La differenziazione dei megacariociti e formazione delle piastrine da umani cavo emoderivati CD34 cellule+
Summary
Una popolazione altamente pura dei megacariociti sono ottenibili dal midollo derivate dal sangue CD34+ cellule. Un metodo per CD34+ differenziazione megacariocita e isolamento delle cellule è descritto qui.
Abstract
La produzione della piastrina si verifica principalmente nel midollo osseo in un processo noto come thrombopoiesis. Durante thrombopoiesis, cellule progenitrici ematopoietiche differenziano ai precursori delle piastrine forma chiamati megacariociti, che differenziano terminalmente per rilasciare le piastrine da processi citoplasmici lungo definiti associato. I megacariociti sono confinate al midollo osseo le cellule rare e sono quindi difficili da raccogliere in numero sufficiente per uso di laboratorio. Produzione efficiente di megacariociti umani può essere raggiunto in vitro coltivando CD34+ cellule nelle circostanze adatte. Il protocollo dettagliato qui descrive l’isolamento di CD34 cellule di+ da magnetico cella ordinamento da campioni di sangue del cordone ombelicale. Sono descritti i passi necessari per la produzione di megacariociti altamente puri, maturi nelle circostanze senza siero. Dettagli di analisi fenotipica di differenziamento megacariocitico e determinazione della produzione della piastrina e di formazione a disposizione. Gli effettori che influenzano la differenziazione dei megacariociti e/o a formazione, quali gli anticorpi anti-piastrine o mimetics della trombopoietina, possono essere aggiunti alle cellule coltivate per esaminare la funzione biologica.
Introduction
Isolamento di un numero adeguato di megacariociti umani primari (MK) per uso di laboratorio regolari non è fattibile a causa della loro bassa frequenza nel midollo osseo, dove rappresentano ~0.01% di cellule nucleate1. Una comoda alternativa è l’espansione ex vivo e la differenziazione delle staminali ematopoietiche e cellule progenitrici in presenza di specifici fattori di crescita. Una serie di citochine, compreso il fattore di cellula formativa (SCF; c-kit ligando) e interleuchina (IL) -3 e IL-11 è stati impiegati in sistemi di coltura per produrre MKs. Thrombopoietin (TPO) è il fattore più efficace di crescita e differenziazione megakaryocytic culture ed è efficace da solo o con altre citochine, quali SCF e IL-32. TPO può agire su popolazioni di cellule staminali per provocare la proliferazione e la maturazione di MKs2.
Le piastrine di produrre MK da protrusioni citoplasmatiche chiamati associato e, in vivo, circa 1 x 1011 piastrine sono formate ogni giorno per sostenere la conta piastrinica di 150-400 x 109produzione /L. piastrinica in vitro è fino a 1000 -piegare inferiori lo in vivo stima3, e ciò ha dato luogo a numerose condizioni di coltura utilizzando CD34+ cellule progenitrici ematopoietiche per migliorare della piastrina e MK produzione in vitro. La fonte iniziale di CD34+ celle utilizzate per il differenziamento di MK era sangue periferico umano4. Includono altre fonti di cellule del midollo osseo5,6, cellule staminali embrionali/induced pluripotent cellule staminali (ESC/iPSC)7e cordone ombelicale sangue (UCB)8,9,10 . Midollo osseo umano CD34+ 11 e mouse lignaggio negativo del midollo osseo cellule5 prodotti MK e piastrine in vitro; Tuttavia, la mancanza di disponibilità del midollo osseo umano limita il suo uso come fonte di CD34+ cellule. Al contrario, ESC e iPSC rappresentano una fonte illimitata di cellule per la produzione della piastrina in vitro . La produzione della piastrina da queste cellule richiede le cellule di alimentatore come cellule murine OP9 e periodi più lunghi di cultura. Le piastrine derivate in condizioni prive di alimentatore sembrano essere meno funzionale12. iPSC-derivato piastrine rischiano di essere di uso nelle regolazioni cliniche, dal momento che può essere espansa a larga scala. Questo processo richiede trasduzione lentivirale-mediata di fattori di trascrizione e a lungo termine delle cellule cultura13.
UCB è una fonte accessibile di CD34+ cellule che possono essere facilmente utilizzate in impostazioni di ricerca. TPO da solo può promuovere la differenziazione del midollo derivate dal sangue CD34+ cellule e questo dà luogo ad elevata purezza, maturo MKs senza l’esigenza del completamento del siero o co-coltura con le cellule di alimentatore. Altre citochine come SCF può diminuire la differenziazione da UCB CD34 cellule+ , mentre ligando Flt-3 e IL-11 promuovere la produzione di megacariociti acerbi14. Questo protocollo descrive la produzione di colture altamente pure MK cordonali CD34+ cellule nelle circostanze senza siero.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo descritto qui è adatto a produzione costante MK e piastrine in coltura dal sangue del cordone ombelicale. Queste cellule possono essere utilizzate per studiare i vari processi come l’effetto di droghe o di attività biologiche su MK proliferazione, differenziazione, a formazione e produzione della piastrina.
Una varietà di terreni di coltura e combinazioni di citochina sono stati presentati nella letteratura. Addizione di citochine come il fattore di cellula formativa, ligando …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono il supporto del Australian Health and Medical Research Council (progetto grant 1012409 collegato a BHC).
Materials
| Cell Culture Reagents | |||
| Recombinant Human TPO | Miltenyi Biotec | 130-094-013 | |
| StemSpan SFEM II | Stem Cell Technologies | 9605 | Serum-free media for CD34+ cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD34 Isolation Reagents | |||
| CD34 MicroBead kit ultrapure | Miltenyi Biotec | 130-100-453 | This kit includes the FcR human IgG blocking reagent and CD34 microbeads. These beads contain the anti-CD34 antibody clone QBEND/10. Use a different anti-CD34 clone for purity check (e.g. clone 8G12). |
| Lymphoprep | Alere Technologies | 1114545 | Lymphocyte separation media (density 1.077 g/mL) |
| Sterile separation buffer (SB) | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | This buffer contains phosphate buffered saline (PBS), pH 7.2 containing 0.5% bovine serum albumin and 2 mM EDTA. It can be prepared using sterile, cell culture grade components. De-gas before use because air bubbles can block the column. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow Cytometry and Cell Staining Reagents | |||
| PE Mouse anti-Human CD34 | BD Biosciences | 340669 | Clone 8G12. This can be used for CD34 purity check. Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| PerCP mouse anti-human CD45 | BD Biosciences | 347464 | 1:10 dilution |
| PerCP isotype control | BD Biosciences | 349044 | 1:10 dilution |
| FITC Mouse anti-Human CD41a | BD Biosciences | 340929 | Final antibody concentration 1:5 dilution. |
| APC Mouse anti-Human CD42b | BD Biosciences | 551061 | This antibody can also be used to detect mature MK (the percentage of positive cells in usually lower than with anti CD42a). Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human CD42a | AbD Serotec | MCA1227A647T | Currently distributed by Bio-Rad. Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| Alexa Fluor 647 Mouse Negative Control | AbD Serotec | MCA928A647 | Currently distributed by Bio-Rad. Isotype control antibody |
| Anti von Willebrand factor rabbit polyclonal | Abcam | AB6994 | 1:200 dilution |
| V450 mouse anti-humna CD41a | BD Biosciences | 58425 | 1: 20 dilution |
| V450 isotype control | BD Biosciences | 580373 | 1:20 dilution |
| PAC1-FITC antibody | BD Biosciences | 340507 | 1:10 dilution |
| Anti CD62p mouse monoclonal | Abcam | AB6632 | 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti rabbit IgG | Invitrogen | A11008 | 1:100 dilution |
| Alexa Fluor 594 goat anti mouse IgG | Invitrogen | A11020 | 1:100 dilution |
| Ig Isotype Control cocktail-C | BD Biosciences | 558659 | Isotype control antibody |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4864 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Molecular Probes, Invitrogen | C36950 | Counting beads |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Smaller and larger columns are also commercially available |
| MidiMACS Separator magnet | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Falcon 5mL round bottom polypropylene FACS tubes, with Snap Cap, Sterile | In Vitro technologies | 352063 | |
| Glass slides | Menzel-Glaser | J3800AMNZ | |
| Mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Antifade mounting medium with DAPI |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Inverted microscope | Leica | DMIRB inverted microscope | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | Vert.A1 | |
| Cell analyser | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Cytospin centrifuge | ThermoScientific | Cytospin 4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Cell analyser software | BD Biosciences | FACS Diva Software | |
| Single cell analysis software | Tree Star | FlowJo | |
| Fluorescent microscope software | Zeiss | Zen 2 blue edition |
References
- Nakeff, A., Maat, B. Separation of megakaryocytes from mouse bone marrow by velocity sedimentation. Blood. 43 (4), 591-595 (1974).
- Zeigler, F. C., et al. In vitro megakaryocytopoietic and thrombopoietic activity of c-mpl ligand (TPO) on purified murine hematopoietic stem cells. Blood. 84 (12), 4045-4052 (1994).
- Reems, J. -. A., Pineault, N., Sun, S. In Vitro Megakaryocyte Production and Platelet Biogenesis: State of the Art. Transfus. Med. Rev. 24 (1), 33-43 (2010).
- Choi, E., Nichol, J. L., Hokom, M. M., Hornkohl, A. C., Hunt, P. Platelets generated in vitro from proplatelet-displaying human megakaryocytes are functional. Blood. 85 (2), 402-413 (1995).
- Perdomo, J., et al. A monopartite sequence is essential for p45 NF-E2 nuclear translocation, transcriptional activity and platelet production. J Thromb Haemost. 8 (11), 2542-2553 (2010).
- Shim, M. H., Hoover, A., Blake, N., Drachman, J. G., Reems, J. A. Gene expression profile of primary human CD34+CD38lo cells differentiating along the megakaryocyte lineage. Exp Hematol. 32 (7), 638-648 (2004).
- Feng, Q., et al. Scalable generation of universal platelets from human induced pluripotent stem cells. Stem cell reports. 3 (5), 817-831 (2014).
- Bruno, S., et al. In vitro and in vivo megakaryocyte differentiation of fresh and ex-vivo expanded cord blood cells: rapid and transient megakaryocyte reconstitution. Haematologica. 88 (4), 379-387 (2003).
- Iraqi, M., Perdomo, J., Yan, F., Choi, P. Y. I., Chong, B. H. Immune thrombocytopenia: antiplatelet autoantibodies inhibit proplatelet formation by megakaryocytes and impair platelet production in vitro. Haematologica. 100 (5), 623-632 (2015).
- Lev, P. R., et al. Impaired proplatelet formation in immune thrombocytopenia: a novel mechanism contributing to decreased platelet count. Br. J. Haematol. 165 (6), 854-864 (2014).
- Gandhi, M. J., Drachman, J. G., Reems, J. A., Thorning, D., Lannutti, B. J. A novel strategy for generating platelet-like fragments from megakaryocytic cell lines and human progenitor cells. Blood Cells Mol. Dis. 35 (1), 70-73 (2005).
- Lu, S. -. J., et al. Platelets generated from human embryonic stem cells are functional in vitro and in the microcirculation of living mice. Cell Res. 21 (3), 530-545 (2011).
- Moreau, T., et al. Large-scale production of megakaryocytes from human pluripotent stem cells by chemically defined forward programming. Nature Commun. 7, 11208 (2016).
- De Bruyn, C., Delforge, A., Martiat, P., Bron, D. Ex vivo expansion of megakaryocyte progenitor cells: cord blood versus mobilized peripheral blood. Stem Cells Dev. 14 (4), 415-424 (2005).
- Nimgaonkar, M. T., et al. A unique population of CD34+ cells in cord blood. Stem cells. 13 (2), 158-166 (1995).
- Italiano, J. E., Patel-Hett, S., Hartwig, J. H. Mechanics of proplatelet elaboration. J Thromb Haemost. 5, 18-23 (2007).
- Matsunaga, T., et al. Ex vivo large-scale generation of human platelets from cord blood CD34+ cells. Stem cells. 24 (12), 2877-2887 (2006).
- Sullenbarger, B., Bahng, J. H., Gruner, R., Kotov, N., Lasky, L. C. Prolonged continuous in vitro human platelet production using three-dimensional scaffolds. Exp Hematol. 37 (1), 101-110 (2009).
- Proulx, C., Boyer, L., Hurnanen, D. R., Lemieux, R. Preferential ex vivo expansion of megakaryocytes from human cord blood CD34+-enriched cells in the presence of thrombopoietin and limiting amounts of stem cell factor and Flt-3 ligand. J. Hematother. Stem Cell Res. 12 (2), 179-188 (2003).
- Bornstein, R., Garcia-Vela, J., Gilsanz, F., Auray, C., Cales, C. Cord blood megakaryocytes do not complete maturation, as indicated by impaired establishment of endomitosis and low expression of G1/S cyclins upon thrombopoietin-induced differentiation. Br. J. Haematol. 114 (2), 458-465 (2001).
- Chong, B. H., Choi, P. Y. I., Khachigian, L., Perdomo, J. Drug-induced Immune Thrombocytopenia. Hematol Oncol Clin North Am. 27 (3), (2013).
- Stasi, R., et al. Idiopathic thrombocytopenic purpura: Current concepts in pathophysiology and management. Thromb Haemost. 99 (1), 4-13 (2008).
