Megakaryocyte التمايز وتكوين الصفائح الدموية من الإنسان الحبل CD34 المستمدة من الدم الخلايا+
Summary
يمكن الحصول على جمهرة نقية جداً من ميجاكاريوسيتيس من الحبل CD34 المستمدة من الدم+ الخلايا. أسلوب ل CD34+ التمايز العزلة و megakaryocyte خلية يرد هنا.
Abstract
إنتاج الصفائح الدموية يحدث أساسا في نخاع العظام في عملية تعرف باسم ثرومبوبويسيس. أثناء ثرومبوبويسيس، التفريق بين الخلايا المكونة للدم السلف للسلائف الصفيحات نموذج يسمى ميجاكاريوسيتيس، التي تميز الميؤوس من شفائهم للإفراج عن الصفائح الدموية من عمليات طويلة هيولى يسمى بروبلاتيليتس. ميجاكاريوسيتيس هي خلايا نادرة تنحصر في نخاع العظام ولذلك يصعب على الحصاد بإعداد كافية للاستخدامات المختبرية. كفاءة إنتاج megakaryocytes البشرية يمكن أن يتحقق في المختبر باستزراع CD34+ الخلايا تحت ظروف مناسبة. وصف البروتوكول بالتفصيل هنا عزل CD34+ الخلايا بالخلية المغناطيسية الفرز من عينات دم الحبل السري. يتم وصف الخطوات اللازمة لإنتاج megakaryocytes عالية نقية وناضجة تحت ظروف خالية من المصل. كما يتم توفير التفاصيل المظهرية تحليل التمايز ميجاكاريوسيتي والتصميم لإنتاج بروبلاتيليت في تشكيل والصفائح الدموية. يمكن إضافة المستجيبة التي تؤثر على التمايز ميجاكاريوسيتي و/أو تشكيل بروبلاتيليت، مثل mimetics ثرومبوبويتين، أو الأجسام المضادة الصفيحات للخلايا المزروعة لدراسة الوظيفة البيولوجية.
Introduction
عزل عدد كاف من ميجاكاريوسيتيس البشرية الأولية (MK) للاستخدامات المختبرية العادية ليس ممكناً بسبب ما تردد منخفض في نخاع العظام، حيث أنها تمثل ~0.01% للخلايا المنواه1. وهو بديلاً ملائماً السابقين فيفو التوسع والتمايز الجذعية المكونة للدم والخلايا السلف حضور عوامل نمو محددة. كان عدد من السيتوكينات بما في ذلك معامل الخلايا الجذعية (صندوق إنقاذ الطفولة؛ ج-طقم يجند) وانترلوكين (إيل)-3 وايل-11 المستخدمة في نظم الاستزراع لإنتاج أعضاء الكنيست-ثرومبوبويتين (TPO) هو عامل نمو وتمايز الأكثر فعالية للثقافات ميجاكاريوسيتيك وهو فعال وحدها أو مع السيتوكينات الأخرى، مثل صندوق إنقاذ الطفولة وايل-32. يمكن أن يعمل TPO على السكان الخلايا الجذعية تسفر عن انتشار ونضوج أعضاء الكنيست2.
عضو الكنيست إنتاج الصفائح الدموية من هيولى نتوءات تسمى بروبلاتيليتس، و الحية، حوالي 1 × 1011 الصفائح تشكيل يوميا للحفاظ على حساب الصفائح الدموية من 150-400 × 109الصفيحات/L. الإنتاج في المختبر هو يصل إلى 1000 -إضعاف أقل من التقديرات في فيفو 3، وهذا قد أدى إلى العديد من شروط ثقافة استخدام CD34+ الخلايا المكونة للدم السلف لتحسين عضو الكنيست والصفائح الدموية الإنتاج في المختبر. المصدر الأولى ل CD34+ الخلايا المستخدمة للتمييز بين عضو الكنيست كان الدم المحيطي البشري4. تشمل المصادر الأخرى خلية نخاع العظم5،6، والخلايا الجذعية الجنينية/التي يسببها pluripotent الخلايا الجذعية (ESC/اللجنة التوجيهية)7، والحبل السري الدم (UCB)8،9،10 . نخاع العظام البشرية CD34+ 11 والماوس النسب نخاع العظم سلبية الخلايا5 إنتاج عضو الكنيست والصفائح الدموية في المختبر؛ ومع ذلك، عدم توافر نخاع العظام البشرية يحد من استخدامه كمصدر ل CD34+ الخلايا. وفي المقابل، ESC واللجنة التوجيهية تمثل مصدرا غير محدود من الخلايا في المختبر إنتاج الصفائح الدموية. ويتطلب إنتاج الصفائح الدموية من هذه الخلايا الخلايا المغذية مثل مورين OP9 الخلايا وفترات أطول من الثقافة. الصفائح الدموية المستمدة في ظروف خالية من علبة التغذية بالورق، على ما يبدو، وظيفية أقل من12. الصفائح الدموية المستمدة من اللجنة التوجيهية من المحتمل أن يكون للاستخدام في ظروف سريرية حيث أنها يمكن توسيعها لنطاق واسع. وهذه العملية تتطلب توصيل لينتيفيرال بوساطة عوامل النسخ و ثقافة خلية طويل الأجل13.
UCB مصدر موجوداً من CD34+ الخلايا التي يمكن استخدامها في سهولة البحث إعدادات. TPO وحدها يمكن أن يعزز تمايز الحبل CD34 المستمدة من الدم+ الخلايا وهذا يؤدي إلى أعضاء الكنيست نقية جداً وناضجة دون الحاجة إلى مكملات مصل أو الثقافة المشتركة مع الخلايا المغذية. السيتوكينات الأخرى مثل صندوق إنقاذ الطفولة قد إنقاص التمايز من UCB CD34+ الخلايا، بينما يجند أنطوني-3 وايل-11 تشجيع الإنتاج غير ناضجة ميجاكاريوسيتيس14. ويصف هذا البروتوكول إنتاج عالية نقية الثقافات عضو الكنيست من دم الحبل السري CD34+ الخلايا في ظروف خالية من المصل.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكول الموصوفة هنا مناسبة لإنتاج متسقة لعضو الكنيست والصفائح الدموية في الثقافة من دم الحبل السري. يمكن استخدام هذه الخلايا لدراسة مختلف العمليات مثل تأثير المخدرات أو الأنشطة البيولوجية على انتشار عضو الكنيست، والتمايز، وتشكيل بروبلاتيليت، وإنتاج الصفائح الدموية.
<p class="jove_content"…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب تقر بالدعم “الصحي الأسترالي” و “مجلس البحوث الطبية” (مشروع المنح 1012409 مرتبطة بالبيلاروسية).
Materials
| Cell Culture Reagents | |||
| Recombinant Human TPO | Miltenyi Biotec | 130-094-013 | |
| StemSpan SFEM II | Stem Cell Technologies | 9605 | Serum-free media for CD34+ cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD34 Isolation Reagents | |||
| CD34 MicroBead kit ultrapure | Miltenyi Biotec | 130-100-453 | This kit includes the FcR human IgG blocking reagent and CD34 microbeads. These beads contain the anti-CD34 antibody clone QBEND/10. Use a different anti-CD34 clone for purity check (e.g. clone 8G12). |
| Lymphoprep | Alere Technologies | 1114545 | Lymphocyte separation media (density 1.077 g/mL) |
| Sterile separation buffer (SB) | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | This buffer contains phosphate buffered saline (PBS), pH 7.2 containing 0.5% bovine serum albumin and 2 mM EDTA. It can be prepared using sterile, cell culture grade components. De-gas before use because air bubbles can block the column. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow Cytometry and Cell Staining Reagents | |||
| PE Mouse anti-Human CD34 | BD Biosciences | 340669 | Clone 8G12. This can be used for CD34 purity check. Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| PerCP mouse anti-human CD45 | BD Biosciences | 347464 | 1:10 dilution |
| PerCP isotype control | BD Biosciences | 349044 | 1:10 dilution |
| FITC Mouse anti-Human CD41a | BD Biosciences | 340929 | Final antibody concentration 1:5 dilution. |
| APC Mouse anti-Human CD42b | BD Biosciences | 551061 | This antibody can also be used to detect mature MK (the percentage of positive cells in usually lower than with anti CD42a). Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human CD42a | AbD Serotec | MCA1227A647T | Currently distributed by Bio-Rad. Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| Alexa Fluor 647 Mouse Negative Control | AbD Serotec | MCA928A647 | Currently distributed by Bio-Rad. Isotype control antibody |
| Anti von Willebrand factor rabbit polyclonal | Abcam | AB6994 | 1:200 dilution |
| V450 mouse anti-humna CD41a | BD Biosciences | 58425 | 1: 20 dilution |
| V450 isotype control | BD Biosciences | 580373 | 1:20 dilution |
| PAC1-FITC antibody | BD Biosciences | 340507 | 1:10 dilution |
| Anti CD62p mouse monoclonal | Abcam | AB6632 | 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti rabbit IgG | Invitrogen | A11008 | 1:100 dilution |
| Alexa Fluor 594 goat anti mouse IgG | Invitrogen | A11020 | 1:100 dilution |
| Ig Isotype Control cocktail-C | BD Biosciences | 558659 | Isotype control antibody |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4864 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Molecular Probes, Invitrogen | C36950 | Counting beads |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Smaller and larger columns are also commercially available |
| MidiMACS Separator magnet | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Falcon 5mL round bottom polypropylene FACS tubes, with Snap Cap, Sterile | In Vitro technologies | 352063 | |
| Glass slides | Menzel-Glaser | J3800AMNZ | |
| Mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Antifade mounting medium with DAPI |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Inverted microscope | Leica | DMIRB inverted microscope | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | Vert.A1 | |
| Cell analyser | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Cytospin centrifuge | ThermoScientific | Cytospin 4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Cell analyser software | BD Biosciences | FACS Diva Software | |
| Single cell analysis software | Tree Star | FlowJo | |
| Fluorescent microscope software | Zeiss | Zen 2 blue edition |
References
- Nakeff, A., Maat, B. Separation of megakaryocytes from mouse bone marrow by velocity sedimentation. Blood. 43 (4), 591-595 (1974).
- Zeigler, F. C., et al. In vitro megakaryocytopoietic and thrombopoietic activity of c-mpl ligand (TPO) on purified murine hematopoietic stem cells. Blood. 84 (12), 4045-4052 (1994).
- Reems, J. -. A., Pineault, N., Sun, S. In Vitro Megakaryocyte Production and Platelet Biogenesis: State of the Art. Transfus. Med. Rev. 24 (1), 33-43 (2010).
- Choi, E., Nichol, J. L., Hokom, M. M., Hornkohl, A. C., Hunt, P. Platelets generated in vitro from proplatelet-displaying human megakaryocytes are functional. Blood. 85 (2), 402-413 (1995).
- Perdomo, J., et al. A monopartite sequence is essential for p45 NF-E2 nuclear translocation, transcriptional activity and platelet production. J Thromb Haemost. 8 (11), 2542-2553 (2010).
- Shim, M. H., Hoover, A., Blake, N., Drachman, J. G., Reems, J. A. Gene expression profile of primary human CD34+CD38lo cells differentiating along the megakaryocyte lineage. Exp Hematol. 32 (7), 638-648 (2004).
- Feng, Q., et al. Scalable generation of universal platelets from human induced pluripotent stem cells. Stem cell reports. 3 (5), 817-831 (2014).
- Bruno, S., et al. In vitro and in vivo megakaryocyte differentiation of fresh and ex-vivo expanded cord blood cells: rapid and transient megakaryocyte reconstitution. Haematologica. 88 (4), 379-387 (2003).
- Iraqi, M., Perdomo, J., Yan, F., Choi, P. Y. I., Chong, B. H. Immune thrombocytopenia: antiplatelet autoantibodies inhibit proplatelet formation by megakaryocytes and impair platelet production in vitro. Haematologica. 100 (5), 623-632 (2015).
- Lev, P. R., et al. Impaired proplatelet formation in immune thrombocytopenia: a novel mechanism contributing to decreased platelet count. Br. J. Haematol. 165 (6), 854-864 (2014).
- Gandhi, M. J., Drachman, J. G., Reems, J. A., Thorning, D., Lannutti, B. J. A novel strategy for generating platelet-like fragments from megakaryocytic cell lines and human progenitor cells. Blood Cells Mol. Dis. 35 (1), 70-73 (2005).
- Lu, S. -. J., et al. Platelets generated from human embryonic stem cells are functional in vitro and in the microcirculation of living mice. Cell Res. 21 (3), 530-545 (2011).
- Moreau, T., et al. Large-scale production of megakaryocytes from human pluripotent stem cells by chemically defined forward programming. Nature Commun. 7, 11208 (2016).
- De Bruyn, C., Delforge, A., Martiat, P., Bron, D. Ex vivo expansion of megakaryocyte progenitor cells: cord blood versus mobilized peripheral blood. Stem Cells Dev. 14 (4), 415-424 (2005).
- Nimgaonkar, M. T., et al. A unique population of CD34+ cells in cord blood. Stem cells. 13 (2), 158-166 (1995).
- Italiano, J. E., Patel-Hett, S., Hartwig, J. H. Mechanics of proplatelet elaboration. J Thromb Haemost. 5, 18-23 (2007).
- Matsunaga, T., et al. Ex vivo large-scale generation of human platelets from cord blood CD34+ cells. Stem cells. 24 (12), 2877-2887 (2006).
- Sullenbarger, B., Bahng, J. H., Gruner, R., Kotov, N., Lasky, L. C. Prolonged continuous in vitro human platelet production using three-dimensional scaffolds. Exp Hematol. 37 (1), 101-110 (2009).
- Proulx, C., Boyer, L., Hurnanen, D. R., Lemieux, R. Preferential ex vivo expansion of megakaryocytes from human cord blood CD34+-enriched cells in the presence of thrombopoietin and limiting amounts of stem cell factor and Flt-3 ligand. J. Hematother. Stem Cell Res. 12 (2), 179-188 (2003).
- Bornstein, R., Garcia-Vela, J., Gilsanz, F., Auray, C., Cales, C. Cord blood megakaryocytes do not complete maturation, as indicated by impaired establishment of endomitosis and low expression of G1/S cyclins upon thrombopoietin-induced differentiation. Br. J. Haematol. 114 (2), 458-465 (2001).
- Chong, B. H., Choi, P. Y. I., Khachigian, L., Perdomo, J. Drug-induced Immune Thrombocytopenia. Hematol Oncol Clin North Am. 27 (3), (2013).
- Stasi, R., et al. Idiopathic thrombocytopenic purpura: Current concepts in pathophysiology and management. Thromb Haemost. 99 (1), 4-13 (2008).
