Megakaryocyt differentiatie en bloedplaatjes vorming van mens koord bloed afkomstige CD34+ cellen
Summary
Een zeer zuivere bevolking van megakaryocytes kan worden verkregen van koord bloed afkomstige CD34+ cellen. Een methode voor CD34+ celdifferentiatie isolatie en Megakaryocyt is hier beschreven.
Abstract
Bloedplaatjes productie komt voornamelijk in het beenmerg in een proces dat bekend staat als thrombopoiesis. Tijdens thrombopoiesis onderscheid hematopoïetische voorlopercellen naar vorm bloedplaatjes precursoren genaamd megakaryocytes, die terminaal differentiëren om bloedplaatjes van lang cytoplasmatische processen genoemd proplatelets vrij te geven. Megakaryocytes zijn zeldzame cellen beperkt tot het beenmerg en zijn daarom moeilijk om te oogsten in voldoende aantallen voor laboratoriumgebruik. Efficiënte productie van menselijke megakaryocytes kan worden bereikt in vitro door het kweken van CD34+ cellen onder adequate omstandigheden. Het protocol hier gedetailleerde beschrijving Isolatievan CD34+ cellen door magnetische cel sorteren van bloedmonsters van de navelstreng. De nodige maatregelen om het produceren van zeer zuivere, volwassen megakaryocytes onder serumvrij voorwaarden worden beschreven. Details van fenotypische analyse van differentiatie van de Megakaryocyt en bepaling van de proplatelet formatie en bloedplaatjes productie zijn ook aanwezig. Effectoren die van invloed zijn Megakaryocyt differentiatie en/of de vorming van de proplatelet, zoals anti-bloedplaatjes antilichamen of thrombopoietin mimetics, kunnen worden toegevoegd aan gekweekte cellen te bestuderen van de biologische functie.
Introduction
Isolatie van een voldoende aantal primaire menselijke megakaryocytes (MK) voor regelmatige laboratoriumgebruik is niet haalbaar vanwege hun lage frequentie in het beenmerg, waar ze goed voor ~0.01% voor genucleëerde cellen1. Een handig alternatief is de ex vivo uitbreiding en differentiatie van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen in de aanwezigheid van bepaalde groeifactoren. Een aantal cytokines waaronder stamcel factor (SCF; c-kit ligand) en Interleukine (IL) -3 en IL-11 geweest is werkzaam in cultuur systemen te produceren MKs. Thrombopoietin (TPO) de meest effectieve groei en differentiatie factor voor megakaryocytic culturen en is effectief, alleen of samen met andere cytokines, zoals SCF en IL-32. TPO kan optreden op de populaties van de cel van de stam leiden tot zowel de proliferatie en de rijping van MKs2.
MK producten bloedplaatjes van cytoplasmatische uitsteeksels genaamd proplatelets en, in vivo, ongeveer 1 x 1011 bloedplaatjes worden is gevormd dagelijks om bloedplaatjes graven van 150-400 x 109muurkast bloedplaatjes productie in vitro tot 1000 -Vouw lager dan de in vivo 3 schat, en dit heeft aanleiding gegeven tot talrijke kweekomstandigheden met behulp van CD34+ hematopoïetische voorlopercellen te verbeteren MK en bloedplaatjes productie in vitro. De eerste bron van CD34+ cellen die worden gebruikt voor MK differentiatie was perifere bloed4. Andere mobiele bronnen omvatten beenmerg5,6, embryonale stamcellen/geïnduceerde pluripotente stamcellen (ESC/iPSC)7en navelstreng bloed (UCB)8,9,10 . Menselijke beenmerg CD34+ 11 en muis lineage negatieve beenmerg cellen5 produceren MK en bloedplaatjes in vitro; echter het gebrek aan beschikbaarheid van menselijke beenmerg beperkt het gebruik ervan als een bron van CD34+ cellen. In tegenstelling, vertegenwoordigen ESC en iPSC een onbeperkte bron van cellen voor in vitro bloedplaatjes productie. Bloedplaatjes productie van deze cellen vereist feeder cellen zoals lymfkliertest OP9 cellen en langere cultuur. Bloedplaatjes afgeleid in feeder-vrij voorwaarden lijken minder functionele12. iPSC afkomstige bloedplaatjes dreigen te worden voor gebruik in klinische instellingen aangezien zij kunnen worden uitgebreid tot een grote schaal. Dit proces vereist lentivirale-gemedieerde transductie van transcriptiefactoren en op lange termijn cel cultuur13.
UCB is een toegankelijke bron van CD34+ cellen die gemakkelijk kunnen worden gebruikt in onderzoek instellingen. Alleen TPO kan bevorderen differentiatie van koord bloed afkomstige CD34+ cellen en dit leidt tot zeer zuivere, volwassen MKs zonder de noodzaak van serum suppletie of co cultuur met feeder cellen. Andere cytokines zoals SCF kan afnemen differentiatie van UCB CD34+ cellen, terwijl Flt-3 ligand en IL-11 de productie van onrijpe megakaryocytes14 bevorderen. Dit protocol beschrijft de productie van zeer zuivere MK culturen uit navelstrengbloed CD34+ cellen in serumvrij voorwaarden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het protocol hier beschreven is geschikt voor de constante productie van MK en bloedplaatjes in de cultuur van navelstrengbloed. Deze cellen kunnen worden gebruikt om verschillende processen zoals het effect van geneesmiddelen of biologische activiteiten op MK proliferatie, differentiatie, proplatelet formatie en bloedplaatjes productie te bestuderen.
Een verscheidenheid van cultuurmedia en cytokine combinaties zijn aangebracht in de literatuur. Toevoeging van cytokinen zoals stamcel factor, F…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen de steun van de Australische Health and Medical Research Council (project subsidie 1012409 gekoppeld aan BHC).
Materials
| Cell Culture Reagents | |||
| Recombinant Human TPO | Miltenyi Biotec | 130-094-013 | |
| StemSpan SFEM II | Stem Cell Technologies | 9605 | Serum-free media for CD34+ cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD34 Isolation Reagents | |||
| CD34 MicroBead kit ultrapure | Miltenyi Biotec | 130-100-453 | This kit includes the FcR human IgG blocking reagent and CD34 microbeads. These beads contain the anti-CD34 antibody clone QBEND/10. Use a different anti-CD34 clone for purity check (e.g. clone 8G12). |
| Lymphoprep | Alere Technologies | 1114545 | Lymphocyte separation media (density 1.077 g/mL) |
| Sterile separation buffer (SB) | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | This buffer contains phosphate buffered saline (PBS), pH 7.2 containing 0.5% bovine serum albumin and 2 mM EDTA. It can be prepared using sterile, cell culture grade components. De-gas before use because air bubbles can block the column. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow Cytometry and Cell Staining Reagents | |||
| PE Mouse anti-Human CD34 | BD Biosciences | 340669 | Clone 8G12. This can be used for CD34 purity check. Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| PerCP mouse anti-human CD45 | BD Biosciences | 347464 | 1:10 dilution |
| PerCP isotype control | BD Biosciences | 349044 | 1:10 dilution |
| FITC Mouse anti-Human CD41a | BD Biosciences | 340929 | Final antibody concentration 1:5 dilution. |
| APC Mouse anti-Human CD42b | BD Biosciences | 551061 | This antibody can also be used to detect mature MK (the percentage of positive cells in usually lower than with anti CD42a). Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human CD42a | AbD Serotec | MCA1227A647T | Currently distributed by Bio-Rad. Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| Alexa Fluor 647 Mouse Negative Control | AbD Serotec | MCA928A647 | Currently distributed by Bio-Rad. Isotype control antibody |
| Anti von Willebrand factor rabbit polyclonal | Abcam | AB6994 | 1:200 dilution |
| V450 mouse anti-humna CD41a | BD Biosciences | 58425 | 1: 20 dilution |
| V450 isotype control | BD Biosciences | 580373 | 1:20 dilution |
| PAC1-FITC antibody | BD Biosciences | 340507 | 1:10 dilution |
| Anti CD62p mouse monoclonal | Abcam | AB6632 | 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti rabbit IgG | Invitrogen | A11008 | 1:100 dilution |
| Alexa Fluor 594 goat anti mouse IgG | Invitrogen | A11020 | 1:100 dilution |
| Ig Isotype Control cocktail-C | BD Biosciences | 558659 | Isotype control antibody |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4864 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Molecular Probes, Invitrogen | C36950 | Counting beads |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Smaller and larger columns are also commercially available |
| MidiMACS Separator magnet | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Falcon 5mL round bottom polypropylene FACS tubes, with Snap Cap, Sterile | In Vitro technologies | 352063 | |
| Glass slides | Menzel-Glaser | J3800AMNZ | |
| Mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Antifade mounting medium with DAPI |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Inverted microscope | Leica | DMIRB inverted microscope | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | Vert.A1 | |
| Cell analyser | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Cytospin centrifuge | ThermoScientific | Cytospin 4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Cell analyser software | BD Biosciences | FACS Diva Software | |
| Single cell analysis software | Tree Star | FlowJo | |
| Fluorescent microscope software | Zeiss | Zen 2 blue edition |
References
- Nakeff, A., Maat, B. Separation of megakaryocytes from mouse bone marrow by velocity sedimentation. Blood. 43 (4), 591-595 (1974).
- Zeigler, F. C., et al. In vitro megakaryocytopoietic and thrombopoietic activity of c-mpl ligand (TPO) on purified murine hematopoietic stem cells. Blood. 84 (12), 4045-4052 (1994).
- Reems, J. -. A., Pineault, N., Sun, S. In Vitro Megakaryocyte Production and Platelet Biogenesis: State of the Art. Transfus. Med. Rev. 24 (1), 33-43 (2010).
- Choi, E., Nichol, J. L., Hokom, M. M., Hornkohl, A. C., Hunt, P. Platelets generated in vitro from proplatelet-displaying human megakaryocytes are functional. Blood. 85 (2), 402-413 (1995).
- Perdomo, J., et al. A monopartite sequence is essential for p45 NF-E2 nuclear translocation, transcriptional activity and platelet production. J Thromb Haemost. 8 (11), 2542-2553 (2010).
- Shim, M. H., Hoover, A., Blake, N., Drachman, J. G., Reems, J. A. Gene expression profile of primary human CD34+CD38lo cells differentiating along the megakaryocyte lineage. Exp Hematol. 32 (7), 638-648 (2004).
- Feng, Q., et al. Scalable generation of universal platelets from human induced pluripotent stem cells. Stem cell reports. 3 (5), 817-831 (2014).
- Bruno, S., et al. In vitro and in vivo megakaryocyte differentiation of fresh and ex-vivo expanded cord blood cells: rapid and transient megakaryocyte reconstitution. Haematologica. 88 (4), 379-387 (2003).
- Iraqi, M., Perdomo, J., Yan, F., Choi, P. Y. I., Chong, B. H. Immune thrombocytopenia: antiplatelet autoantibodies inhibit proplatelet formation by megakaryocytes and impair platelet production in vitro. Haematologica. 100 (5), 623-632 (2015).
- Lev, P. R., et al. Impaired proplatelet formation in immune thrombocytopenia: a novel mechanism contributing to decreased platelet count. Br. J. Haematol. 165 (6), 854-864 (2014).
- Gandhi, M. J., Drachman, J. G., Reems, J. A., Thorning, D., Lannutti, B. J. A novel strategy for generating platelet-like fragments from megakaryocytic cell lines and human progenitor cells. Blood Cells Mol. Dis. 35 (1), 70-73 (2005).
- Lu, S. -. J., et al. Platelets generated from human embryonic stem cells are functional in vitro and in the microcirculation of living mice. Cell Res. 21 (3), 530-545 (2011).
- Moreau, T., et al. Large-scale production of megakaryocytes from human pluripotent stem cells by chemically defined forward programming. Nature Commun. 7, 11208 (2016).
- De Bruyn, C., Delforge, A., Martiat, P., Bron, D. Ex vivo expansion of megakaryocyte progenitor cells: cord blood versus mobilized peripheral blood. Stem Cells Dev. 14 (4), 415-424 (2005).
- Nimgaonkar, M. T., et al. A unique population of CD34+ cells in cord blood. Stem cells. 13 (2), 158-166 (1995).
- Italiano, J. E., Patel-Hett, S., Hartwig, J. H. Mechanics of proplatelet elaboration. J Thromb Haemost. 5, 18-23 (2007).
- Matsunaga, T., et al. Ex vivo large-scale generation of human platelets from cord blood CD34+ cells. Stem cells. 24 (12), 2877-2887 (2006).
- Sullenbarger, B., Bahng, J. H., Gruner, R., Kotov, N., Lasky, L. C. Prolonged continuous in vitro human platelet production using three-dimensional scaffolds. Exp Hematol. 37 (1), 101-110 (2009).
- Proulx, C., Boyer, L., Hurnanen, D. R., Lemieux, R. Preferential ex vivo expansion of megakaryocytes from human cord blood CD34+-enriched cells in the presence of thrombopoietin and limiting amounts of stem cell factor and Flt-3 ligand. J. Hematother. Stem Cell Res. 12 (2), 179-188 (2003).
- Bornstein, R., Garcia-Vela, J., Gilsanz, F., Auray, C., Cales, C. Cord blood megakaryocytes do not complete maturation, as indicated by impaired establishment of endomitosis and low expression of G1/S cyclins upon thrombopoietin-induced differentiation. Br. J. Haematol. 114 (2), 458-465 (2001).
- Chong, B. H., Choi, P. Y. I., Khachigian, L., Perdomo, J. Drug-induced Immune Thrombocytopenia. Hematol Oncol Clin North Am. 27 (3), (2013).
- Stasi, R., et al. Idiopathic thrombocytopenic purpura: Current concepts in pathophysiology and management. Thromb Haemost. 99 (1), 4-13 (2008).
