Vivokültür-tarihlerde hızlı, basit ve ucuz AWESAM iletişim kuralını kullanarak fare Astrocytes
Summary
Burada açıklanan AWESAM iletişim kuralı diğer beyin hücreleri izolasyonu fare astrocytes bir hızlı, basit ve ucuz şekilde kültür için en iyi yöntemdir. AWESAM astrocytes spontan Ca2 + sinyal, morfoloji ve gen ifade profilleri için astrocytes vivo içindebenzer sergi.
Abstract
AWESAM (bir low– easy stellate birstrocyte malınan mal) protokolü üzerine kuruludur vivo içindebüyük miktarlarda üretmek için hızlı, basit ve ucuz bir yol-fare ve sıçan astrocyte monocultures hangi tarihlerde : Beyin hücreleri farklı beyin bölgelerden izole olabilir ve hücre kültürü bir hafta sonra astrositik olmayan hücreleri bir shaker kuluçka 6 h için Tarih kültür yemekleri yerleştirerek sarsılmış. Kalan astrocytes sonra yeni kalıplara (NB + H olarak adlandırılan) bir astrocyte özgü orta ile pasajlı. NB + H heparin bağlama EGF benzeri büyüme faktörü (HBEGF), serum orta yerine kullanılan düşük konsantrasyonlarda içerir. NB + H içinde büyüyen sonra AWESAM astrocytes Yildiz Seklinde bir morfoloji ve özellik iyi işlemler var. Dahası, bu astrocytes daha fazla vivo içindevar-tarihlerde gen ekspresyonu daha önceden yayınlanmış yöntemlerle üretilen astrocytes. CA2 + görüntüleme, vezikül dinamikleri ve diğer olaylar membran yakın böylece iyi astrositik süreçleri vitroiçinde canlı hücre confocal veya TIRF mikroskobu kullanarak örneğin, okudu olabilir. Özellikle, AWESAM astrocytes da astrocytes içinde vivoiçin benzer sinyal spontan Ca2 + sergi.
Introduction
Astrocytes trofik desteği, kan akımı, sinaptik sinyal ve plastisite ve hücreler arası iletişim – tüm bunların etrafında ince astrositik süreçleri Merkezi mekanizmalar aracılığıyla beyin fonksiyonlarını etkiler. Burada açıklanan AWESAM Protokolü nöronlar ve yararlı örneğin, birçok protein ve hatta Ca2 + sinyal ifadesi farklı beyin hücre boyunca örtüşme olan diğer glia müdahale olmadan bu süreçlerin çalışma sağlar türleri. Ayrıca, bu yöntem daha önce kullanılan tekniklerin sınırlamalar üstesinden gelir. Özellikle, vivo içindebizim iletişim kuralı sağlar-Morfoloji (Yildiz Seklinde astrocytes ince süreçleri ile) ve bir hızlı, kolay, gen ekspresyonu ve ucuz şekilde gibi.
Doğrudan hücre morfolojisi, gen ekspresyonu ve birçok diğer düzenleyici işlemler çevre tarafından etkilenmiştir. Bir kültür tabak içinde bu faktörler tarafından çevreleyen hücreleri, aynı zamanda hangi hücreleri yetiştirilmektedir orta serbest ifade eder. Astrocytes, HBEGF bir Yildiz Seklinde Morfoloji1 ikna etmek için daha önce bildirildi ancak aynı zamanda astrocytes2de-ayırt etmek için bulunamadı. Ancak, düşük konsantrasyonlarda HBEGF, daha sonra daha fazla vivo içindeoluşturmak için kullanılmıştır-RNA sıralama iki farklı protokol3,4ile tanımlandığı gibi hangi tarihlerde astrocytes. Ayrıca, bağımsız olarak protokolü4orta bileşimi ile astrocyte Morfoloji değiştirir: Neurobasal orta HBEGF bir düşük konsantrasyon ile diğer Orta besteleri (örneğin, süre Yildiz Seklinde astrocytes yetiştirmek için en uygun Serum DMEM içeren) poligonal hücrelerde (hatta astrocytes taze immunopanning tarafından izole) üretmek.
AWESAM Protokolü dezavantajları astrocyte monocultures4büyüyen için önceki teknikleri üstesinden gelir. Astrocyte monocultures büyüyen için önceki teknikleri var aşağıdaki dezavantajları: Yildiz Seklinde astrocytes vivo içinde (MD yöntemi)5/; alışılmadık poligonal Morfoloji uzunluk ve maliyet (astrocytes İndüklenmiş pluripotent kök hücreler alır üzerinden üç ay hazırlık ve pahalı büyüme faktörleri de dahil olmak üzere birçok reaktifler gerektirir) Protokolü’nün6; malzeme (immunopanning yöntemi)3düşük miktarda; ve astrocytes de-farklılaşma ve gereksinimi 3D matris (Puschmann ve ark.) 1 , 2. buna ek olarak, AWESAM Protokolü sağlar: vivo-tarihlerde Morfoloji (ince süreçleri ile Yildiz Seklinde astrocytes); hızlı, kolay ve ucuz yöntemi; malzeme büyük miktarlarda; ve en vivo içinde-gen ekspresyonu immunopanned ve MD astrocytes ile karşılaştırıldığında hangi tarihlerde. Ayrıca, Ca2 + sinyal ve vezikül ince işlemler ve olaylar membran yakın geri dönüşüm çalışması için 2D kültür sağlar (örneğin, TIRF mikroskobu 3D kültürlerde mümkün değildir).
MD yöntemi yayımı 19805poligonal astrocyte monocultures teknik bir basit ve hızlı sunan, beri yaygın olarak kullanılmış. Kısacası, MD yöntemi (FCS) fetal buzağı Serumda büyüyen karışık beyin hücreleri üzerine kuruludur-DMEM, içeren takip (olarak diğer tüm beyin hücresi türleri çanak ayırmak) için astrocytes zenginleştirmek ve daha fazla kültür aynı ortamda basamaklarının sallayarak. FCS ile desteklenmiş DMEM farklı kanser hücre satırlarına tüm bunların MD astrocytes kültür tarafından sergilenen poligonal Morfoloji paylaşmak, fibroblastlar ve adiposit arasında değişen birçok hücre tipleri için kullanılır. Kadar erken 2000’lerde7, küçük düşünce olmuştu astrocytes için uygun bir ortama verilen, özellikle onların tipik Yildiz Seklinde Morfoloji lehine içinde vivobuldu. 2011 yılında yayınlanan bir protokol ulaşmak böyle Yildiz Seklinde Morfoloji: immunopanning yöntemi olarak adlandırılan, serum-Alerjik orta astrocytes3kültür için en iyi duruma getirilmiş kullanır. Bu yöntemi kullanarak, taze izole beyin hücreleri bir dizi hücre türüne özgü hücre yüzey proteinleri astrocytes için zenginleştirmek için hedef antikorlar ile kaplı yemekleri sunulur. Daha fazla vivo içinderağmen-immunopanned astrocytes morfoloji ve ifade profil gibi vitro çalışmalar çoğunluğu hala MD astrocyte yönteme güvenmek. İmmunopanning yöntemi daha karmaşık ve zaman alıcı adımlar kültür ilk gününde kapsar MD yöntemi basit ve hızlı, iken (uzun enzim sindirim süre gibi çözümleri farklı yoğunluk, immunopanning kendisi, dikkatli katmanlama ve çeşitli aralıklarla adımlar – kaplama tüm önce). Ancak, daha özel orta kullanarak, AWESAM yöntemi her iki hızını MD yöntemi ve in vivosunar-tarihlerde immunopanning Protokolü morfolojisi.
Genel olarak, AWESAM Protokolü daha fazla vivo içindeçalışmak için yararlıdır-tarihlerde astrocytes 2D monocultures neurons ve diğer glia (immunostainings, immunoblots ve RNA sıralama tarafından daha önce karakterize4 ) olarak izole içinde. Bu ince astrositik işlemler çalışma için izin verir ve spontan Ca2 + sinyal ve olaylar (tarafından TIRF mikroskobu görüntüsüörneğin,) membran yakın görüntülenmesi için büyük erişilebilirlik sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokol içinde dört adım kritik: 1) konsantrasyonu küçük artışlar olgunlaşmamış kültürler için örneğin, neden olabilir beri tam 5 ng/ml, HBEGF konsantrasyon hazırlanıyor 10 ng/mL HBEGF astrocytes4; de-ayırt 2) doku veya pH değiştirebilir ve astrocyte sağlık engel hücreleri içeren çözümler kaçınmak kabarcıkları; 3) en uygun pH ve sıcaklık sağlıklı astrocytes büyüyen için elde etmek için ortam sıcaklığına önceden; 4) (hiçbir microglia bulundu,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Avrupa Araştırma Konseyi (FP7/260916), Alexander von Humboldt-Stiftung (Sofja Kovalevskaja) ve Deutsche Forschungsgemeinschaft (DE1951 ve SFB889) fon kabul.
Materials
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco | 25300054 | warm in 37 ºC waterbath before use |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | warm in 37 ºC waterbath before use |
| B-27 supplement | Gibco | 17504-044 | 50X stock |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | 100X stock |
| Penicillin / streptomycin | Gibco | 15070-063 | 50 stock; penicillin: 5000 U/ml; streptomycin: 5000 µg/ml |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | without L-glutamine |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| HBEGF | Sigma | 4643 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| HBSS | Gibco | 14170112 | |
| FCS | Gibco | 10437028 | |
| PBS | Gibco | 10010049 | 1X |
| 100 μm nylon cell strainer | BD | 352360 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific | Hera Cell 240i cell culture incubator | |
| Laboratory shaker | Heidolph | Rotamax 120 | use inside cell culture incubator |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R |
References
- Puschmann, T. B., et al. Bioactive 3D cell culture system minimizes cellular stress and maintains the in vivo-like morphological complexity of astroglial cells. Glia. 61 (3), 432-440 (2013).
- Puschmann, T. B., et al. HB-EGF affects astrocyte morphology, proliferation, differentiation, and the expression of intermediate filament proteins. J Neurochem. 128 (6), 878-889 (2014).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
- Wolfes, A. C., et al. A novel method for culturing stellate astrocytes reveals spatially distinct Ca2+ signaling and vesicle recycling in astrocytic processes. J Gen Physiol. 149 (4), (2016).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
- Krencik, R., Zhang, S. -. C. Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 6 (11), 1710-1717 (2011).
- Morita, M., et al. Dual regulation of calcium oscillation in astrocytes by growth factors and pro-inflammatory cytokines via the mitogen-activated protein kinase cascade. J Neurosci. 23 (34), 10944-10952 (2003).
- Saura, J. Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note. J Neuroinflammation. 4, 26 (2007).
- Raponi, E., et al. S100B expression defines a state in which GFAP-expressing cells lose their neural stem cell potential and acquire a more mature developmental stage. Glia. 55 (2), 165-177 (2007).
- Royo, N. C., et al. Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity. Brain Res. 1190, 15-22 (2008).
- Malarkey, E. B., Parpura, V. Temporal characteristics of vesicular fusion in astrocytes: examination of synaptobrevin 2-laden vesicles at single vesicle resolution. J Physiol. 589, 4271-4300 (2011).
- Zamanian, J. L., et al. Genomic analysis of reactive astrogliosis. J Neurosci. 2 (18), 6391-6410 (2012).
- Srinivasan, R., et al. Ca(2+) signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo. Nat Neurosci. 18 (5), 708-717 (2015).
- Shigetomi, E., et al. Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses. J Gen Physiol. 141 (5), 633-647 (2013).
- Srinivasan, R., et al. New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
- Otsu, Y., et al. Calcium dynamics in astrocyte processes during neurovascular coupling. Nat Neurosci. 18 (2), 210-218 (2015).
- Agarwal, A., et al. Transient Opening of the Mitochondrial Permeability Transition Pore Induces Microdomain Calcium Transients in Astrocyte Processes. Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).
