מגקריוציט בידול ויצירת טסית דם מן האדם כבל CD34 נגזר דם תאים+
Summary
אוכלוסיה מאוד טהור של megakaryocytes ניתן להשיג כבל דם-derived CD34+ תאים. שיטה CD34+ בידוד תאית התמיינות מגקריוציט מתואר כאן.
Abstract
ייצור טסיות מתרחשת בעיקר במח העצם על תהליך המכונה thrombopoiesis. במהלך thrombopoiesis, להבדיל hematopoietic ובתאים כדי מבשרי טסיות טופס שנקרא megakaryocytes, אשר להבדיל סופני לשחרר טסיות דם מן התהליכים זמן cytoplasmic כינה proplatelets. Megakaryocytes הם נדירים תאים מוגבל במח העצם, ולכן הם קשים לקצור או מספיקים לשימוש מעבדה. ייצור יעיל של megakaryocytes האנושית יכולה להיות מושגת במבחנה מאת culturing CD34+ תאים בתנאים מתאימים. פרוטוקול מפורט כאן מתאר בידוד של CD34+ תאים על-ידי תא מגנטי מיון של דגימות דם חבל הטבור. מתוארים הצעדים הדרושים כדי לייצר megakaryocytes מאוד טהור, בוגרת בתנאים ללא סרום. הפרטים של ניתוח פנוטיפי של בידול מגקריוציט והנחישות של היווצרות proplatelet וייצור טסיות הינם גם מסופקים. ניתן להוסיף effectors המשפיעים על בידול מגקריוציט ו/או היווצרות proplatelet, כגון נוגדנים נגד טסיות או מימטיקה thrombopoietin, תאים בתרבית לבחון תפקוד ביולוגי.
Introduction
בידוד של מספרים נאותה של ראשי megakaryocytes האנושית (ח”כ) לשימוש מעבדה רגיל הוא לא ריאלי עקב שלהם בתדר נמוך במח העצם, שבו הם מהווים ~0.01% של תאים nucleated1. חלופה נוחה היא הרחבה שמחוץ הבידול של גזע hematopoietic, ובתאים בנוכחות גורמי גדילה ספציפי. מספר של ציטוקינים כולל גורם לתאי גזע (SCF; ליגנד c-kit), אינטרלויקין (IL)-3 ו- IL-11 היו מועסקים במערכות תרבות לייצר מק ש. Thrombopoietin (TPO) היא הגורם היעיל ביותר בהתפתחותם עבור תרבויות megakaryocytic הוא יעיל לבד או עם אחרים ציטוקינים, כגון SCF ו- IL-32. TPO יכול לפעול על תאי גזע אוכלוסיות את התוצאה התפשטות וגם ההבשלה של חברי כנסת2.
ח”כ טסיות התוצרת מן בליטות cytoplasmic שנקרא proplatelets, אין ויוו, כ עונה 1 פרק 1011 טסיות הם יצרו מדי יום כדי לקיים את ספירת טסיות של 150-400 x 109/L. טסיות ייצור במבחנה הוא עד 1000 -מקפלים נמוך יותר מאשר ה- ויוו הערכות3, זה נתן עלייה לתנאים תרבות רבים באמצעות CD34+ ובתאים hematopoietic כדי לשפר את ח”כ, טסיות ייצור במבחנה. המקור הראשוני של CD34+ התאים המשמש ח”כ בידול היה דם היקפיים אנושי4. מקורות תא אחרים כוללים את מח העצם5,6, עובריים תאי גזע/המושרה pluripotent תאי גזע (ESC/iPSC)7הטבור דם (UCB)8,9,10 . מח עצם האדם CD34+ 11 ו העכבר שושלת היוחסין שלילי מח עצם תאים5 התוצרת ח”כ ולבנים וטסיות דם בתוך חוץ גופית; ובכל זאת, חוסר זמינות של מח עצם האדם מגביל את השימוש בו כמקור CD34+ תאים. לעומת זאת, ESC, iPSC מייצגים מקור מוגבל של תאים עבור ייצור טסיות במבחנה . טסיות ייצור של תאים אלה דורש מזין תאים תאים OP9 מאתר ו תקופות ארוכות יותר של תרבות. טסיות נגזר בתנאים ללא מזין להיראות פחות פונקציונלי12. טסיות נגזר iPSC נוטים להיות השימוש בהגדרות קליני מאז הם ניתן להרחיב בקנה מידה גדול. תהליך זה דורש lentiviral בתיווך התמרה חושית של גורמי שעתוק, תא לטווח ארוך תרבות13.
UCB הוא מקור נגיש של CD34+ התאים יכולה בקלות לשמש מחקר הגדרות. TPO לבד יכול לקדם את הבידול של כבל דם-derived CD34+ תאים וזה מעורר חברי כנסת מאוד טהור, בוגר ללא צורך תוספי סרום או תרבות משותפת עם מזין תאים. ציטוקינים אחרים כגון SCF עשויה להקטין בידול מ- UCB CD34+ תאים, בעוד ליגנד Flt-3 ו- IL-11 לקדם את הייצור של ילדותי megakaryocytes14. פרוטוקול זה מתאר את הייצור של תרבויות ח”כ מאוד טהור של דם טבורי CD34+ תאים בתנאים ללא סרום.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן מתאימה לייצור עקבית של ח”כ ולבנים וטסיות דם בתרבות של דם טבורי. תאים אלה ניתן ללמוד תהליכים שונים כגון ההשפעה של תרופות או פעילויות ביולוגיות על ח כ התפשטות, בידול, היווצרות proplatelet וייצור טסיות.
מגוון רחב של שילובים ציטוקין ומדיה תרבות הוצגו בספרות. תוספ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים להכיר את התמיכה של בריאות אוסטרלי המועצה למחקר רפואי (פרויקט גרנט 1012409 קשורה BHC).
Materials
| Cell Culture Reagents | |||
| Recombinant Human TPO | Miltenyi Biotec | 130-094-013 | |
| StemSpan SFEM II | Stem Cell Technologies | 9605 | Serum-free media for CD34+ cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD34 Isolation Reagents | |||
| CD34 MicroBead kit ultrapure | Miltenyi Biotec | 130-100-453 | This kit includes the FcR human IgG blocking reagent and CD34 microbeads. These beads contain the anti-CD34 antibody clone QBEND/10. Use a different anti-CD34 clone for purity check (e.g. clone 8G12). |
| Lymphoprep | Alere Technologies | 1114545 | Lymphocyte separation media (density 1.077 g/mL) |
| Sterile separation buffer (SB) | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | This buffer contains phosphate buffered saline (PBS), pH 7.2 containing 0.5% bovine serum albumin and 2 mM EDTA. It can be prepared using sterile, cell culture grade components. De-gas before use because air bubbles can block the column. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow Cytometry and Cell Staining Reagents | |||
| PE Mouse anti-Human CD34 | BD Biosciences | 340669 | Clone 8G12. This can be used for CD34 purity check. Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| PerCP mouse anti-human CD45 | BD Biosciences | 347464 | 1:10 dilution |
| PerCP isotype control | BD Biosciences | 349044 | 1:10 dilution |
| FITC Mouse anti-Human CD41a | BD Biosciences | 340929 | Final antibody concentration 1:5 dilution. |
| APC Mouse anti-Human CD42b | BD Biosciences | 551061 | This antibody can also be used to detect mature MK (the percentage of positive cells in usually lower than with anti CD42a). Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human CD42a | AbD Serotec | MCA1227A647T | Currently distributed by Bio-Rad. Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| Alexa Fluor 647 Mouse Negative Control | AbD Serotec | MCA928A647 | Currently distributed by Bio-Rad. Isotype control antibody |
| Anti von Willebrand factor rabbit polyclonal | Abcam | AB6994 | 1:200 dilution |
| V450 mouse anti-humna CD41a | BD Biosciences | 58425 | 1: 20 dilution |
| V450 isotype control | BD Biosciences | 580373 | 1:20 dilution |
| PAC1-FITC antibody | BD Biosciences | 340507 | 1:10 dilution |
| Anti CD62p mouse monoclonal | Abcam | AB6632 | 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti rabbit IgG | Invitrogen | A11008 | 1:100 dilution |
| Alexa Fluor 594 goat anti mouse IgG | Invitrogen | A11020 | 1:100 dilution |
| Ig Isotype Control cocktail-C | BD Biosciences | 558659 | Isotype control antibody |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4864 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Molecular Probes, Invitrogen | C36950 | Counting beads |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Smaller and larger columns are also commercially available |
| MidiMACS Separator magnet | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Falcon 5mL round bottom polypropylene FACS tubes, with Snap Cap, Sterile | In Vitro technologies | 352063 | |
| Glass slides | Menzel-Glaser | J3800AMNZ | |
| Mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Antifade mounting medium with DAPI |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Inverted microscope | Leica | DMIRB inverted microscope | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | Vert.A1 | |
| Cell analyser | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Cytospin centrifuge | ThermoScientific | Cytospin 4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Cell analyser software | BD Biosciences | FACS Diva Software | |
| Single cell analysis software | Tree Star | FlowJo | |
| Fluorescent microscope software | Zeiss | Zen 2 blue edition |
References
- Nakeff, A., Maat, B. Separation of megakaryocytes from mouse bone marrow by velocity sedimentation. Blood. 43 (4), 591-595 (1974).
- Zeigler, F. C., et al. In vitro megakaryocytopoietic and thrombopoietic activity of c-mpl ligand (TPO) on purified murine hematopoietic stem cells. Blood. 84 (12), 4045-4052 (1994).
- Reems, J. -. A., Pineault, N., Sun, S. In Vitro Megakaryocyte Production and Platelet Biogenesis: State of the Art. Transfus. Med. Rev. 24 (1), 33-43 (2010).
- Choi, E., Nichol, J. L., Hokom, M. M., Hornkohl, A. C., Hunt, P. Platelets generated in vitro from proplatelet-displaying human megakaryocytes are functional. Blood. 85 (2), 402-413 (1995).
- Perdomo, J., et al. A monopartite sequence is essential for p45 NF-E2 nuclear translocation, transcriptional activity and platelet production. J Thromb Haemost. 8 (11), 2542-2553 (2010).
- Shim, M. H., Hoover, A., Blake, N., Drachman, J. G., Reems, J. A. Gene expression profile of primary human CD34+CD38lo cells differentiating along the megakaryocyte lineage. Exp Hematol. 32 (7), 638-648 (2004).
- Feng, Q., et al. Scalable generation of universal platelets from human induced pluripotent stem cells. Stem cell reports. 3 (5), 817-831 (2014).
- Bruno, S., et al. In vitro and in vivo megakaryocyte differentiation of fresh and ex-vivo expanded cord blood cells: rapid and transient megakaryocyte reconstitution. Haematologica. 88 (4), 379-387 (2003).
- Iraqi, M., Perdomo, J., Yan, F., Choi, P. Y. I., Chong, B. H. Immune thrombocytopenia: antiplatelet autoantibodies inhibit proplatelet formation by megakaryocytes and impair platelet production in vitro. Haematologica. 100 (5), 623-632 (2015).
- Lev, P. R., et al. Impaired proplatelet formation in immune thrombocytopenia: a novel mechanism contributing to decreased platelet count. Br. J. Haematol. 165 (6), 854-864 (2014).
- Gandhi, M. J., Drachman, J. G., Reems, J. A., Thorning, D., Lannutti, B. J. A novel strategy for generating platelet-like fragments from megakaryocytic cell lines and human progenitor cells. Blood Cells Mol. Dis. 35 (1), 70-73 (2005).
- Lu, S. -. J., et al. Platelets generated from human embryonic stem cells are functional in vitro and in the microcirculation of living mice. Cell Res. 21 (3), 530-545 (2011).
- Moreau, T., et al. Large-scale production of megakaryocytes from human pluripotent stem cells by chemically defined forward programming. Nature Commun. 7, 11208 (2016).
- De Bruyn, C., Delforge, A., Martiat, P., Bron, D. Ex vivo expansion of megakaryocyte progenitor cells: cord blood versus mobilized peripheral blood. Stem Cells Dev. 14 (4), 415-424 (2005).
- Nimgaonkar, M. T., et al. A unique population of CD34+ cells in cord blood. Stem cells. 13 (2), 158-166 (1995).
- Italiano, J. E., Patel-Hett, S., Hartwig, J. H. Mechanics of proplatelet elaboration. J Thromb Haemost. 5, 18-23 (2007).
- Matsunaga, T., et al. Ex vivo large-scale generation of human platelets from cord blood CD34+ cells. Stem cells. 24 (12), 2877-2887 (2006).
- Sullenbarger, B., Bahng, J. H., Gruner, R., Kotov, N., Lasky, L. C. Prolonged continuous in vitro human platelet production using three-dimensional scaffolds. Exp Hematol. 37 (1), 101-110 (2009).
- Proulx, C., Boyer, L., Hurnanen, D. R., Lemieux, R. Preferential ex vivo expansion of megakaryocytes from human cord blood CD34+-enriched cells in the presence of thrombopoietin and limiting amounts of stem cell factor and Flt-3 ligand. J. Hematother. Stem Cell Res. 12 (2), 179-188 (2003).
- Bornstein, R., Garcia-Vela, J., Gilsanz, F., Auray, C., Cales, C. Cord blood megakaryocytes do not complete maturation, as indicated by impaired establishment of endomitosis and low expression of G1/S cyclins upon thrombopoietin-induced differentiation. Br. J. Haematol. 114 (2), 458-465 (2001).
- Chong, B. H., Choi, P. Y. I., Khachigian, L., Perdomo, J. Drug-induced Immune Thrombocytopenia. Hematol Oncol Clin North Am. 27 (3), (2013).
- Stasi, R., et al. Idiopathic thrombocytopenic purpura: Current concepts in pathophysiology and management. Thromb Haemost. 99 (1), 4-13 (2008).
