencia mesenquimal, ha sido una cuestión central en el desarrollo del paladar. Basado en estudios histológicos y de microscopía electrónica de ratón (EM), estudios de cultivos de explantes y experimentos genéticos de ratón, varios comportamientos celulares fundamentales han sido implicados en este proceso. Las proyecciones de tipo filopodia del epitelio del borde mediano MEE de cada estante palatino facilitan el contacto inicial 5 , 6 , seguido de la intercalación de estas células epiteliales a una MES única compartida 6 , 7 . Eliminación de la MES compartida resultanteHa sido propuesto para proceder por tres mecanismos no exclusivos. Los primeros estudios que emplean observación histológica y ex vivo linaje rastreo con colorantes vitales indicaron que las MES pueden ser removidos por transición epitelial a mesenquimal (EMT) de células MES 8, 9, aunque más recientemente, genética rastreo de linaje de las células epiteliales ha planteado incertidumbre en cuanto a La contribución a largo plazo de las células epiteliales al mesénquima del estante palatal 10 , 11 , 12 . Un número significativo de células apoptóticas, y una reducción en su número en algunos mutantes que no se someten a la fusión adecuada paladar ha llevado a la idea de que la apoptosis puede ser un importante conductor de MES disolución [ 2 , 3] . Finalmente, basándose inicialmente en estudios con etiquetado epitelial y observación estática en puntos de tiempo progresivos, las células MESSe propusieron migrar en las dimensiones oronasal y anteroposterior 11 , 13 , pero estos comportamientos celulares dinámicos fueron inicialmente no confirmados debido a la incapacidad de observarlos en tejido palatino vivo. Recientemente, hemos sido capaces de observar directamente estos comportamientos mediante el desarrollo de una nueva metodología de imagen en vivo que combina los métodos genéticos de ratón de marcado fluorescente con confocal imágenes en vivo de estantes palatales explantados.
Primero, para visualizar los comportamientos celulares dinámicos en las células epiteliales del paladar durante la fusión del paladar, se generó un ratón reportero epitelial específico cruzando ROSA26- mTmG ratones flox con ratones Keratin14-cre 14 , 15 . Confocal imágenes en vivo del cultivo de explante paladar de los embriones resultantes confirmó algunos propuesto anteriormente los comportamientos celulares e identificaron nuevos eventos en el proceso de fusión 6 </Sup Las protrusiones de la membrana de las células epiteliales precedieron al contacto inicial célula-célula, seguido por la convergencia epitelial por intercalación celular y desplazamiento celular oronasal. En particular, también descubrió que la extrusión celular, un proceso que se informó que desempeñan un papel importante en la homeostasis epitelial, fue un importante mecanismo de conducción del ratón paladar secundario fusión 6 , 16 . Este método de formación de imágenes se puede usar con otras líneas de reportero; Utilizamos Lifeact-mRFPruby ratones transgénicos 17 , 18 para examinar la dinámica del citoesqueleto actina durante el proceso de fusión. También se pueden emplear otros reporteros para observar otros aspectos específicos de la fusión del paladar y este método puede adaptarse a microscopía confocal de barrido láser o microscopía confocal de disco giratorio, dependiendo de las necesidades de formación de imágenes y de la disponibilidad del microscopio. La imagen en vivo se está convirtiendo cada vez más en un enfoque clave en la biología del desarrollo. PartiCularmente, la morfogénesis craneofacial es compleja y los defectos congénitos humanos que afectan la cara son comunes. Este método confocal de imágenes en vivo ayudará a permitir una mejor comprensión de los mecanismos básicos de desarrollo subyacentes, así como los orígenes de las anomalías craneofaciales humanas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Imágenes en vivo de la morfogénesis del tejido con el cultivo de explante de órganos 3D puede proporcionar información detallada sobre los procesos celulares que no se puede mostrar en el análisis de tinción convencional de secciones de tejido fijo. Utilizando cultivo de explantes in vitro de paladar secundario embrionario de ratón, se observaron varios comportamientos celulares interesantes que nos llevaron a proponer un nuevo mecanismo de fusión del paladar que implica la convergencia epitelial y la e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias al Sr. Douglas Benson para las conversaciones iniciales con respecto a la imagen secundaria del paladar. También reconocemos a David Castaneda-Castellanos (Leica) y Chris Rieken (Zeiss) por su ayuda para ajustar las condiciones de imagen en microscopía confocal. Agradecemos a Lynsey Hamilton (Bitplane) por sugerencias útiles para el análisis cuantitativo de imágenes usando el software Imaris. Este trabajo fue financiado por NIH / NIDCR R01 DE025887.
Materials
| Reagents | |||
| DMEM/F12 | Life technology | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum | Life technology | 16000-044 | |
| L-glutamine | Life technology | 25030-081 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A4544-100G | |
| Pennicillin/Streptomycin | Life technology | 15140-122 | |
| Low melting agarose | BioExpress | E-3111-125 | |
| 35mm glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Petrolieum Jelly (Vaseline) | Sigma | 16415-1Kg | |
| Mice | |||
| Keratin14-cre | MGI: J:65294 | Allele = Tg(KRT14-cre)1Amc | |
| ROSA26mTmG | MGI: J:124702 | Allele = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo | |
| Lifeact-mRFPruby | MGI: J:164274 | Allele = Tg(CAG-mRuby)#Rows | |
| Microscope | |||
| White Light SP5 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Cell Observer spinning disk confocal microscope | Zeiss Microscopy |
References
- Ray, H. J., Niswander, L. Mechanisms of tissue fusion during development. Dev. Camb. Engl. 139, 1701-1711 (2012).
- Dudas, M., Li, W. -. Y., Kim, J., Yang, A., Kaartinen, V. Palatal fusion – where do the midline cells go? A review on cleft palate, a major human birth defect. Acta Histochem. 109, 1-14 (2007).
- Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139, 231-243 (2012).
- Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. Cellular and Molecular Mechanisms of Palatogenesis. Curr Top Dev Biol. 115, 59-84 (2015).
- Taya, Y., O’Kane, S., Ferguson, M. W. Pathogenesis of cleft palate in TGF-b3 knockout mice. Development. 126, 3869-3879 (1999).
- Kim, S., et al. Convergence and Extrusion Are Required for Normal Fusion of the Mammalian Secondary Palate. PLOS Biol. 13, 100122 (2015).
- Yoshida, M., et al. Periderm cells covering palatal shelves have tight junctions and their desquamation reduces the polarity of palatal shelf epithelial cells in palatogenesis. Genes Cells. 17, 455-472 (2012).
- Fitchett, J., Hay, E. Medial edge epithelium transforms to mesenchyme after embryonic palatal shelves fuse. Dev. Biol. 131, 455-474 (1989).
- Akira, N., et al. The expression of TGF-beta3 for epithelial-mesenchyme transdifferentiated MEE in palatogenesis. J Mol Hist. 41, 343-355 (2010).
- Sani, F. V., et al. Fate-mapping of the epithelial seam during palatal fusion rules out epithelial-mesenchymal transformation. Dev. Biol. 285, 490-495 (2005).
- Jin, J. -. Z., Ding, J. Analysis of cell migration, transdifferentiation and apoptosis during mouse secondary palate fusion. Development. 133, 3341-3347 (2006).
- Xu, X., et al. Cell autonomous requirement for Tgfbr2 in the disappearance of medial edge epithelium during palatal fusion. Dev. Biol. 297, 238-248 (2006).
- Carette, M. J., Ferguson, M. W. The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro: an analysis by Dil labelling and confocal microscopy. Development. 114, 379-388 (1992).
- Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Dassule, H., Lewis, P., Bei, M., Mass, R., McMahon, A. Sonic hedgehog regulates growth and morphogenesis of the tooth. Development. 127, 4775-4785 (2000).
- Eisenhoffer, G., et al. Crowding induces live cell extrusion to maintain homeostatic cell numbers in epithelia. Nature. 484, 501-546 (2012).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5, 605-607 (2008).
- Riedl, J., et al. Lifeact mice for studying F-actin dynamics. Nat Methods. 7, 168-169 (2010).
- Can, A., et al. Attenuation correction in confocal laser microscopes: a novel two-view approach. J Microsc. 211, (2003).
- Veenman, C., Reinders, M., Backer, E. Resolving motion correspondence for densely moving points. IEEE Trans Pattern Anal Mach Intell. 23, 54-72 (2001).
- Udan, R., Piazza, V., Hsu, C., Hadjantonakis, A., Dickinson, M. Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy. Development. 141, 4406-4414 (2014).
- Stoller, J., et al. Cre reporter mouse expressing a nuclear localized fusion of GFP and beta-galactosidase reveals new derivatives of Pax3-expressing precursors. Genesis. 46, 200-204 (2008).
