マウス二次口蓋融合のライブイメージング
Summary
ここでは、共焦点顕微鏡法を用いたマウス二次口蓋融合のライブイメージングのためのプロトコールを提示する。このプロトコールは、様々な蛍光レポーターマウス系統と、および機械的洞察のための経路阻害剤と組み合わせて使用することができる。このプロトコールは、他の発生系におけるライブイメージングに適合させることができる。
Abstract
2次口蓋棚を融合させて2次口蓋を形成することは、哺乳類の発達における重要なプロセスであり、その破壊は、ヒトにおける共通の先天性異常である口蓋裂につながる可能性がある。二次口蓋融合は、このプロセスを仲介するいくつかの提案された細胞機構に至るまで広範に研究されている。しかし、これらの研究は、発達中の漸進的時点または静的時点で分析された固定外植体培養において、固定胚組織で主に行われてきた。静的解析は、口蓋の融合などの動的な形態形成過程の分析に限られており、どのタイプの動的細胞行動が口蓋の融合を媒介するかについては不完全に理解されている。ここでは、マウス胚におけるex vivo二次口蓋融合のライブイメージングのプロトコールについて説明します。口蓋の融合の細胞挙動を調べるために、上皮特異的なケラチン 14-クレアを用いて、 ROSの口蓋上皮細胞を標識したA26-mTmG floxレポーター胚。糸状アクチンを視覚化するために、 Lifeact-mRFPrubyレポーターマウスを使用した。二次口蓋融合のライブイメージングは、胚の日（E）14.5ステージ胚の最近接着した二次口蓋棚を解剖し、ガラス皿にアガロース含有培地で培養して倒立共焦点顕微鏡で画像化することにより行った。この方法を用いて、二次口蓋融合時に様々な新規細胞行動を検出した。空間的および時間的に明確な細胞の挙動がどのように調整されるかを理解することは、この動的形態形成過程の理解に大きく寄与する。このプロトコールは、突然変異マウス系統、または薬理学的阻害剤で処理した培養物に適用して、二次性口蓋融合がどのように制御されるかの理解をさらに進めることができる。
Introduction
組織融合は、複数の臓器の発達において重要なステップです。口唇および口蓋の裂け目、脊髄二分脊椎および心臓の奇形などの主要なヒトの先天性欠損は、組織融合の欠陥1に起因し得る。マウス二次口蓋融合は、広範囲の開発2、3、4、組織融合を制御する細胞および分子機構を同定するために検討されています。マウスでは、二次性口蓋の発達は、E11.5付近で始まり、両側の上顎プロセスのそれぞれから二次口蓋棚の成育を開始する。口蓋棚の初期成長は、舌に沿って垂直方向に約E14.0まで起こり、その時点で口蓋は舌の上で水平に上昇する。内向きの成長は、2つの口蓋棚の上皮間の物理的接触をもたらし、正中線上皮を形成するE14.5でのal seam（MES）。間葉の合流を可能にするために、介入MESを二次口蓋棚の間から除去し、完全な融合した2次口蓋の発達をE15.5 3で行わなければならない。
共培養上皮MES細胞層が2つの別々の口蓋棚の間でどのように形成され、次に間葉の密集を達成するために除去されたかは、口蓋裂進展における中心的な問題であった。マウスの組織学的および電子顕微鏡（EM）研究、外植体培養研究、および機能的なマウス遺伝学的実験に基づいて、いくつかの基本的な細胞挙動がこの過程に関与している。各口蓋棚の内側縁上皮MEEから糸状仮足状突起は、共有単MES 6,7にこれらの上皮細胞のインターカレーションに続く最初の接点5,6を容易にします。結果として得られる共用MESの除去3つの非排他的メカニズムによって進展することが提案されている。組織学的観察およびバイタル染料でトレースエクスビボ系統を用いた初期の研究は、MESは、MES細胞の間葉移行（EMT）に上皮によって除去される可能性があります8、9、しかしより最近、上皮細胞の遺伝系統のトレースがに関して不確実性を上げたことを示し口蓋棚間葉10、11、12への上皮細胞の長期的な貢献。重要なアポトーシス細胞の数、および適切な口蓋融合を受けることができないいくつかの変異体ではその数の減少は、アポトーシスがMESの溶解2、3の主要なドライバーになるかもしれないという考えにつながっています。最後に、進行性の時点での上皮標識および静的観察を含む研究に最初から基づいて、MES細胞13、口鼻及び前後寸法11に移行することを提案するが、このような動的な細胞の振る舞いが原因ライブ口蓋組織でそれらを観察することができないため、最初は未確認でした。最近、我々は、蛍光標識のマウス遺伝的方法と外植片の棚の共焦点ライブイメージングを組み合わせた新しいライブイメージング方法論を開発することによって、これらの挙動を直接観察することができた。
まず、口蓋融合中口蓋上皮細胞における動的細胞挙動を視覚化するために、我々はKeratin14-CREマウス14、15とROSA26-mTmG FLOXマウスを交配することによって、上皮特異的レポーターマウスを生成しました。得られた胚の口蓋外植片培養の共焦点ライブイメージングは、以前に提案されたいくつかの細胞挙動を確認し、融合プロセス6における新規事象を同定した</。上皮細胞膜突出は、最初の細胞 – 細胞接触に先行し、続いて細胞の層間挿入および口腔内細胞の置換によって上皮収束に至った。注目すべきことに、我々はまた、その細胞押し出し、上皮恒常性に重要な役割を果たしていると報告プロセスを発見し、マウス二次口蓋融合6、16を駆動する主要なメカニズムでした。このイメージング方法は、他のレポーターラインでも使用できます。我々は、融合プロセス中のアクチン細胞骨格の動態を調べるためにLifeact-mRFPrubyトランスジェニックマウス17、18を利用しました。他のレポーターもまた口蓋融合の他の特定の局面を観察するために使用することができ、この方法はイメージングの必要性および顕微鏡の利用可能性に応じてレーザー走査共焦点顕微鏡またはスピニングディスク共焦点顕微鏡に適合させることができる。ライブイメージングは、発達生物学において重要なアプローチとなりつつあります。 Parti白内障、頭蓋顔面の形態形成は複雑であり、顔に影響を与えるヒトの先天性欠損が一般的である。この共焦点ライブイメージング法は、ヒトの頭蓋顔面異常の起源だけでなく、基本的な発達メカニズムの基礎知識の改善を可能にする。
Protocol
Representative Results
Discussion
3D臓器外植片培養による組織形態形成のライブイメージングは、固定組織切片の従来の染色分析では示されない細胞プロセスに関する詳細な情報を提供することができる。マウス胚性二次口蓋のin vitro外植体培養を用いて、上皮収束および細胞押し出しを含む新規な口蓋融合機構を提案するいくつかの興味深い細胞挙動を観察した。
このタイプの研究における…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は二次口蓋イメージングに関する最初の会話のためのダグラス・ベンソン博士に感謝します。また、共焦点顕微鏡法で撮像条件を調整する助けとなるDavid Castaneda-Castellanos（Leica）とChris Rieken（Zeiss）も認めています。 Imarisソフトウェアを使用した定量的画像解析の参考になるLynsey Hamilton（Bitplane）に感謝します。この研究は、NIH / NIDCR R01 DE025887によって資金提供された。
Materials
| Reagents | |||
| DMEM/F12 | Life technology | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum | Life technology | 16000-044 | |
| L-glutamine | Life technology | 25030-081 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A4544-100G | |
| Pennicillin/Streptomycin | Life technology | 15140-122 | |
| Low melting agarose | BioExpress | E-3111-125 | |
| 35mm glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Petrolieum Jelly (Vaseline) | Sigma | 16415-1Kg | |
| Mice | |||
| Keratin14-cre | MGI: J:65294 | Allele = Tg(KRT14-cre)1Amc | |
| ROSA26mTmG | MGI: J:124702 | Allele = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo | |
| Lifeact-mRFPruby | MGI: J:164274 | Allele = Tg(CAG-mRuby)#Rows | |
| Microscope | |||
| White Light SP5 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Cell Observer spinning disk confocal microscope | Zeiss Microscopy |
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