Summary

Cultivo In Vivo-gosto murino astrócitos usando o protocolo AWESAM rápida, simples e barato

Published: January 10, 2018
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Summary

O protocolo AWESAM descrito aqui é ideal para o cultivo de astrócitos murino em isolamento de outras células do cérebro de forma rápida, simples e barato. Astrócitos AWESAM exposição espontânea Ca2 + sinalização, morfologia e gene expressão perfis semelhantes de astrócitos na vivo.

Abstract

O AWESAM (um low-custo easy stellate umstrocyte method) protocolo implica uma maneira rápida, simples e barata para gerar grandes quantidades de in vivo-como monoculturas de rato e rato astrocyte : As células do cérebro podem ser isoladas de regiões diferentes do cérebro, e após uma semana de cultura de células, as células não-hamartomas são sacudidas, colocando os pratos de cultura num agitador para 6 h na incubadora. Os astrócitos restantes são então passados para novas placas com meio astrocyte específicos (denominado NB + H). NB + H contém baixas concentrações de heparina-ligação EGF fator de crescimento semelhante (HBEGF), que é usado no lugar de soro no meio. Após ter crescido em NB + H, astrócitos AWESAM têm uma morfologia estrelada e processos bem característica. Além disso, estes astrócitos têm mais na vivo-como expressão do gene que astrócitos gerados pelos métodos anteriormente publicados. Imagem latente de CA2 + , dinâmica de vesículas e outros eventos perto da membrana, portanto, podem ser estudados no bem processos hamartomas em vitro, por exemplo, usando a célula viva confocal ou microscopia TIRF. Notavelmente, astrócitos AWESAM também apresentam espontânea Ca2 + sinalização semelhante de astrócitos na vivo.

Introduction

Astrócitos influenciam a função cerebral através de suporte trófica, fluxo sanguíneo, sinalização sináptica e plasticidade e comunicação intercelular – todos os quais são mecanismos que giram em torno dos processos hamartomas finos. O protocolo AWESAM descrito aqui permite que o estudo desses processos sem interferência de neurônios e outro glia, que é útil , por exemplo, porque a expressão de muitas proteínas e até mesmo de Ca2 + sinalização se sobrepõem em toda célula cerebral diferente tipos. Além disso, este método supera as limitações das técnicas anteriormente disponíveis. Em particular, o nosso protocolo fornece na vivo-como morfologia (astrócitos estreladas com processos finos) e expressão gênica em um rápido, fácil e barata maneira.

Morfologia celular, expressão gênica e muitos outros processos regulatórios são diretamente influenciados pelo ambiente. Em um prato de cultura, refere-se a fatores liberados por células circundantes, mas também o meio no qual as células são cultivadas. Para astrócitos, HBEGF foi relatado anteriormente para induzir uma morfologia estrelado1 mas verificou-se, também, para diferenciar de astrócitos2. No entanto, concentrações de HBEGF foram usadas mais tarde para a geração mais na vivo-astrócitos como identificados por meio de sequenciamento de RNA em dois diferentes protocolos de3,4. Além disso, a morfologia astrocyte altera com a composição média, independentemente do protocolo4: Neurobasal médio com uma baixa concentração de HBEGF é ideal para o cultivo de astrócitos estrelados, enquanto outras composições médios (por exemplo, contendo soro DMEM) produzir células poligonais (mesmo em astrócitos recentemente isolados por immunopanning).

O protocolo AWESAM supera as desvantagens das técnicas anteriores para o cultivo de monoculturas astrocyte4. Técnicas anteriores para o cultivo de monoculturas astrocyte têm as seguintes desvantagens: morfologia poligonal, que é característico de astrócitos estrelado na vivo (método de MD)5; o comprimento e o custo do protocolo (astrócitos tomadas de células-tronco pluripotentes induzidas a preparar três meses e requer muitos reagentes, incluindo fatores de crescimento caros)6; as pequenas quantidades de material (método immunopanning)3; e a diferenciação dos astrócitos e exigência de uma matriz 3D (Puschmann et al.) 1 , 2. em contraste, o protocolo AWESAM fornece: no vivo-como morfologia (astrócitos estreladas com processos finos); um rápido, fácil e barato método; grandes quantidades de material; e a maioria na vivo-como expressão de gene em comparação com immunopanned e astrócitos MD. Além disso, permite a cultura 2D para o estudo da sinalização de Ca2 + e vesículas de reciclagem em finos processos e em eventos perto da membrana (por exemplo, microscopia TIRF não é possível em culturas 3D).

O método de MD tem sido usado extensivamente desde sua publicação em 19805, oferecendo uma técnica simples e rápida para monoculturas astrocyte poligonal. Em breve, o método de MD implica crescente neurónios misto no soro fetal bezerro (FCS)-contendo DMEM, seguido por etapas que enriquecem para astrócitos (como todas as outras células cerebrais tipos desanexar do prato) e mais cultura no mesmo meio a tremer. DMEM suplementado com FCS é usado para muitos outros tipos de células, variando de fibroblastos e adipócitos para linhas de células de câncer diferentes, os quais compartilham a morfologia poligonal exibida por astrócitos MD na cultura. Até o início dos anos 20007, pouco tinha sido dada a mídia sob medida para astrócitos, especificamente favorecer sua morfologia típica estrelada encontrado em vivo. Um protocolo publicado em 2011 alcançar tal morfologia estrelada: chamado o método immunopanning, emprega meio livre de soro otimizado para cultivo de astrócitos3. Usando este método, as células do cérebro recentemente isolada estão expostas a uma série de pratos revestidos com anticorpos que se destinam a proteínas de células específicas do tipo de célula superfície, enriquecer para astrócitos. Apesar do mais na vivo-como perfil morfologia e expressão de astrócitos immunopanned, a maioria dos estudos em vitro ainda depende do método de astrocyte MD. O método de MD é simples e rápido, enquanto o método de immunopanning é composto por etapas mais complexas e demoradas no primeiro dia da cultura (tais como longos períodos de digestão enzimática, estratificação cuidadosa das soluções de diferente densidade, immunopanning em si, e vários centrifugação passos – tudo isso antes de chapeamento). No entanto, usando o meio mais especializado, o método AWESAM oferece tanto a velocidade do método MD e o na vivo-como a morfologia do protocolo immunopanning.

Em geral, o protocolo AWESAM é útil para estudar mais na vivo-gosto de astrócitos em 2D monoculturas isolados dos neurônios e outro glia (como anteriormente caracterizadas4 por immunostainings immunoblots e sequenciamento de RNA). Ele permite o estudo de processos hamartomas finos e fornece grande acessibilidade para a visualização de Ca2 + sinalização espontânea e eventos perto da membrana (por exemplo, fotografada por microscopia TIRF).

Protocol

Todas as experiências com animais aqui descritas foram realizadas em conformidade com as orientações para o bem-estar animal alemão. Nota: A linha do tempo e as etapas principais do protocolo são ilustradas na Figura 1. 1. preparações Prepare as seguintes soluções. Preparar DMEM + para cultivo poligonais astrócitos MD: DMEM com 10% FCS, 100 de U de penicilina e estreptomicina 100 de µ g/m…

Representative Results

Astrócitos que são cultivados co com neurônios e cultivados em meios NB + aparecem estrelados após 2 semanas da cultura (Figura 2). Além de NB + médio, os astrócitos co cultos também estão expostos a fatores desconhecidos neurônio-derivado que provavelmente contribuem para a sua sobrevivência e morfologia. Em contraste, astrócitos MD crescidos em DMEM + como monoculturas (após agitação fora outros tipos de células antes de passagem) aparecem p…

Discussion

Quatro etapas dentro do protocolo são fundamentais: 1) preparando a concentração HBEGF precisamente 5 ng/ml, uma vez que pequenos aumentos na concentração podem levar a culturas imaturas, por exemplo, 10 ng/mL HBEGF diferenciará de astrócitos4; 2) evita bolhas nas soluções que contêm tecidos ou células, que podem alterar o pH e impedir a saúde astrocyte; 3) pre-desenroscada mídia para atingir o pH ideal e a temperatura para o crescimento saudáveis astrócitos; 4) troca de ap…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Reconhecemos que o financiamento do Conselho Europeu de investigação (7. º PQ/260916), a Alexander von Humboldt-Stiftung (Sofja Kovalevskaja) e a Deutsche Forschungsgemeinschaft (DE1951 e SFB889).

Materials

0.05% trypsin-EDTA Gibco 25300054 warm in 37 ºC waterbath before use
0.25% trypsin-EDTA Gibco 25200-056 warm in 37 ºC waterbath before use
B-27 supplement Gibco 17504-044 50X stock
Glutamax Gibco 35050-061 100X stock
Penicillin / streptomycin Gibco 15070-063 50 stock; penicillin: 5000 U/ml; streptomycin: 5000 µg/ml
Neurobasal medium Gibco 21103049 without L-glutamine
DMEM Gibco 41966029
HBEGF Sigma 4643
HEPES Gibco 15630080
HBSS Gibco 14170112
FCS Gibco 10437028
PBS Gibco 10010049 1X
100 μm nylon cell strainer BD 352360
Trypan Blue Sigma T8154 
Cell culture incubator Thermo Fisher Scientific Hera Cell 240i cell culture incubator
Laboratory shaker Heidolph Rotamax 120  use inside cell culture incubator
Centrifuge Eppendorf 5810 R 

References

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Cite This Article
Wolfes, A. C., Dean, C. Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol. J. Vis. Exp. (131), e56092, doi:10.3791/56092 (2018).

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