Live Imaging der Maus Sekundärer Gaumen Fusion
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Live-Bildgebung der Maus-Sekundär-Gaumen-Fusion mit konfokaler Mikroskopie. Dieses Protokoll kann in Kombination mit einer Vielzahl von fluoreszierenden Reporter-Maus-Linien und mit Pfad-Inhibitoren für mechanistische Einsicht verwendet werden. Dieses Protokoll kann für die Live-Bildgebung in anderen Entwicklungssystemen angepasst werden.
Abstract
Die Verschmelzung der sekundären palatinalen Regale zur Bildung des intakten sekundären Gaumens ist ein wichtiger Prozess in der Entwicklung von Säugetieren und ihre Störung kann zu Spalten-Sekundärgaumen führen, eine gemeinsame angeborene Anomalie beim Menschen. Sekundäre Gaumenfusion wurde ausführlich untersucht, was zu mehreren vorgeschlagenen zellulären Mechanismen führte, die diesen Prozess vermitteln können. Diese Studien wurden jedoch meistens an festen embryonalen Geweben zu fortschreitenden Zeitpunkten während der Entwicklung oder in festen explantierten Kulturen durchgeführt, die zu statischen Zeitpunkten analysiert wurden. Die statische Analyse ist für die Analyse von dynamischen morphogenetischen Prozessen wie eine Gaumenfusion begrenzt und welche Arten von dynamischen zellulären Verhaltensweisen die palatale Fusion vermitteln, ist unvollständig verstanden. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Live-Bildgebung der ex vivo sekundären Gaumenfusion bei Mausembryonen. Um zelluläre Verhaltensweisen der Gaumenfusion zu untersuchen, wurde epithelspezifisches Keratin14 -cre verwendet, um Gaumenepithelzellen in ROS zu etikettierenA26-mTmG- Flox- Reporter-Embryonen Um das filamentöse Actin zu visualisieren, wurden Lifeact-mRFPruby- Reporter-Mäuse verwendet. Die lebendige Bildgebung der sekundären Gaumenfusion erfolgte durch Sezieren von kürzlich adhärierten sekundären palatinalen Regalen von embryonalen Tag (E) 14,5-stufigen Embryonen und Kultivieren in agarosehaltigen Medien auf einer Glasbodenschale, um die Bildgebung mit einem umgekehrten konfokalen Mikroskop zu ermöglichen. Mit dieser Methode haben wir eine Vielzahl von neuartigen Zellverhalten während der sekundären Gaumenfusion nachgewiesen. Eine Anerkennung dessen, wie unterschiedliche Zellverhalten in Raum und Zeit koordiniert sind, trägt wesentlich zu unserem Verständnis dieses dynamischen morphogenetischen Prozesses bei. Dieses Protokoll kann auf mutierte Mauslinien angewendet werden, oder Kulturen, die mit pharmakologischen Inhibitoren behandelt werden, um das Verständnis darüber zu fördern, wie die Sekundärspalter-Fusion kontrolliert wird.
Introduction
Tissue Fusion ist ein wichtiger Schritt in der Entwicklung von mehreren Organen. Wichtige menschliche Geburtsfehler wie Spaltlippe und Gaumen, Spina bifida und Missbildungen des Herzens können aus Defekten der Gewebefusion resultieren 1 . Maus-Sekundär-Gaumen-Fusion wurde intensiv untersucht, um die zellulären und molekularen Mechanismen zu identifizieren, die die Gewebefusion in der Entwicklung 2 , 3 , 4 kontrollieren. In der Maus beginnt die sekundäre Gaumenentwicklung um etwa E11.5 mit dem Auswachsen eines sekundären palatinalen Regals aus jedem der bilateralen Oberkieferprozesse. Das anfängliche Wachstum der Gaumenböden erfolgt senkrecht entlang der Zunge, bis etwa E14.0, zu welcher Zeit die Gaumenböden waagerecht über die Zunge hoch werden. Das medial gerichtete Wachstum führt zu einem physischen Kontakt zwischen den applizierten Epithelien der beiden palatinalen Regale und bildet die Mittellinie epitheliAl Naht (MES) bei E14.5. Die dazwischen MES müssen zwischen den sekundären palatal Regalen entfernt werden mesenchymale Konfluenz zu ermöglichen , und die Entwicklung eines intakten, vollständig verschmolzen Sekundär Gaumen durch E15.5 3.
Wie eine gemeinsame epitheliale MES-Zellschicht zwischen zwei getrennten Gaumenböden gebildet und dann entfernt wurde, um mesenchymale Konfluenz zu erreichen, war eine zentrale Frage in der Gaumenentwicklung. Basierend auf Maus-Histologie- und Elektronenmikroskopie (EM) -Studien, explantischen Kulturstudien und funktionellen Mausgenetik-Experimenten wurden in diesem Prozess mehrere grundlegende Zellverhalten verwickelt. Filopodienähnliche Projektionen aus dem medialen Randepithel MEE jedes palatinalen Regals erleichtern den Anfangskontakt 5 , 6 , gefolgt von einer Interkalation dieser Epithelzellen zu einer gemeinsamen MES 6 , 7 . Beseitigung der resultierenden gemeinsamen MESWurde vorgeschlagen, um durch drei nicht-exklusive Mechanismen vorzugehen. Frühe Studien mit histologischer Beobachtung und ex vivo- Linienverfolgung mit lebenswichtigen Farbstoffen zeigten, dass die MES durch epithelialen bis mesenchymalen Übergang (EMT) der MES-Zellen 8 , 9 entfernt werden könnte , obwohl in jüngster Zeit die genetische Linienverfolgung von Epithelzellen die Unsicherheit erhöht hat Der langfristige Beitrag der Epithelzellen zum Gaumenregal Mesenchym 10 , 11 , 12 . Eine signifikante Anzahl von apoptotischen Zellen und eine Verringerung ihrer Zahl in einigen Mutanten, die einer ordentlichen Gaumenfusion nicht unterliegen, hat zu der Vorstellung geführt, dass Apoptose ein wichtiger Treiber der MES-Auflösung 2 , 3 sein kann . Schließlich basiert zunächst auf Studien mit epithelialer Markierung und statischer Beobachtung zu progressiven Zeitpunkten, MES-ZellenWurden vorgeschlagen, um in den oronasalen und anteroposterioren Dimensionen 11 , 13 zu wandern, aber solche dynamischen Zellverhalten wurden zunächst unbestätigt wegen einer Unfähigkeit, sie in lebendem palatinalem Gewebe zu beobachten. In letzter Zeit konnten wir diese Verhaltensweisen direkt beobachten, indem wir eine neue Live-Imaging-Methodik entwickelten, die mäusegenetische Methoden der fluoreszierenden Markierung mit konfokaler Live-Imaging von explantierten Palastregalen kombiniert.
Zuerst, um dynamische zelluläre Verhaltensweisen in Gaumenepithelzellen während der Gaumenfusion zu visualisieren, erzeugten wir eine epithelspezifische Reportermaus, indem wir ROSA26-mTmG- Flox- Mäuse mit Keratin14-cre- Mäusen 14 , 15 kreuzten . Die konfokale Live-Darstellung der Gaumen-Explantat-Kultur der resultierenden Embryos bestätigte einige zuvor vorgeschlagene zelluläre Verhaltensweisen und identifizierte neuartige Ereignisse im Fusionsprozess 6 </Sup>. Epithelzellmembranvorsprünge gingen dem anfänglichen Zellzellkontakt voraus, gefolgt von einer epithelialen Konvergenz durch Zellinterkalation und oronasale Zellverdrängung. Bemerkenswerterweise haben wir auch entdeckt, dass die Zellextrusion, ein Prozeß, der berichtet wurde, um wichtige Rollen in der epithelialen Homöostase zu spielen, ein wichtiger Mechanismus war, der die Maus sekundäre Gaumenfusion 6 , 16 antrieb. Diese Abbildungsmethode kann mit anderen Reporterlinien verwendet werden; Wir haben Lifeact-mRFPruby- transgene Mäuse 17 , 18 verwendet , um die aktin- zytoskeletale Dynamik während des Fusionsprozesses zu untersuchen. Andere Reporter können auch eingesetzt werden, um andere spezifische Aspekte der Gaumenfusion zu beobachten, und diese Methode kann entweder auf die Laser-Scanning-konfokale Mikroskopie oder die Spinndiskette konfokale Mikroskopie angepasst werden, je nach Abbildungsbedarf und Mikroskopverfügbarkeit. Live-Imaging wird zunehmend zum Keystone-Ansatz in der Entwicklungsbiologie. PartiCulario, kraniofaziale Morphogenese ist komplex und menschliche Geburtsfehler, die das Gesicht beeinflussen, sind üblich. Diese konfokale Live-Imaging-Methode wird dazu beitragen, ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden grundlegenden Entwicklungsmechanismen sowie Ursprünge von menschlichen kraniofazialen Anomalien zu ermöglichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Live-Bildgebung der Gewebemorphogenese mit der 3D-Organ-Explantat-Kultur kann detaillierte Informationen über zelluläre Prozesse liefern, die bei der herkömmlichen Färbeanalyse von festen Gewebeschnitten nicht gezeigt werden können. Unter Verwendung der in vitro explantischen Kultur des embryonalen Sekundärgaumens der Maus beobachteten wir einige interessante zelluläre Verhaltensweisen, die uns dazu führten, einen neuartigen Mechanismus der Gaumenfusion vorzuschlagen, der epitheliale Konvergenz und …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Herrn Douglas Benson für erste Gespräche über die Sekundärgaumenabbildung. Wir bestätigen auch David Castaneda-Castellanos (Leica) und Chris Rieken (Zeiss) für ihre Hilfe, um die bildgebenden Bedingungen in der konfokalen Mikroskopie anzupassen. Wir schätzen Lynsey Hamilton (Bitplane) für hilfreiche Vorschläge für die quantitative Bildanalyse mit Imaris Software. Diese Arbeit wurde von NIH / NIDCR R01 DE025887 finanziert.
Materials
| Reagents | |||
| DMEM/F12 | Life technology | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum | Life technology | 16000-044 | |
| L-glutamine | Life technology | 25030-081 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A4544-100G | |
| Pennicillin/Streptomycin | Life technology | 15140-122 | |
| Low melting agarose | BioExpress | E-3111-125 | |
| 35mm glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Petrolieum Jelly (Vaseline) | Sigma | 16415-1Kg | |
| Mice | |||
| Keratin14-cre | MGI: J:65294 | Allele = Tg(KRT14-cre)1Amc | |
| ROSA26mTmG | MGI: J:124702 | Allele = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo | |
| Lifeact-mRFPruby | MGI: J:164274 | Allele = Tg(CAG-mRuby)#Rows | |
| Microscope | |||
| White Light SP5 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Cell Observer spinning disk confocal microscope | Zeiss Microscopy |
References
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