Différenciation du mégacaryocyte et plaquettes Formation de l’homme cordon CD34 dérivés du sang des cellules+
Summary
Une population très pure de mégacaryocytes peut provenir de cordon dérivés du sang CD34+ cellules. Une méthode pour CD34+ la différenciation des cellules d’isolement et mégacaryocyte est décrite ici.
Abstract
Production de plaquettes se produit principalement dans la moelle osseuse dans un processus appelé Thrombopoïèse. Au cours de la Thrombopoïèse, cellules progénitrices hématopoïétiques différencient aux précurseurs de plaquettes de forme appelés mégacaryocytes, qui se différencient en phase terminale pour libérer les plaquettes des processus longs cytoplasmiques appelés proplaquettes. Mégacaryocytes sont rares cellules confinés à la moelle osseuse et sont donc difficiles à récolter en nombre suffisant pour utilisation en laboratoire. Une production efficace de mégacaryocytes humaines peut être obtenue in vitro en cultivant CD34+ des cellules dans des conditions appropriées. Le protocole détaillé ici décrit l’isolement des CD34+ cellules par cellule magnétique de tri des échantillons de sang de cordon ombilical. Les mesures nécessaires pour produire des mégacaryocytes extrêmement purs, matures dans des conditions sans sérum sont décrites. Détails des analyses phénotypiques de la différenciation du mégacaryocyte et détermination des proplaquettes production formation et plaquettes sont également fournis. Effecteurs qui influencent la différenciation mégacaryocyte et/ou formation proplaquettes, tels que les anticorps antiplaquettaires ou mimétiques de la thrombopoïétine, peuvent être ajoutés à des cellules cultivées à examiner la fonction biologique.
Introduction
Isolement d’un nombre suffisant de mégacaryocytes humains primaires (MK) pour une utilisation régulière de laboratoire n’est pas possible en raison de leur faible fréquence dans la moelle osseuse, où ils représentent ~0.01% de cellules nucléées1. Une alternative commode est l’ex vivo de l’expansion et la différenciation des souches hématopoïétiques et des cellules progénitrices en présence de facteurs de croissance spécifiques. Un certain nombre de cytokines dont stem cell factor (SCF ; c-kit ligand) et interleukine (IL) -3 et IL-11 ont été utilisés dans les systèmes de culture pour produire MKs. thrombopoïétine (TPO) est le facteur de croissance et la différenciation plus efficace pour les cultures megakaryocytic et est efficace seul ou avec d’autres cytokines, telles que le SCF et l’IL-32. TPO peut agir sur les populations de cellules souches se traduire par la prolifération et la maturation de MKs2.
Plaquettes produits MK de protubérances cytoplasmiques appelées proplaquettes et, in vivo, environ 1 x 1011 plaquettes sont formés tous les jours pour soutenir les numérations plaquettaires de 150-400 x 109/l. plaquettes production in vitro est jusqu’à 1000 -plier plus bas que in vivo estime à3, et cela a donné lieu à nombreuses conditions de culture à l’aide de CD34+ cellules progénitrices hématopoïétiques pour améliorer MK et plaquettes production in vitro. La source initiale de CD34+ cellules utilisées pour la différenciation MK était de sang périphérique humain4. Autres sources de cellules incluent la moelle osseuse5,6, les cellules souches embryonnaires et induits pluripotentes cellules souches (ESC/iPSC)7et cordon ombilical sang (UCB)8,9,10 . La moelle osseuse humaine CD34+ 11 et la souris lignée négative la moelle osseuse des cellules5 produits MK et plaquettes in vitro; Néanmoins, le manque de disponibilité de la moelle osseuse humaine limite son utilisation comme source de CD34+ cellules. En revanche, ESC et iPSC représentent une source illimitée de cellules pour la production de plaquettes in vitro . Production de plaquettes de ces cellules nécessite des cellules nourricières tels que les cellules murines OP9 et de plus longues périodes de culture. Plaquettes dérivées dans des conditions sans chargeur semblent être moins fonctionnel12. iPSC-dérivé des plaquettes sont susceptibles d’être d’utilisation en milieu clinique, puisqu’ils peuvent être étendus à grande échelle. Ce processus nécessite transduction LENTIVIRAUX médiée par des facteurs de transcription et à long terme de la culture de cellule13.
UCB est une source accessible de CD34+ cellules qui peuvent être facilement utilisés dans les paramètres de recherche. TPO seul peut favoriser la différenciation du cordon de dérivés du sang CD34+ cellules et cela donne lieu à MKs extrêmement pur, mature sans besoin de supplémentation de sérum ou de co-culture avec des cellules nourricières. Autres cytokines telles que le SCF peut diminuer la différenciation de l’UCB CD34+ cellules, tandis que Flt-3 ligand et IL-11 favorisent la production de mégacaryocytes immatures14. Ce protocole décrit la production de cultures de MK très pures de sang de cordon ombilical CD34+ cellules dans des conditions de milieu sans sérum.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ici est adapté pour une production constante de MK et de plaquettes dans la culture du sang de cordon ombilical. Ces cellules peuvent servir à étudier les divers processus tels que l’effet de drogues ou d’activités biologiques sur MK prolifération, différenciation, proplaquettes formation et production de plaquettes.
Une variété de combinaisons de cytokines et de milieux de culture ont été présentés dans la littérature. Addition de cytokines telles que le …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à souligner le soutien de l’Australian Health and Medical Research Council (projet subvention 1012409 liée au BHC).
Materials
| Cell Culture Reagents | |||
| Recombinant Human TPO | Miltenyi Biotec | 130-094-013 | |
| StemSpan SFEM II | Stem Cell Technologies | 9605 | Serum-free media for CD34+ cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD34 Isolation Reagents | |||
| CD34 MicroBead kit ultrapure | Miltenyi Biotec | 130-100-453 | This kit includes the FcR human IgG blocking reagent and CD34 microbeads. These beads contain the anti-CD34 antibody clone QBEND/10. Use a different anti-CD34 clone for purity check (e.g. clone 8G12). |
| Lymphoprep | Alere Technologies | 1114545 | Lymphocyte separation media (density 1.077 g/mL) |
| Sterile separation buffer (SB) | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | This buffer contains phosphate buffered saline (PBS), pH 7.2 containing 0.5% bovine serum albumin and 2 mM EDTA. It can be prepared using sterile, cell culture grade components. De-gas before use because air bubbles can block the column. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow Cytometry and Cell Staining Reagents | |||
| PE Mouse anti-Human CD34 | BD Biosciences | 340669 | Clone 8G12. This can be used for CD34 purity check. Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| PerCP mouse anti-human CD45 | BD Biosciences | 347464 | 1:10 dilution |
| PerCP isotype control | BD Biosciences | 349044 | 1:10 dilution |
| FITC Mouse anti-Human CD41a | BD Biosciences | 340929 | Final antibody concentration 1:5 dilution. |
| APC Mouse anti-Human CD42b | BD Biosciences | 551061 | This antibody can also be used to detect mature MK (the percentage of positive cells in usually lower than with anti CD42a). Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human CD42a | AbD Serotec | MCA1227A647T | Currently distributed by Bio-Rad. Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| Alexa Fluor 647 Mouse Negative Control | AbD Serotec | MCA928A647 | Currently distributed by Bio-Rad. Isotype control antibody |
| Anti von Willebrand factor rabbit polyclonal | Abcam | AB6994 | 1:200 dilution |
| V450 mouse anti-humna CD41a | BD Biosciences | 58425 | 1: 20 dilution |
| V450 isotype control | BD Biosciences | 580373 | 1:20 dilution |
| PAC1-FITC antibody | BD Biosciences | 340507 | 1:10 dilution |
| Anti CD62p mouse monoclonal | Abcam | AB6632 | 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti rabbit IgG | Invitrogen | A11008 | 1:100 dilution |
| Alexa Fluor 594 goat anti mouse IgG | Invitrogen | A11020 | 1:100 dilution |
| Ig Isotype Control cocktail-C | BD Biosciences | 558659 | Isotype control antibody |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4864 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Molecular Probes, Invitrogen | C36950 | Counting beads |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Smaller and larger columns are also commercially available |
| MidiMACS Separator magnet | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Falcon 5mL round bottom polypropylene FACS tubes, with Snap Cap, Sterile | In Vitro technologies | 352063 | |
| Glass slides | Menzel-Glaser | J3800AMNZ | |
| Mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Antifade mounting medium with DAPI |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Inverted microscope | Leica | DMIRB inverted microscope | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | Vert.A1 | |
| Cell analyser | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Cytospin centrifuge | ThermoScientific | Cytospin 4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Cell analyser software | BD Biosciences | FACS Diva Software | |
| Single cell analysis software | Tree Star | FlowJo | |
| Fluorescent microscope software | Zeiss | Zen 2 blue edition |
References
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