Megakaryocyte differensiering og blodplater formasjon fra menneske ledningen blod-avledet CD34+ celler
Summary
Svært ren innbyggere megakaryocytes kan fås fra ledningen blod-avledet CD34+ celler. En metode for CD34+ celle isolasjon og megakaryocyte differensiering er beskrevet her.
Abstract
Blodplater produksjon forekommer hovedsakelig i benmargen i en prosess kjent som thrombopoiesis. Under thrombopoiesis skille blodkreft stamfar celler til skjemaet Platederivert forløpere kalt megakaryocytes, som uhelbredelig skiller for å løslate blodplater fra lenge cytoplasmatiske prosesser kalt proplatelets. Megakaryocytes er sjeldne celler begrenset til benmargen og er derfor vanskelig å høste i tilstrekkelig antall til laboratoriebruk. Effektiv produksjon av menneskelig megakaryocytes kan bli oppnådd i vitro ved dyrking CD34+ celler i riktig forhold. Protokollen detaljert her beskriver isolering av CD34+ celler av magnetiske celle sortering fra navlestreng blodprøver. De nødvendige skritt for å produsere svært ren, moden megakaryocytes under serum-free forhold er beskrevet. Detaljer om fenotypiske analyse av megakaryocyte differensiering og besluttsomhet for proplatelet formasjon og blodplater tilbys også. Effektor som påvirker megakaryocyte differensiering og/eller proplatelet formasjonen, som anti-Platederivert antistoffer eller thrombopoietin mimetics, kan legges til kulturperler celler å undersøke biologisk funksjon.
Introduction
Isolering av tilstrekkelig antall primære menneskelig megakaryocytes (MK) til vanlige laboratoriebruk er ikke gjennomførbart på grunn av deres lave frekvenser i benmargen, der de utgjør ~0.01% celler kjerne1. Et praktisk alternativ er ex vivo ekspansjon og differensiering av blodkreft stilk og progenitor celler i nærvær av bestemte vekstfaktorer. En rekke cytokiner inkludert stamcelleforskningen faktor (SCF, c-kit ligand) og interleukin (IL) -3 og IL-11 har vært er ansatt i kultur systemer å produsere MKs. Thrombopoietin (TPO) den mest effektive vekst og differensiering faktoren for megakaryocytic kulturer og er effektive alene eller sammen med andre cytokiner, slik som SCF og IL-3-2. TPO kan fungere på stammen celle populasjoner føre både spredning og modning av MKs2.
MK produsere blodplater fra cytoplasmatiske utstikkende deler kalt proplatelets og, i vivo, . ca 1 x 1011 blodplater er er dannet daglig for å opprettholde Platederivert tellinger av 150-400 x 109/l. Platederivert produksjon i vitro opptil 1000 -Brett lavere enn den i vivo estimerer3, og dette har gitt opphav til mange kultur vilkår bruker CD34+ blodkreft stamfar celler å forbedre MK og blodplater produksjon i vitro. Den opprinnelige kilden til CD34+ celler brukes for MK differensiering var menneskelig perifert blod4. Cellen kilder andre benmarg5,6, embryonale stamceller/indusert pluripotent stamceller (ESC/iPSC)7og navlestreng blod (UCB)8,9,10 . Human benmarg CD34+ 11 og mus avstamning negative benmarg celler5 produsere MK og blodplater i vitro; Likevel er mangelen på tilgjengelighet for human benmarg begrenser bruken som en kilde til CD34+ celler. Derimot representerer ESC og iPSC en ubegrenset kilde av celler for i vitro Platederivert produksjon. Blodplater produksjon fra disse cellene krever mater celler som murine OP9 celler og lengre kultur perioder. Blodplater-avledet mater-gratis forhold synes å være mindre funksjonelle12. iPSC-avledet blodplater er sannsynlig å være av bruk i klinisk siden de kan utvides til stor skala. Denne prosessen krever lentiviral-mediert signaltransduksjon transkripsjonsfaktorer og langsiktig celle kultur13.
UCB er et tilgjengelig CD34+ celler som lett kan brukes i forskning innstillingene. TPO alene kan fremme differensiering av ledningen blod-avledet CD34+ celler, og dette gir opphav til svært ren, moden MKs uten behov for serum kosttilskudd eller co kultur med mater celler. Andre cytokiner som SCF kan redusere differensiering fra UCB CD34+ celler, mens Flt-3 ligand og IL-11 fremme produksjon av umodne megakaryocytes14. Denne protokollen beskriver produksjon av svært ren MK kulturer fra ledningen blod CD34+ celler i serum-free forhold.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen beskrevet her er egnet for konsekvent produksjon av MK og blodplater i kultur fra navlestrengsblod. Disse cellene kan brukes å studere ulike prosesser som effekten av legemidler eller biologiske aktiviteter på MK spredning, differensiering, proplatelet formasjon og blodplater produksjon.
En rekke kultur medier og cytokin kombinasjoner har blitt presentert i litteraturen. Tillegg av cytokiner som stilk cellen faktor, Flt-3 ligand, IL-3 og IL-6 støtter CD34+ celle spred…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne bekrefter støtte av australske Health and Medical Research Council (prosjekt stipend 1012409 koblet til BHC).
Materials
| Cell Culture Reagents | |||
| Recombinant Human TPO | Miltenyi Biotec | 130-094-013 | |
| StemSpan SFEM II | Stem Cell Technologies | 9605 | Serum-free media for CD34+ cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD34 Isolation Reagents | |||
| CD34 MicroBead kit ultrapure | Miltenyi Biotec | 130-100-453 | This kit includes the FcR human IgG blocking reagent and CD34 microbeads. These beads contain the anti-CD34 antibody clone QBEND/10. Use a different anti-CD34 clone for purity check (e.g. clone 8G12). |
| Lymphoprep | Alere Technologies | 1114545 | Lymphocyte separation media (density 1.077 g/mL) |
| Sterile separation buffer (SB) | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | This buffer contains phosphate buffered saline (PBS), pH 7.2 containing 0.5% bovine serum albumin and 2 mM EDTA. It can be prepared using sterile, cell culture grade components. De-gas before use because air bubbles can block the column. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow Cytometry and Cell Staining Reagents | |||
| PE Mouse anti-Human CD34 | BD Biosciences | 340669 | Clone 8G12. This can be used for CD34 purity check. Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| PerCP mouse anti-human CD45 | BD Biosciences | 347464 | 1:10 dilution |
| PerCP isotype control | BD Biosciences | 349044 | 1:10 dilution |
| FITC Mouse anti-Human CD41a | BD Biosciences | 340929 | Final antibody concentration 1:5 dilution. |
| APC Mouse anti-Human CD42b | BD Biosciences | 551061 | This antibody can also be used to detect mature MK (the percentage of positive cells in usually lower than with anti CD42a). Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human CD42a | AbD Serotec | MCA1227A647T | Currently distributed by Bio-Rad. Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| Alexa Fluor 647 Mouse Negative Control | AbD Serotec | MCA928A647 | Currently distributed by Bio-Rad. Isotype control antibody |
| Anti von Willebrand factor rabbit polyclonal | Abcam | AB6994 | 1:200 dilution |
| V450 mouse anti-humna CD41a | BD Biosciences | 58425 | 1: 20 dilution |
| V450 isotype control | BD Biosciences | 580373 | 1:20 dilution |
| PAC1-FITC antibody | BD Biosciences | 340507 | 1:10 dilution |
| Anti CD62p mouse monoclonal | Abcam | AB6632 | 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti rabbit IgG | Invitrogen | A11008 | 1:100 dilution |
| Alexa Fluor 594 goat anti mouse IgG | Invitrogen | A11020 | 1:100 dilution |
| Ig Isotype Control cocktail-C | BD Biosciences | 558659 | Isotype control antibody |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4864 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Molecular Probes, Invitrogen | C36950 | Counting beads |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Smaller and larger columns are also commercially available |
| MidiMACS Separator magnet | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Falcon 5mL round bottom polypropylene FACS tubes, with Snap Cap, Sterile | In Vitro technologies | 352063 | |
| Glass slides | Menzel-Glaser | J3800AMNZ | |
| Mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Antifade mounting medium with DAPI |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Inverted microscope | Leica | DMIRB inverted microscope | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | Vert.A1 | |
| Cell analyser | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Cytospin centrifuge | ThermoScientific | Cytospin 4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Cell analyser software | BD Biosciences | FACS Diva Software | |
| Single cell analysis software | Tree Star | FlowJo | |
| Fluorescent microscope software | Zeiss | Zen 2 blue edition |
References
- Nakeff, A., Maat, B. Separation of megakaryocytes from mouse bone marrow by velocity sedimentation. Blood. 43 (4), 591-595 (1974).
- Zeigler, F. C., et al. In vitro megakaryocytopoietic and thrombopoietic activity of c-mpl ligand (TPO) on purified murine hematopoietic stem cells. Blood. 84 (12), 4045-4052 (1994).
- Reems, J. -. A., Pineault, N., Sun, S. In Vitro Megakaryocyte Production and Platelet Biogenesis: State of the Art. Transfus. Med. Rev. 24 (1), 33-43 (2010).
- Choi, E., Nichol, J. L., Hokom, M. M., Hornkohl, A. C., Hunt, P. Platelets generated in vitro from proplatelet-displaying human megakaryocytes are functional. Blood. 85 (2), 402-413 (1995).
- Perdomo, J., et al. A monopartite sequence is essential for p45 NF-E2 nuclear translocation, transcriptional activity and platelet production. J Thromb Haemost. 8 (11), 2542-2553 (2010).
- Shim, M. H., Hoover, A., Blake, N., Drachman, J. G., Reems, J. A. Gene expression profile of primary human CD34+CD38lo cells differentiating along the megakaryocyte lineage. Exp Hematol. 32 (7), 638-648 (2004).
- Feng, Q., et al. Scalable generation of universal platelets from human induced pluripotent stem cells. Stem cell reports. 3 (5), 817-831 (2014).
- Bruno, S., et al. In vitro and in vivo megakaryocyte differentiation of fresh and ex-vivo expanded cord blood cells: rapid and transient megakaryocyte reconstitution. Haematologica. 88 (4), 379-387 (2003).
- Iraqi, M., Perdomo, J., Yan, F., Choi, P. Y. I., Chong, B. H. Immune thrombocytopenia: antiplatelet autoantibodies inhibit proplatelet formation by megakaryocytes and impair platelet production in vitro. Haematologica. 100 (5), 623-632 (2015).
- Lev, P. R., et al. Impaired proplatelet formation in immune thrombocytopenia: a novel mechanism contributing to decreased platelet count. Br. J. Haematol. 165 (6), 854-864 (2014).
- Gandhi, M. J., Drachman, J. G., Reems, J. A., Thorning, D., Lannutti, B. J. A novel strategy for generating platelet-like fragments from megakaryocytic cell lines and human progenitor cells. Blood Cells Mol. Dis. 35 (1), 70-73 (2005).
- Lu, S. -. J., et al. Platelets generated from human embryonic stem cells are functional in vitro and in the microcirculation of living mice. Cell Res. 21 (3), 530-545 (2011).
- Moreau, T., et al. Large-scale production of megakaryocytes from human pluripotent stem cells by chemically defined forward programming. Nature Commun. 7, 11208 (2016).
- De Bruyn, C., Delforge, A., Martiat, P., Bron, D. Ex vivo expansion of megakaryocyte progenitor cells: cord blood versus mobilized peripheral blood. Stem Cells Dev. 14 (4), 415-424 (2005).
- Nimgaonkar, M. T., et al. A unique population of CD34+ cells in cord blood. Stem cells. 13 (2), 158-166 (1995).
- Italiano, J. E., Patel-Hett, S., Hartwig, J. H. Mechanics of proplatelet elaboration. J Thromb Haemost. 5, 18-23 (2007).
- Matsunaga, T., et al. Ex vivo large-scale generation of human platelets from cord blood CD34+ cells. Stem cells. 24 (12), 2877-2887 (2006).
- Sullenbarger, B., Bahng, J. H., Gruner, R., Kotov, N., Lasky, L. C. Prolonged continuous in vitro human platelet production using three-dimensional scaffolds. Exp Hematol. 37 (1), 101-110 (2009).
- Proulx, C., Boyer, L., Hurnanen, D. R., Lemieux, R. Preferential ex vivo expansion of megakaryocytes from human cord blood CD34+-enriched cells in the presence of thrombopoietin and limiting amounts of stem cell factor and Flt-3 ligand. J. Hematother. Stem Cell Res. 12 (2), 179-188 (2003).
- Bornstein, R., Garcia-Vela, J., Gilsanz, F., Auray, C., Cales, C. Cord blood megakaryocytes do not complete maturation, as indicated by impaired establishment of endomitosis and low expression of G1/S cyclins upon thrombopoietin-induced differentiation. Br. J. Haematol. 114 (2), 458-465 (2001).
- Chong, B. H., Choi, P. Y. I., Khachigian, L., Perdomo, J. Drug-induced Immune Thrombocytopenia. Hematol Oncol Clin North Am. 27 (3), (2013).
- Stasi, R., et al. Idiopathic thrombocytopenic purpura: Current concepts in pathophysiology and management. Thromb Haemost. 99 (1), 4-13 (2008).
