Megakaryocyte 차별화와 인간에서 혈소판 형성 코드 혈액 파생 CD34+ 세포

Summary

매우 순수한 인구의 없으며 코드에서 얻어질 수 있다 혈액 유래 CD34⁺ 세포. CD34 방법⁺ 셀 고립과 megakaryocyte 차별화는 여기에 설명 된.

Abstract

혈소판 생산 thrombopoiesis로 알려진 프로세스에서 골 수에서 주로 발생 합니다. Thrombopoiesis, 동안 조 혈 조상 세포 형태 혈소판 선구자 라는 없으며, 말기 출시 되 나 proplatelets 긴 세포질 프로세스에서 혈소판 분화를 구분 합니다. 없으며 희귀 세포 골 수에 국한 되며 따라서 실험실 사용을 위해 충분 한 숫자에 수확 하기가. 인간의 없으며의 효율적인 생산 수 달성 생체 외에서 CD34 경작⁺ 적당 한 조건 하에서 세포. 여기서 설명 하는 프로토콜 CD34의 격리에 설명 합니다⁺ 탯 줄 혈액 샘플에서 정렬 하는 자기 셀에 의해 세포. 매우 순수 하 고, 성숙한 없으며 혈 청 무료 조건 하에서 생산 하는 필요한 단계를 설명 합니다. Megakaryocyte 차별화의 phenotypic 분석 및 proplatelet 형성 및 혈소판 생산의 결정도 제공 됩니다. 이펙터 megakaryocyte 차별화 및 항 혈소판 항 체 등 thrombopoietin mimetics proplatelet 형성에 영향을 주는 생물 학적 기능 검사 경작된 한 세포에 추가할 수 있습니다.

Introduction

일반 실험실 사용에 대 한 기본 인간의 없으며 (MK)의 충분 한 숫자의 절연은 ~0.01% nucleated 세포¹의 담당 그들은 골 수에서 낮은 주파수로 인해 가능 합니다. 편리한 대안 ex vivo 확장 및 조 혈 줄기와 조상 세포 특정 성장 요인의 존재의 차별화 이다. Megakaryocytic 문화에 대 한 가장 효과적인 성장과 차별화 요소는 MKs. Thrombopoietin (TPO) 생산 문화 시스템에서 고용 cytokines 줄기 세포 요소 (SCF; c-kit ligand), IL-11 및 인터 루 킨 (IL)-3 등의 숫자 되었습니다. 혼자 또는 다른 cytokines, SCF 및 IL-3²등 효과적 이다. TPO 확산 MKs²의 성숙에 결과 줄기 세포 인구에 작동할 수 있다.

Proplatelets 라는 세포질 돌출부에서 MK 생산 혈소판, vivo에서, 약 1 x 10¹¹ 혈소판은 최대 1000는 150-400 x 10⁹/L. 혈소판 생산에서 생체 외에서 혈소판 수를 유지 하기 위해 매일 형성 -배는

Protocol

이 프로토콜 남쪽 동부 쪽 시드니 인간의 연구 윤리 위원회에 의해 승인 하 고 대학의 뉴 사우스 웨일즈의 인간 연구 윤리 위원회에 의해 비준 되었다. 탯 줄 혈액 건강 한 기증자 로부터 얻은 의해 시드니 코드 혈액 은행 (시드니, NSW, 호주)를 제공 했다. 볼륨 약 100 mL의이 절차를 위해 사용 되었다.

참고: 클래스 II biosafety 무 균 기술을 사용 하 여 캐비닛에서 작동 합니다. 70% 에탄올과 코드 혈액 주머니의 외부 오염을 (가 위, 핀셋) 불 임 악기를 사용 하 여이 절차에 대 한.

1. 탯 줄 혈액 세포 준비 및 절연 CD34의⁺ 세포

1. 살 균 분리 버퍼 (SB) 버퍼링 하는 인산 염 (PBS), pH 7.2, 그리고 포함 된 0.5% 소 혈 청 알 부 민 및 2 mM EDTA를 준비 합니다.
2. (혈액 10 mL 당 1 개의 관은 필요) 50 mL 원뿔 관으로 SB의 10 mL를 분배. 10 mL 주사기에 장착 G18 무딘 바늘을 사용 하 여, 혈액 10 mL 가방에서 그리고 포함 하는 SB의 10 mL 50 mL 튜브로 분배.
3. 두 개의 레이어를 만드는 희석된 혈액을 포함 하는 관의 바닥에 림프....

Results

이 프로토콜 수 있습니다 매우 순수 MK 문화 코드에서의 준비 혈액 유래 CD34⁺ 세포. CD34의 비율⁺ 세포 탯 줄 혈액은 약 1.3¹⁵ (그림 1A)와 단 세포 (단계 1.8) 범위 90-300 x 10의 총 수 UCB 단위 당⁶ . CD34의 순도 + CD45 + 세포 격리 범위 90에서 99% (그림 1B) 후. MK (CD41 정의⁺ 세포) 혈 청 무료 CD34 초기에 관찰 된다⁺ 세포 rhTPO의 문화. 7 일에의 비율 MK 성숙 (CD41⁺ 및 CD42a⁺ 세포)은 일반적으로 30-40% (그림 1C). CD41 최고 .......

Discussion

여기에 설명 된 프로토콜은 MK와 문화 탯 줄 혈액에서 혈소판의 일관 생산에 적합 합니다. 이러한 세포 MK 확산, 감 별 법, proplatelet 형성 및 혈소판 생산에 마약 또는 생물 학적 활동의 효과 같은 다양 한 프로세스를 연구에 사용할 수 있습니다.

다양 한 문화 미디어와 cytokine 조합 문학에서 제시 되었다. ⁺ 줄기 세포 요소, Flt 3 ligand, 일리노이-3, 일리노이-6 지원 CD34 등 cytokines의 추가 확산 세포. 그러나,이 확장 문화¹⁴감소 MK 순수성에서 발생합니다. 혈 청 무료 미디어와 혼자, rhTPO를 사용 하 여, 여기에 제시 된 방법은 조상 세포의 중요 한 확장을 허용 하지 않습니다 하지만 unilineage megakaryocytic 확산 및 감 별 법 및 MK의 일관 된 생산 (90-99 %CD41⁺ CD42a⁺ 두 배 긍정.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
세포 배양 시약
재조합 인간 TPO	Miltenyi Biotec	130-094-013
StemSpan SFEM II	줄기 세포 기술	9605	CD34+ 세포용 무혈청 배지
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
CD34 분리 시약
CD34 MicroBead 키트 초순수	Miltenyi Biotec	130-100-453	이 키트에는 FcR human IgG 차단 시약과 CD34 마이크로비드가 포함되어 있습니다. 이 비드에는 항-CD34 항체 클론 QBEND/10이 포함되어 있습니다. 순도 검사를 위해 다른 anti-CD34 클론을 사용합니다(예: 클론 8G12).
Lymphoprep	Alere Technologies	1114545	림프구 분리 매체(밀도 1.077g/mL)
멸균 분리 완충액(SB)	Miltenyi Biotec	130-091-221	이 완충액에는 인산염 완충 식염수(PBS), pH 7.2, 0.5% 소 혈청 알부민 및 2mM EDTA가 포함되어 있습니다. 멸균된 세포 배양 등급 구성 요소를 사용하여 준비할 수 있습니다. 기포가 컬럼을 막을 수 있으므로 사용하기 전에 가스를 제거하십시오.
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
Flow Cytometry and Cell Staining Reagents
PE Mouse anti-Human CD34	BD Biosciences	340669	Clone 8G12. 이는 CD34 순도 검사에 사용할 수 있습니다. 최종 항체 농도 1:10 희석.
PerCP 마우스 anti-human CD45	BD Biosciences	347464	1:10 희석
PerCP isotype control	BD Biosciences	349044	1:10 희석
FITC Mouse anti-Human CD41a	BD Biosciences	340929	최종 항체 농도 1:5 희석.
APC Mouse anti-Human CD42b	BD Biosciences	551061	이 항체는 성숙한 MK(일반적으로 anti CD42a보다 낮은 양성 세포의 비율)를 검출하는 데에도 사용할 수 있습니다. 최종 항체 농도 1:10 희석.
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human CD42a	AbD Serotec	MCA1227A647T	현재 Bio-Rad에서 유통하고 있습니다. 최종 항체 농도 1:10 희석.
Alexa Fluor 647 마우스 음성 대조군	AbD Serotec	MCA928A647	현재 Bio-Rad에서 유통하고 있습니다. 동형 대조군 항체
안티 폰 빌레브란트 인자 토끼 다클론	Abcam	AB6994	1:200 희석
V450 마우스 안티-humna CD41a	BD Biosciences	58425	1:20 희석
V450 동형 대조군	BD Biosciences	580373	1:20 희석
PAC1-FITC 항체	BD Biosciences	340507	1:10 희석
Anti CD62p 마우스 단클론	Abcam	AB6632	1:200 희석
Alexa Fluor 488 염소 안티 토끼 IgG	Invitrogen	A11008	1:100 희석
Alexa Fluor 594 염소 안티 마우스 IgG	Invitrogen	A11020	1:100 희석
Ig Isotype Control cocktail-C	BD Biosciences	558659	Isotype control 항체
Propidium iodide	Sigma Aldrich	P4864
CountBright 절대 계수 비드	분자 프로브, Invitrogen	C36950	계수 비드
Name	Company	strong>카탈로그 번호	Comments
Materials
LS 컬럼	Miltenyi Biotec	130-042-401	더 작고 더 큰 칼럼도 상업적으로 이용 가능
MidiMACS 분리기 자석	Miltenyi Biotec	130-042-302
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Falcon 5mL 둥근 바닥 폴리 프로필렌 FACS 튜브, 스냅 캡 포함, 멸균	체외 기술	352063
유리 슬라이드	Menzel-Glaser	J3800AMNZ
DAPI	Vector Laboratories	마운팅 미디어 H-1200	안티페이드 마운팅 미디어< DAPIstrong
>Name	Company	카탈로그 번호	Comments
Equipment
도립 현미경	Leica	DMIRB 도립 현미경
형광 현미경	Zeiss	Vert.A1
세포 분석기	BD Biosciences	FACS Canto II
Cytospin 원심 분리기	ThermoScientific	Cytospin 4
Name	Company	Catalog 번호	Comments
Software
세포 분석기 소프트웨어	BD Biosciences	FACS Diva Software
단세포 분석 소프트웨어	Tree Star	FlowJo
형광 현미경 소프트웨어	Zeiss	Zen 2 블루 에디션