Vivo에서경작-Murine 이다 빠르고, 간단 하 고 저렴 한 AWESAM 프로토콜을 사용 하 여 같은

Summary

여기에 설명 된 AWESAM 프로토콜은 빠르고, 단순 하 고 저렴 한 방식으로 다른 뇌 세포 분리에서 murine 이다 경작에 최적입니다. AWESAM 이다 자발적인 캘리포니아^{2 +} 신호, 형태학, 및 유전자 식 프로필 이다에서 vivo에서유사한 전시.

Abstract

AWESAM (는 low– e유도 stellate는 strocyte method 비용) 프로토콜 수반 vivo에서의 대량을 생성 하는 빠르고, 간단 하 고 저렴 한 방법-마우스와 쥐 사이토 monocultures 같은 : 뇌 세포는 서로 다른 뇌 영역에서 고립 될 수 있다 고 주 후에 세포 배양의, 비 astrocytic 셀 인큐베이터에 6 h에 대 한 통에 문화 요리를 배치 하 여 떨어져 동요는. 나머지 이다 (불리 NB + H) 사이토 관련 매체와 새로운 접시에 다음 passaged 있습니다. NB + H 혈 청 매체에 대신 사용 되는 헤 파 린 바인딩 EGF 같은 성장 인자 (HBEGF)의 낮은 농도 포함 합니다. NB + H, 성장 후 AWESAM 이다 방사상 형태와 기능은 괜 찮 프로세스 있다. 또한,이 이다 더 많은 비보에있다-같은 보다 이전에 게시 방법으로 생성 하는 이다 유전자 발현. 캘리포니아^{2 +} 영상, 기 역학, 고 막 가까이 다른 이벤트 따라서 벌금 astrocytic 프로세스에서 생체 외에서 예를 들어, 라이브 셀 confocal 또는 TIRF 현미경을 사용 하 여 공부 될 수 있다. 특히, AWESAM 이다 또한 전시 자발적인 캘리포니아^{2 +} 신호 이다에서 vivo에서유사한.

Introduction

영양 지원, 혈액 흐름, 시 냅 스 신호 및 소성, 및 세포 통신-는 모두 얇은 astrocytic 프로세스 중심 메커니즘을 통해 뇌 기능에 영향을 이다. 여기에 설명 된 AWESAM 프로토콜을 사용 하는 유용한 예를 들어, 많은 단백질 및 심지어 캘리포니아^{2 +} 신호 표현의 다른 뇌 세포에 걸쳐 다른 명과 뉴런에서 간섭 없이 이러한 프로세스의 연구 유형입니다. 또한,이 방법은 이전에 사용할 수 있는 기술의 한계 극복. 특히, 우리의 프로토콜 vivo에서제공-형태학 (방사상 이다 얇은 프로세스) 및 유전자 발현에 빨리, 쉽게, 그리고 저렴 한 방식으로 같은.

셀 형태, 유전자 발현, 그리고 다른 많은 규제 프로세스는 직접 환경에 의해 영향을 받습니다. 문화 접시에이 주변의 세포 뿐만 아니라 세포 재배 되 고 있는 매체에 의해 발표 하는 요소를 말합니다. 이다, HBEGF 방사상 형태로¹ 을 유도 하기 위해 이전에 보고 하지만 드 이다²를 차별화 하는 또한 발견 했다. 그러나, HBEGF의 낮은 농도 나중 더 vivo에서생성 하는 데 사용 했다-두 개의 서로 다른 프로토콜^3,4RNA 시퀀싱을 통해 발견 이다 처럼. 또한, 사이토 형태학 프로토콜⁴에 중간 구성 변경: HBEGF의 낮은 농도와 Neurobasal 매체는 방사상 이다 (예를 들어, 다른 중간 작곡 하면서 성장을 위한 최적의 혈 청-포함 된 DMEM) (immunopanning에 의해 고립 된 갓 이다)에 다각형 세포를 생산.

AWESAM 프로토콜 사이토 monocultures⁴성장에 대 한 이전 방법의 단점을 극복 했다. 성장 하는 사이토 monocultures 이전 기술은 다음과 같은 단점이 있습니다: 방사상 이다에 vivo에서 (MD 방법)⁵;의 특성은 다각형 형태 길이 비용 (유도 만능 줄기 세포는 이다 3 개월을 준비 하며 고가의 성장 인자를 포함 하 여 많은 시 약) 프로토콜의⁶; 낮은 양의 재료 (immunopanning 방법)³; 이다의 탈 분화와 3D 매트릭스 (Puschmann 외.)의 요구 사항 ^{1 , 2}. AWESAM 프로토콜을 제공 하는 반면,: vivo에서-같은 형태 (얇은 프로세스와 방사상 이다); 빠른, 쉽게, 그리고 저렴 한 방법; 대량의 물자; 그리고 vivo에서가장-같은 비해 immunopanned 및 MD 이다 유전자 발현. 또한, 2D 문화 캘리포니아^{2 +} 신호 및 얇은 프로세스, 고 막 가까이 이벤트 재활용 기의 연구에 대 한 수 있습니다 (예를 들어, TIRF 현미경 불가능 3D 문화에서).

MD 메서드는 1980⁵, 다각형 사이토 monocultures는 간단 하 고 빠른 기술 제공에 그것의 간행물부터 광대 하 게 사용 되었습니다. 간단히, MD 메서드 수반 송아지 태아 혈 청 (FCS)에서 성장 혼합된 뇌 세포-(다른 모든 뇌 세포 유형을 분리 접시에서)로 이다에 대 한 풍부 하 고 더 동일한 매체에 문화 단계를 흔들어 뒤 DMEM, 포함 된. DMEM fcs 보충 fibroblasts 및 adipocytes에서 다른 암 세포 선, 모두의 공유 문화에서 MD 이다에 의해 전시 다각형 형태에 이르기까지 많은 다른 세포 유형, 사용 됩니다. 초기 2000 년대⁷까지 작은 생각 했던 특히 그들의 전형적인 방사상 형태를 선호 하 미디어 이다에 맞게 주어진 에 비보를 발견. 2011 년에 출판 한 프로토콜 같은 방사상 형태를 달성지 않습니다: 혈 청 자유로운 매체 이다³경작을 위해 최적화 된 사용 immunopanning 메서드를 호출. 이 메서드를 사용 하 여 갓 고립 된 뇌 세포는 대상 셀 형식 관련 세포 표면 단백질, 이다에 대 한 풍부 하 게 하는 항 체로 입힌 요리 시리즈에 노출 됩니다. 더는 비보에도 불구 하 고-immunopanned 이다의 형태와 식 프로필, 같은 생체 외에서 연구의 대다수는 여전히 MD 사이토 방법에 의존. MD 메서드는 간단 하 고 빠른, 문화의 첫 번째 날에 더 복잡 하 고 시간이 많이 걸리는 단계를 구성 하는 immunopanning 메서드 (더 이상 효소 소화 기간 등 다른 밀도, 자체, immunopanning 솔루션의 주의 레이어 링 및 여러 원심 분리 단계-모든 도금 하기 전에). 그러나, 보다 전문적인된 매체를 사용 하 여 AWESAM 메서드를 사용 하면 두 속도의 MD 메서드는 vivo에서제공-immunopanning 프로토콜의 형태 처럼.

전반적으로, AWESAM 프로토콜은 더 vivo에서공부 하는 데 유용-2D monocultures (immunostainings, immunoblots, 및 RNA 시퀀싱에 의해 이전 특징된⁴ )로 신경 및 다른 명과 격리에서 이다 처럼. 그것은 얇은 astrocytic 프로세스의 연구에 대 한 허용 하 고 자연 스러운 캘리포니아^{2 +} 신호 (예를 들어, TIRF 현미경 검사 법에 의해 몇 군데) 막 가까이 이벤트 시각화를 위한 훌륭한 접근을 제공 합니다.

Protocol

여기에 설명 된 모든 동물 실험은 독일 동물 복지에 대 한 지침에 따라 수행 했다. 참고: 타임 라인 및 프로토콜의 주요 단계는 그림 1에서 그림. 1입니다. 준비 다음과 같은 솔루션을 준비 합니다. DMEM + 다각형 MD 이다 경작에 대 한 준비: DMEM 10 S 100 U 페니실린, 100 µ g/mL 스. NB + H 방사상 이다 경작…

Representative Results

신경을 가진 공동 경작 하 고 NB + 매체에 성장 이다 문화 (그림 2)의 2 주 후 방사상 나타납니다. NB + 매체, 이외에 공동 경작된 이다 또한 아마 그들의 생존 및 형태학에 기여 하는 알 수 없는 신경 파생 된 요소에 노출 됩니다. 반면, 메릴랜드 이다 (후에 통과 하기 전에 다른 세포 유형 푸는) monocultures로 DMEM + 성장 다각형 2 주 후에 나타납니다. NB + H에?…

Discussion

프로토콜 내에서 4 단계는 중요: 1)를 준비 하 고 정확 하 게 5 ng/ml, HBEGF 농도 때문에 농도 있는 작은 증가 미 숙 문화, 예를 들어, 발생할 수 있습니다 10 ng/mL HBEGF 드 차별화 이다⁴; 조직 또는 pH를 변경 하 고 사이토 건강;을 방해 수 있는 셀을 포함 하는 솔루션 2) 피 거품 3) 전 평형 미디어 최적 pH 및 온도 성장 하는 건강 한 이다; (비록 아무 microglia AWESAM 문화에서 지금까지 발…

Materials

0.05% trypsin-EDTA	Gibco	25300054	warm in 37 ºC waterbath before use
0.25% trypsin-EDTA	Gibco	25200-056	warm in 37 ºC waterbath before use
B-27 supplement	Gibco	17504-044	50X stock
Glutamax	Gibco	35050-061	100X stock
Penicillin / streptomycin	Gibco	15070-063	50 stock; penicillin: 5000 U/ml; streptomycin: 5000 µg/ml
Neurobasal medium	Gibco	21103049	without L-glutamine
DMEM	Gibco	41966029
HBEGF	Sigma	4643
HEPES	Gibco	15630080
HBSS	Gibco	14170112
FCS	Gibco	10437028
PBS	Gibco	10010049	1X
100 μm nylon cell strainer	BD	352360
Trypan Blue	Sigma	T8154
Cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific	Hera Cell 240i cell culture incubator
Laboratory shaker	Heidolph	Rotamax 120	use inside cell culture incubator
Centrifuge	Eppendorf	5810 R