Summary
Her præsenterer vi en protokol til levende billeddannelse af musekonfliktfusion med konfokal mikroskopi. Denne protokol kan anvendes i kombination med en række fluorescerende reportermuslinjer, og med pathway-hæmmere til mekanistisk indsigt. Denne protokol kan tilpasses til levende billeddannelse i andre udviklingssystemer.
Abstract
Sammensmeltningen af de sekundære palatalhylder til dannelse af den intakte sekundære gane er en nøgleproces i udvikling af pattedyr, og dets forstyrrelse kan føre til spaltet sekundær gane, en fælles medfødt anomali hos mennesker. Sekundær ganefusion er blevet grundigt undersøgt, hvilket fører til flere foreslåede cellulære mekanismer, som kan mediere denne proces. Disse undersøgelser er dog hovedsageligt udført på faste embryonale væv ved progressive tidspunkter under udvikling eller i faste eksplanterede kulturer analyseret ved statiske tidspunkter. Statisk analyse er begrænset til analyse af dynamiske morfogenetiske processer, sådan en ganefusion, og hvilke typer af dynamiske cellulære adfærd medier palatal fusion er ufuldstændigt forstået. Her beskriver vi en protokol til levende billeddannelse af ex vivo sekundær ganefusion i musembryoer. For at undersøge cellulære opførsel af ganefusion blev epithel-specifik Keratin14- cre brugt til at mærke ganeepitelceller i ROSA26-mTmG flox reporter embryoner. For at visualisere filamentøs actin blev Lifeact-mRFPruby- reportermus anvendt. Levende billeddannelse af sekundær ganefusion blev udført ved dissekering af nyligt adhærerede sekundære palatalhyller af embryonale (E) 14.5-fosters embryoner og dyrkning i agaroseholdige medier på en glasbunds skål for at muliggøre billeddannelse med et inverteret konfokalmikroskop. Ved hjælp af denne metode har vi opdaget en række nye cellulære adfærd under sekundær ganefusion. En forståelse for, hvor adskillige celleadfærd er koordineret i rum og tid, bidrager meget til vores forståelse af denne dynamiske morfogenetiske proces. Denne protokol kan anvendes på mutante muselinier eller kulturer behandlet med farmakologiske inhibitorer for yderligere at fremme forståelse for, hvordan sekundær ganefusion styres.
Introduction
Vævsfusion er et vigtigt skridt i udviklingen af flere organer. Større menneskelige fødselsdefekter som spaltet læbe og gane, spina bifida og misdannelser i hjertet kan skyldes defekter i vævsfusion 1 . Mus sekundær gane fusion er blevet grundigt studeret for at identificere de cellulære og molekylære mekanismer, der styrer vævsfusion i udvikling 2 , 3 , 4 . I musen begynder sekundær ganeudvikling på omkring E11.5 med udvidelsen af en sekundær palatalhylde fra hver af de bilaterale maksillære processer. Den oprindelige vækst af palatalhyllerne foregår lodret langs tungen, indtil ca. E14.0, hvorefter palatalhyllerne bliver hævet vandret over tungen. Medialt rettet vækst resulterer i fysisk kontakt mellem de to palatale hylder, der tilslutter sig epithelia, der danner midterlinjen epitheliAl søm (MES) ved E14.5. Den mellemliggende MES skal fjernes fra mellem de sekundære palatalhyller for at muliggøre mesenkymkonfluens og udvikling af en intakt, fuldstændigt smeltet sekundær gane ved E15.5 3 .
Hvordan er et fælles epithelial MES-cellelag dannet mellem to separate palatale hylder og derefter fjernet for at opnå mesenkym konfluens, har været et centralt spørgsmål i ganeudvikling. Baseret på histologiske og elektronmikroskopi (EM) undersøgelser, eksplanterende kulturstudier og funktionelle musegenetikforsøg har flere grundlæggende celleadfærd været impliceret i denne proces. Filopodi-lignende fremskrivninger fra medialkantepitelet MEE af hver palatalhylde letter initial kontakt 5 , 6 efterfulgt af interkalering af disse epithelceller til en fælles enkelt MES 6 , 7 . Fjernelse af den resulterende delte MESEr blevet foreslået at gå videre med tre ikke-eksklusive mekanismer. Tidlige undersøgelser, der anvendte histologisk observation og ex vivo linjesporing med vitale farvestoffer, viste, at MES kunne fjernes ved epithelial til mesenchymal overgang (EMT) af MES-celler 8 , 9 , men for nylig har genetisk afstamning af epithelceller skabt usikkerhed omkring Det langsigtede bidrag fra epithelceller til palatal hylde mesenchymme 10 , 11 , 12 . Signifikant antal apoptotiske celler og en reduktion i deres antal i nogle mutanter, der ikke gennemgår ordentlig palatfusion, har ført til ideen om, at apoptose kan være en vigtig drivkraft for MES opløsning 2 , 3 . Endelig baseret på undersøgelser, der involverer epitelmærkning og statisk observation ved progressive tidspunkter, MES-cellerBlev foreslået at migrere i oronasale og anteroposterior dimensioner 11 , 13 , men sådanne dynamiske celleadfærd var oprindeligt ubekræftet på grund af manglende evne til at observere dem i levende palatalvæv. For nylig var vi i stand til direkte at observere disse adfærd ved at udvikle en ny levende billeddannelsesmetode, der kombinerer musegenetiske metoder til fluorescerende mærkning med konfokal levende billeddannelse af eksplanterede palatalhyller.
For at visualisere dynamisk cellulær adfærd i palatepitelceller under ganefusion genererede vi en epithelspecifik reportermus ved at krydse ROSA26-mTmG floxmus med Keratin14-cre mus 14 , 15 . Konfokal levende billeddannelse af ganen eksplanterende kultur af de resulterende embryoner bekræftede nogle tidligere foreslåede cellulære adfærd og identificerede nye begivenheder i fusionsprocessen 6 </sup>. Epithelcelle-membran fremspring forud for begyndelsen af celle-cellekontakt efterfulgt af epithelisk konvergens ved celleinterkalering og oronasal celleforskydning. Navnlig opdagede vi også, at celleekstrudering, en proces rapporteret at spille vigtige roller i epithelial homeostase, var en vigtig mekanisme, der kørte mus sekundær ganefusion 6 , 16 . Denne billeddannelsesmetode kan bruges sammen med andre reporterlinjer; Vi benyttede Lifeact-mRFPruby- transgene mus 17 , 18 til at undersøge actin cytoskeletaldynamik under fusionsprocessen. Andre journalister kan også bruges til at observere andre specifikke aspekter af ganefusion, og denne metode kan tilpasses enten til laserskanning af konfokal mikroskopi eller spin-disk-konfokalmikroskopi afhængigt af billedbehov og tilgængelighed af mikroskop. Levende billeddannelse bliver i stigende grad en keystone-tilgang i udviklingsbiologi. PartiCularly, kraniofacial morfogenese er kompleks og menneskelige fødselsdefekter, der påvirker ansigtet er almindelige. Denne konfokale levende billeddannelsesmetode vil bidrage til at muliggøre en bedre forståelse af underliggende grundlæggende udviklingsmekanismer såvel som oprindelse af humane kraniofaciale abnormiteter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Levende billeddannelse af vævsmorfogenese med 3D-organteksplanteringskultur kan give detaljeret information om cellulære processer, der ikke kan vises i konventionel farvningsanalyse af faste vævssektioner. Ved at bruge in vitro eksplantatkultur af musembryonisk sekundær gane observerede vi adskillige interessante cellulære adfærd, der førte os til at foreslå en ny mekanisme af ganefusion, der involverer epithelkonvergens og celleekstrudering.
En fælles udfordring i unders?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker M. Douglas Benson for indledende samtaler vedrørende sekundær ganebilleddannelse. Vi anerkender også David Castaneda-Castellanos (Leica) og Chris Rieken (Zeiss) for deres hjælp til at justere billeddannelsesforhold i konfokal mikroskopi. Vi sætter pris på Lynsey Hamilton (Bitplane) for nyttige forslag til kvantitativ billedanalyse ved hjælp af Imaris software. Dette arbejde blev finansieret af NIH / NIDCR R01 DE025887.
Materials
| Reagents | |||
| DMEM/F12 | Life technology | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum | Life technology | 16000-044 | |
| L-glutamine | Life technology | 25030-081 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A4544-100G | |
| Pennicillin/Streptomycin | Life technology | 15140-122 | |
| Low melting agarose | BioExpress | E-3111-125 | |
| 35mm glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Petrolieum Jelly (Vaseline) | Sigma | 16415-1Kg | |
| Mice | |||
| Keratin14-cre | MGI: J:65294 | Allele = Tg(KRT14-cre)1Amc | |
| ROSA26mTmG | MGI: J:124702 | Allele = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo | |
| Lifeact-mRFPruby | MGI: J:164274 | Allele = Tg(CAG-mRuby)#Rows | |
| Microscope | |||
| White Light SP5 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Cell Observer spinning disk confocal microscope | Zeiss Microscopy |
References
- Ray, H. J., Niswander, L. Mechanisms of tissue fusion during development. Dev. Camb. Engl. 139, 1701-1711 (2012).
- Dudas, M., Li, W. -. Y., Kim, J., Yang, A., Kaartinen, V. Palatal fusion – where do the midline cells go? A review on cleft palate, a major human birth defect. Acta Histochem. 109, 1-14 (2007).
- Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139, 231-243 (2012).
- Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. Cellular and Molecular Mechanisms of Palatogenesis. Curr Top Dev Biol. 115, 59-84 (2015).
- Taya, Y., O’Kane, S., Ferguson, M. W. Pathogenesis of cleft palate in TGF-b3 knockout mice. Development. 126, 3869-3879 (1999).
- Kim, S., et al. Convergence and Extrusion Are Required for Normal Fusion of the Mammalian Secondary Palate. PLOS Biol. 13, 100122 (2015).
- Yoshida, M., et al. Periderm cells covering palatal shelves have tight junctions and their desquamation reduces the polarity of palatal shelf epithelial cells in palatogenesis. Genes Cells. 17, 455-472 (2012).
- Fitchett, J., Hay, E. Medial edge epithelium transforms to mesenchyme after embryonic palatal shelves fuse. Dev. Biol. 131, 455-474 (1989).
- Akira, N., et al. The expression of TGF-beta3 for epithelial-mesenchyme transdifferentiated MEE in palatogenesis. J Mol Hist. 41, 343-355 (2010).
- Sani, F. V., et al. Fate-mapping of the epithelial seam during palatal fusion rules out epithelial-mesenchymal transformation. Dev. Biol. 285, 490-495 (2005).
- Jin, J. -. Z., Ding, J. Analysis of cell migration, transdifferentiation and apoptosis during mouse secondary palate fusion. Development. 133, 3341-3347 (2006).
- Xu, X., et al. Cell autonomous requirement for Tgfbr2 in the disappearance of medial edge epithelium during palatal fusion. Dev. Biol. 297, 238-248 (2006).
- Carette, M. J., Ferguson, M. W. The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro: an analysis by Dil labelling and confocal microscopy. Development. 114, 379-388 (1992).
- Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Dassule, H., Lewis, P., Bei, M., Mass, R., McMahon, A. Sonic hedgehog regulates growth and morphogenesis of the tooth. Development. 127, 4775-4785 (2000).
- Eisenhoffer, G., et al. Crowding induces live cell extrusion to maintain homeostatic cell numbers in epithelia. Nature. 484, 501-546 (2012).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5, 605-607 (2008).
- Riedl, J., et al. Lifeact mice for studying F-actin dynamics. Nat Methods. 7, 168-169 (2010).
- Can, A., et al. Attenuation correction in confocal laser microscopes: a novel two-view approach. J Microsc. 211, (2003).
- Veenman, C., Reinders, M., Backer, E. Resolving motion correspondence for densely moving points. IEEE Trans Pattern Anal Mach Intell. 23, 54-72 (2001).
- Udan, R., Piazza, V., Hsu, C., Hadjantonakis, A., Dickinson, M. Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy. Development. 141, 4406-4414 (2014).
- Stoller, J., et al. Cre reporter mouse expressing a nuclear localized fusion of GFP and beta-galactosidase reveals new derivatives of Pax3-expressing precursors. Genesis. 46, 200-204 (2008).
