Culturing In Vivo-כמו האסטרוציטים מאתר באמצעות פרוטוקול AWESAM מהירה, פשוטה וזולה
Summary
פרוטוקול AWESAM המתוארים כאן הוא אופטימלי culturing האסטרוציטים מאתר בבידוד מתאי המוח אחרים בצורה מהירה, פשוטה וזולה. AWESAM האסטרוציטים התערוכה ספונטנית Ca2 + איתות, מורפולוגיה, ג’ין ביטוי ופרופילי דומה האסטרוציטים ויוו.
Abstract
AWESAM ( הלאוw-עלות easy stellate strocyte מ’ethod) פרוטוקול כרוך דרך מהירה, פשוטה וזולה להפקת כמויות גדולות של in vivo-כמו עכבר, חולדה monocultures אסטרוציט : תאי המוח ניתן לבודד אזורים שונים במוח, אחרי שבוע של תרבית תאים, התאים הלא-astrocytic הם ניערתי מעליי על-ידי הצבת הכלים תרבות על מטרף עבור 6-אייץ ‘ בחממה. האסטרוציטים הנותרים הם passaged ואז לוחות חדשים בינונית אסטרוציט ספציפיים (הנקרא NB + H). NB + H מכיל ריכוזים נמוכים של הפארין מחייב EGF פקטורי גדילה דמויי (HBEGF), אשר משמש במקום סרום בינוני. לאחר גידול ב- NB + H, AWESAM האסטרוציטים יש תכונה תהליכים בסדר ומורפולוגיה stellate. יתר על כן, האסטרוציטים אלה יש יותר ויוו-כמו ביטוי גנים מאשר האסטרוציטים שנוצר על ידי שיטות שפורסמו בעבר. Ca2 + הדמיה, שלפוחית dynamics ואירועים אחרים בקרבת הקרום שניתן ובכך יהיה לחקור את התהליכים astrocytic בסדר במבחנה, למשל, באמצעות וידאו בשידור חי התא או מיקרוסקופ TIRF. ראוי לציין, AWESAM האסטרוציטים גם התערוכה ספונטנית Ca2 + איתות דומה האסטרוציטים ויוו.
Introduction
האסטרוציטים להשפיע על תפקוד המוח באמצעות תמיכה עם מחלות, זרימת הדם, איתות סינפטית, פלסטיות ותקשורת המערכת – כל אלה הם מנגנונים מרכז סביב התהליכים astrocytic דק. פרוטוקול AWESAM המתוארים כאן מאפשר חקר תהליכים אלו ללא הפרעה בין נוירונים אחרים עכשיו, דונלד, אשר הוא שימושי למשל, כי הביטוי של חלבונים רבים ו- Ca2 + איתות אפילו חופפים מעבר לתא מוח סוגי. עוד יותר, שיטה זו גוברת על המגבלות של טכניקות זמינים בעבר. בפרט, פרוטוקול שלנו מספק ויוו-כמו מורפולוגיה (stellate האסטרוציטים עם תהליכים דק), ביטוי גנים, מהיר, קל, ואופן זול.
מורפולוגיה תאים, ביטוי גנים רבים תהליכים רגולטוריים אחרים מושפעים ישירות הסביבה. בקערה תרבות, זה מתייחס לגורמים שפורסמו על ידי התאים שמסביב, אלא גם המדיום שבו התאים גדלים. עבור האסטרוציטים, HBEGF דווחה בעבר לזירוז stellate מורפולוגיה1 אבל נמצאה גם מבטל את להבדיל האסטרוציטים2. עם זאת, ריכוז נמוך יותר של HBEGF שימשו מאוחר יותר ליצירת עוד ויוו-כמו האסטרוציטים כפי שזוהו באמצעות רצפי RNA שני פרוטוקולים שונים3,4. יתר על כן, מורפולוגיה אסטרוציט משתנה להרכב בינוני, ללא קשר פרוטוקול4: Neurobasal בינוני עם ריכוז נמוך של HBEGF הוא אופטימלי לגידול האסטרוציטים stellate, בעוד אחרים יצירות בינונית (למשל, סרום-המכיל DMEM) מייצר תאים מצולע (אפילו ב האסטרוציטים טרי מבודדת על ידי immunopanning).
פרוטוקול AWESAM גוברת על החסרונות של טכניקות הקודם לגידול אסטרוציט monocultures4. שיטות קודמות לגידול אסטרוציט monocultures יש חסרונות הבאים: מורפולוגיה מצולע, וזה דיי האסטרוציטים stellate ויוו (שיטת MD)5; האורך ואת העלות של פרוטוקול (הכנת האסטרוציטים מ pluripotent המושרה בתאי גזע לוקח שלושה חודשים ודורש נוגדנים רבים, לרבות גורמי גדילה יקר)6; כמויות נמוכות של חומר (שיטת immunopanning)3; את הבידול והתבקשתי של האסטרוציטים, הדרישה של מטריצה תלת-ממד (Puschmann et al.) 1 , 2. לעומת זאת, פרוטוקול AWESAM מספק: ויוו-כמו מורפולוגיה (האסטרוציטים stellate עם תהליכים דק); מהר, לאט, ושיטת זולים; כמויות גדולות של חומר; הכי אין ויוו-כמו ביטוי גנים לעומת immunopanned ו MD האסטרוציטים. בנוסף, תרבות דו-מימדית מאפשרת לצורך המחקר של איתות2 + Ca, מיחזור תהליכים דק, וכן אירועים קרוב הקרום שלפוחית (למשלמיקרוסקופ TIRF בלתי אפשרי בתרבויות תלת-ממד).
השיטה MD שימש בהרחבה מאז פרסומו ב- 19805, מציעה טכניקה פשוטה ומהירה עבור monocultures אסטרוציט מצולע. בקיצור, השיטה MD כרוך תאי המוח מעורבות גוברת בנסיוב עגל עוברית (FCS)-המכיל DMEM, ואחריו רועד צעדים להעשיר עבור האסטרוציטים (כמו כל שאר סוגי לנתק מתוך קערה לתא מוח), תרבות נוספת במדיום אותו. DMEM בתוספת FCS משמש עבור שאר סוגי תאים רבים, החל fibroblasts adipocytes שורות תאים סרטן שונים, צמודות המבנה מצולעים הוצגו על ידי MD האסטרוציטים בתרבות. עד בתחילת שנות האלפיים7, היה קצת מחשבה בהתחשב מדיה המותאמים האסטרוציטים, במיוחד את האמונים שלהם מורפולוגיה stellate טיפוסי נמצאו vivo בתוך. פרוטוקול אחד שפורסם בשנת 2011 להשיג כזה מורפולוגיה stellate: קראו את שיטת immunopanning, היא מעסיקה בינונית ללא סרום אופטימיזציה עבור culturing האסטרוציטים3. באמצעות שיטה זו, תאי מוח טרי מבודד חשופים סדרה של מנות מצופה נוגדנים יעד ייחודיים לסוג התא חלבונים פני שטח התא, להעשיר עבור האסטרוציטים. למרות ה יותר ויוו-כמו פרופיל ביטוי ומורפולוגיה של immunopanned האסטרוציטים, הרוב המכריע של מחקרים במבחנה עדיין מסתמכים על השיטה אסטרוציט MD. השיטה MD היא פשוטה ומהירה, בעוד השיטה immunopanning כוללת יותר מורכב ולגזול צעדים ביום הראשון של תרבות (כגון אנזים עיכול תקופות ארוכות יותר, זהיר שכבות של פתרונות של צפיפות שונה, immunopanning עצמה, ו מספר צנטריפוגה שלבים – הכל לפני ציפוי). עם זאת, באמצעות מדיום יותר מיוחדים, שיטת AWESAM מציע שני את המהירות של השיטה MD ו ה ויוו-כמו מורפולוגיה של הפרוטוקול immunopanning.
בסך הכל, פרוטוקול AWESAM שימושית ללמוד יותר ויוו-כמו האסטרוציטים ב- 2D monocultures מבודדת בין נוירונים אחרים עכשיו, דונלד (כפי שנעשה בעבר4 על ידי immunostainings, immunoblots, רצפי RNA). זה מאפשר לחקר תהליכים astrocytic דק, וכן מספקת נגישות מעולה להמחשת ספונטנית של Ca2 + איתות ואירועים בקרבת הקרום (למשל, עם תמונה על ידי מיקרוסקופ TIRF).
Protocol
Representative Results
Discussion
ארבעה שלבים בתוך הפרוטוקול הן קריטיות: 1) הכנת ריכוז HBEGF כדי בדיוק 5 ng/mL, מאז עליות קטנות הריכוז יכול להוביל תרבויות לא בוגר, למשל10 ננוגרם למ”ל HBEGF de-להבדיל האסטרוציטים4; 2) בועות הימנעות בפתרונות מכילים רקמה או תאים, אשר ניתן לשנות את ה-pH, לעכב אסטרוציט בריאות; 3) מראש equilibrating מד?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו להכיר במימון המועצה האירופית למחקר (האיחוד FP7/260916), את אלכסנדר פון הומבולדט-Stiftung (Sofja Kovalevskaja), פתוח (DE1951 ו- SFB889).
Materials
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco | 25300054 | warm in 37 ºC waterbath before use |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | warm in 37 ºC waterbath before use |
| B-27 supplement | Gibco | 17504-044 | 50X stock |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | 100X stock |
| Penicillin / streptomycin | Gibco | 15070-063 | 50 stock; penicillin: 5000 U/ml; streptomycin: 5000 µg/ml |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | without L-glutamine |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| HBEGF | Sigma | 4643 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| HBSS | Gibco | 14170112 | |
| FCS | Gibco | 10437028 | |
| PBS | Gibco | 10010049 | 1X |
| 100 μm nylon cell strainer | BD | 352360 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific | Hera Cell 240i cell culture incubator | |
| Laboratory shaker | Heidolph | Rotamax 120 | use inside cell culture incubator |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R |
References
- Puschmann, T. B., et al. Bioactive 3D cell culture system minimizes cellular stress and maintains the in vivo-like morphological complexity of astroglial cells. Glia. 61 (3), 432-440 (2013).
- Puschmann, T. B., et al. HB-EGF affects astrocyte morphology, proliferation, differentiation, and the expression of intermediate filament proteins. J Neurochem. 128 (6), 878-889 (2014).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
- Wolfes, A. C., et al. A novel method for culturing stellate astrocytes reveals spatially distinct Ca2+ signaling and vesicle recycling in astrocytic processes. J Gen Physiol. 149 (4), (2016).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
- Krencik, R., Zhang, S. -. C. Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 6 (11), 1710-1717 (2011).
- Morita, M., et al. Dual regulation of calcium oscillation in astrocytes by growth factors and pro-inflammatory cytokines via the mitogen-activated protein kinase cascade. J Neurosci. 23 (34), 10944-10952 (2003).
- Saura, J. Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note. J Neuroinflammation. 4, 26 (2007).
- Raponi, E., et al. S100B expression defines a state in which GFAP-expressing cells lose their neural stem cell potential and acquire a more mature developmental stage. Glia. 55 (2), 165-177 (2007).
- Royo, N. C., et al. Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity. Brain Res. 1190, 15-22 (2008).
- Malarkey, E. B., Parpura, V. Temporal characteristics of vesicular fusion in astrocytes: examination of synaptobrevin 2-laden vesicles at single vesicle resolution. J Physiol. 589, 4271-4300 (2011).
- Zamanian, J. L., et al. Genomic analysis of reactive astrogliosis. J Neurosci. 2 (18), 6391-6410 (2012).
- Srinivasan, R., et al. Ca(2+) signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo. Nat Neurosci. 18 (5), 708-717 (2015).
- Shigetomi, E., et al. Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses. J Gen Physiol. 141 (5), 633-647 (2013).
- Srinivasan, R., et al. New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
- Otsu, Y., et al. Calcium dynamics in astrocyte processes during neurovascular coupling. Nat Neurosci. 18 (2), 210-218 (2015).
- Agarwal, A., et al. Transient Opening of the Mitochondrial Permeability Transition Pore Induces Microdomain Calcium Transients in Astrocyte Processes. Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).
