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Immunology and Infection

एक उपंयास फीडर इन विट्रो में Murine प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए मुफ्त प्रणाली

Published: January 9, 2018 doi: 10.3791/56785
Automatic Translation
1,2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 1, 2
1Department of Anatomical and Cellular Pathology, The Chinese University of Hong Kong, 2Li Ka Shing Institute of Health Sciences and Department of Medicine & Therapeutics, The Chinese University of Hong Kong

Summary

यहां, हम इन विट्रो में और vivo मेंयंत्रवत अध्ययन के लिए एक फीडर मुक्त भेदभाव प्रणाली का उपयोग करके बड़े पैमाने पर उत्पादन जीन मुंह murine NK कोशिकाओं के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।

Abstract

प्राकृतिक हत्यारा (NK) कोशिकाओं को जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली के हैं और एक पहली लाइन विरोधी कैंसर प्रतिरक्षा रक्षा कर रहे हैं; हालांकि, वे ट्यूमर microenvironment में दबा रहे है और अंतर्निहित तंत्र अभी भी काफी हद तक अज्ञात है । NK कोशिकाओं के एक सुसंगत और विश्वसनीय स्रोत की कमी NK कोशिका प्रतिरक्षा की अनुसंधान प्रगति को सीमित करता है । यहां, हम एक इन विट्रो प्रणाली है कि उच्च गुणवत्ता और अस्थि मज्जा की मात्रा प्रदान कर सकते है एक फीडर मुक्त हालत के तहत murine NK कोशिकाओं की रिपोर्ट । अधिक महत्वपूर्ण बात, हम यह भी प्रदर्शित करता है कि सिरना-मध्यस्थता जीन मुंह सफलतापूर्वक इस प्रणाली का उपयोग करके E4bp4-निर्भर NK कोशिका परिपक्वता को रोकता है । इस प्रकार, इन विट्रो NK कोशिका विभेदन प्रणाली प्रतिरक्षा अनुसंधान के लिए एक भौतिक समाधान है ।

Introduction

कैंसर की प्रगति काफी हद तक ट्यूमर microenvironment,2सहित, मेजबान-व्युत्पंन immunocytes, जैसे, NK कोशिकाओं पर निर्भर है । कई अध्ययनों से प्रदर्शित किया है कि intratumoral NK कोशिकाओं को नकारात्मक ट्यूमर प्रगति3,4के साथ संबंधित हैं । इसके अलावा, नैदानिक अध्ययनों से पता चला है कि NK कोशिका दत्तक चिकित्सा कैंसर के लिए एक संभव रणनीति5,6,7,8,9। NK कोशिका आधारित कैंसर immunotherapy ठोस ट्यूमर के लिए एक चिकित्सीय विकल्प के रूप में हाल ही में सुझाव दिया गया था, लेकिन चुनौतियां ठोस ट्यूमर के downregulation में लाइगैंडों सक्रिय करने के गुर्दे साइटोकिंस और microenvironment के स्राव के कारण मौजूद 10,11. रूपांतरित विकास कारक-β (TGF-β) कैंसरजनन में एक दमन भूमिका निभाने के लिए सुझाव दिया गया है, लेकिन विडंबना यह है कि कैंसर की कोशिकाओं को भी TGF-β1 ट्यूमर विकास का समर्थन करने के लिए उत्पादन12,13,14 , 15. TGF-β सिगनल नीचे के माध्यम से NK कोशिकाओं के cytolytic गतिविधि को दबा सकते हैं-विनियमन इंटरफेरॉन जवाबदेही और CD16-मध्यस्थता इंटरफेरॉन-गामा (IFN-γ) उत्पादन इन विट्रो16,17, 18.

हालांकि TGF के विघटन-β ट्यूमर microenvironment में संकेत कैंसर को नष्ट करने के लिए एक संभव तरीका हो सकता है, पूरी तरह से अवरुद्ध TGF-β संकेतन इसके विरोधी भड़काऊ समारोह के कारण, के रूप में के विकास के सबूत के रूप में स्व-प्रतिरक्षित रोगों का कारण होगा प्रणालीगत सूजन, हृदय दोष, और प्रतिरक्षा माउस मॉडल19में सहित प्रतिकूल दुष्प्रभावों । इस प्रकार, TGF के कार्य तंत्र को समझना-β-मध्यस्थता प्रतिरक्षादमन कैंसर के इलाज के लिए एक सुलभ चिकित्सीय लक्ष्य की पहचान करने के लिए नेतृत्व करेंगे.

आणविक NK कोशिका विकास के लिए आवश्यक घटनाओं स्पष्ट करने के लिए, विलियंस एट अल. एक इन विट्रो प्रणाली में murine अस्थि मज्जा टेम स्टेम कोशिकाओं को NK कोशिकाओं20में अंतर के लिए स्थापित किया । इस प्रणाली में काफी हद तक NK सेल विकास के यंत्रवत अध्ययन की सुविधा है, जिसमें NK कोशिकाओं के उपन्यास progenitors की पहचान21है. हालांकि, अस्थि मज्जा progenitors प्रणाली में एक फीडर परत20,21के रूप में OP9 stromal कोशिकाओं का समर्थन करने के साथ किया जाना चाहिए, और इस विषम कोशिका आबादी मोटे तौर पर जीन के आगे आवेदन-बाधित उपकरण सीमा (जैसे, सिरना-मध्यस्थता जीन मुंह) विशेष रूप से अंतर NK कोशिकाओं के लिए लागू होता है ।

यहां, हम एक फीडर मुक्त प्रणाली है कि आगे को संशोधित करके विकसित किया गया है का वर्णन इन विट्रो प्रणाली विलियंस एट अल20के । हमारी प्रणाली में, OP9 stromal फीडर कोशिकाओं की आवश्यकता नहीं है, और इसके बजाय OP9 सशर्त माध्यम से इन विट्रो मेंNK कोशिकाओं के भेदभाव को प्रभावित किए बिना प्रयोग किया जाता है, और यह हाल ही में हमें उजागर करने के लिए नेतृत्व कि TGF-β के माध्यम से कैंसर प्रगति को बढ़ावा देने में सक्षम है 22microenvironment ट्यूमर में E4bp4-निर्भर NK कोशिका विकास को दबा. इस उपंयास प्रणाली को सफलतापूर्वक विशिष्ट शर्तों के तहत NK सेल विकास के आणविक तंत्र elucidating के लिए एक पृष्ठभूमि मुक्त विधि प्रदान करता है (जैसे, उच्च TGF-β1, सिरना-मध्यस्थता जीन मुंह, आदि.) इन विट्रो में।

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Protocol

प्राप्त करने और अंतर अस्थि मज्जा-व्युत्पंन NK कोशिकाओं (बीएम-NK) के लिए प्रोटोकॉल पहले प्रकाशित तरीकों20,21,22पर आधारित है । चूहों के साथ सभी प्रक्रियाओं को चीनी विश्वविद्यालय हांगकांग में पशु नैतिकता प्रयोगात्मक समिति (AEEC) द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. OP9 सशर्त माध्यम की तैयारी

  1. संस्कृति murine स्ट्रोमा सेल लाइन OP9 अल्फा-मेम युक्त में 20% FBS, १०० यू/एमएल पेनिसिलिन जी और १०० µ g/एमएल streptomycin, ३७ डिग्री सेल्सियस में हवा के एक humidified वायुमंडल में/सह2 (95%: 5%) ।
    1. एक hemocytometer के साथ कोशिकाओं गिनती, तो बीज 2 x 106 OP9 कोशिकाओं के लिए प्रत्येक ७५ सेमी2 संस्कृति कुप्पी के माध्यम से 15 मिलीलीटर के साथ । संस्कृति के लिए ४८ ज.
    2. जब संस्कृति ८०% संगम तक पहुंचती है, तो पंजाब के 10 मिलीलीटर के साथ कुप्पी को धो लें और कुप्पी के प्रति सादे अल्फा-मेम मीडियम (बिना FBS और एंटीबायोटिक्स) के 20 मिलीलीटर जोड़ें ।
  2. 24 एच में संस्कृति कुप्पी से OP9 हालत मध्यम लीजिए, ०.२५ µm polyethersulfone (पी इ एस) फिल्टर के साथ सेल मलबे को साफ और 4 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखने (2 सप्ताह के भीतर उपयोग) ।

2. माउस अस्थि मज्जा कोशिकाओं का अलगाव

  1. Euthanize एक 12-सप्ताहीय C57BL/6J माउस के साथ एक pentobarbitone ओवरडोज (१०० मिलीग्राम/किग्रा, intraperitoneal इंजेक्शन) । सांस लेने की कमी से मौत की पुष्टि करें, फिर हड्डियों के बीच जंक्शनों पर एक शल्य चाकू काटने के साथ फीमर हड्डियों फसल और कोमल खरोंच से ब्लेड के साथ शेष की मांसपेशियों को हटा दें ।
  2. एक ५० मिलीलीटर में हड्डियों प्लेस केंद्रापसारक अल्फा-मेम युक्त ट्यूब, और फिर एक सुरक्षा कैबिनेट में निंनलिखित चरणों का प्रदर्शन ।
  3. अल्फा-मेम मध्यम त्यागें, और 30 एस के लिए ७०% इथेनॉल के साथ हड्डियों कुल्ला ।
  4. शेष इथेनॉल को साफ करने के लिए दो बार बर्फ ठंडा बाँझ पंजाबियों के साथ हड्डियों को धो लें ।
  5. बर्फ ठंडा पंजाबियों के 5 मिलीलीटर युक्त एक मोर्टार में हड्डियों हस्तांतरण, और धीरे से एक मूसल (उंहें चूर नहीं) के साथ हड्डियों fragmentize ।
  6. धीरे से हड्डियों को उत्तेजित करने के लिए पंजाब में अस्थि मज्जा की कोशिकाओं को रिहा मूसल घूमता । एक नया ५० एमएल केंद्रापसारक ट्यूब में अस्थि मज्जा कोशिकाओं युक्त पंजाबियों लीजिए ।
  7. चार बार के लिए चरण २.६ दोहराएं जब तक कि हड्डी के टुकड़े ठोस रंग में सफेद हो जाते हैं ।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४६५ x g पर ट्यूब केंद्रापसारक, तो supernatant त्यागें ।
  9. बाँझ आसुत पानी की 18 मिलीलीटर के साथ गोली reसस्पेंड और यह लाल रक्त कोशिकाओं को दूर करने के लिए 30 एस के लिए खड़े हो जाओ ।
  10. बर्फ की 2 मिलीलीटर-ठंडा 10x पंजाबियों जोड़ें प्रतिक्रिया को रोकने के लिए, तो एक ७० µm सेल छलनी के माध्यम से मिश्रण फिल्टर लीजड लाल रक्त कोशिकाओं को दूर करने के लिए ।
  11. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४६५ x g पर ट्यूब केंद्रापसारक । बर्फ के 20 मिलीलीटर ठंडे पंजाबियों के साथ गोली reसस्पेंड ।
  12. दूसरी बार २.११ चरण दोहरा कर कक्षों को धोएं ।
  13. एक १००-mm बाँझ पेट्री डिश में सेल गोली स्थानांतरण १.२ 20% FBS और ०.५ एनजी/एमएल murine आईएल-7, 30 एनजी/एमएल माउस एससीएफ, और १०० के साथ पूरक के OP9 सशर्त मध्यम से 10 मिलीलीटर के साथ murine flt3L ।
  14. 2 एच के लिए 5% सह2 के साथ ३७ ° c पर पकवान मशीन । एक नई संस्कृति कंटेनर में एक घनत्व पर 5 x 105 व्यवहार्य कोशिकाओं/एमएल (trypan-नीले अपवर्जन के साथ hemocytometer द्वारा गिनती कोशिकाओं) के रूप में एक ही माध्यम सूत्र के साथ कदम २.१३ में संलग्न कोशिकाओं स्थानांतरण , और 5% CO2के साथ ३७ ° c पर मशीन ।
  15. 4 दिन पर, OP9 सशर्त मध्यम 20% FBS और २,००० U/एमएल murine आईएल-2 के साथ पूरक के लिए संस्कृति शर्त बदल जाते हैं ।
  16. संस्कृति माध्यम को हर 3 दिन रिफ्रेश करें; परिपक्व NK कोशिकाओं 7 दिन और योग्य के रूप में धारा 4 के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है ।

३. सिरना-NK कोशिकाओं में विभेद करने की मध्यस्थता जीन मुंह

  1. Premix उत्पाद मैनुअल के अनुसार एक अभिकर्मक एजेंट के साथ सिरना या बकवास नियंत्रण (नेकां) ।
  2. 0 दिन के बाद से किसी भी समय बिंदु पर ३.१ कदम प्रदर्शन ।
  3. २.१४ कदम से कोशिकाओं को सिरना या नेकां मिश्रण के ५० एनएम जोड़ें ।
  4. प्रत्येक मध्यम ताज़गी (उदा, दिन 0, 4, और 7) पर चरण ३.१ को प्रायोगिक समाप्ति बिंदु तक दोहराएं ।

4. NK कोशिका विभेद का विश्लेषण प्रवाह Cytometry का उपयोग

  1. एक उपयुक्त समय बिंदु पर, अंतर कोशिकाओं के निलंबन इकट्ठा और बर्फ ठंडा पंजाबियों के साथ धो लो ।
  2. कक्ष निर्धारण बफर के साथ उत्पाद मैनुअल के अनुसार कोशिकाओं को ठीक करें ।
  3. निश्चित कोशिकाओं को आइस-कोल्ड पंजाबियों से धोएं, और फिर 1:100 के कमजोर पड़ने वाले अनुपात में फ्लो Cytometry धुंधलान बफर के १०० µ l में 1 x 106 कोशिकाओं को पुनः निलंबित कर दें-संयुग्मित एंटी-माउस NKp46 और पीई-संयुग्मित एंटी-माउस CD244 एंटीबॉडी ।
  4. 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में नमूना दाग
  5. पंजाब के ३०० µ एल के साथ सना हुआ नमूनों को फिर से निलंबित करें, फिर FACS डेटा प्राप्त करें और Cytobank प्लेटफ़ॉर्म20 (http://cytobank.org/) के साथ विश्लेषण करे ।

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Representative Results

प्रतिनिधि परिणाम वर्णित प्रोटोकॉल के बाद प्राप्त कर रहे हैं । कुल अस्थि मज्जा निलंबन कोशिकाओं फीडर के तहत खेती की गई-मुक्त भेदभाव प्रणाली 11 दिनों के लिए; प्रसार दर में उल्लेखनीय वृद्धि 0 दिन (चित्रा 1) पर कुल कोशिकाओं की संख्या की तुलना में 7 दिन से मनाया गया । cytoplasmic अनुपात और दाना-रिच कोशिका आकृति के लिए उच्च परमाणु के साथ परिपक्व NK कोशिकाओं प्रणाली (चित्रा 1बी) में दिन 6 से पाया गया ।

NK सेल विभेदन में TGF-β1/Smad3 सिग्नलिंग के विनियामक प्रभाव को स्पष्ट करने के लिए, अस्थि मज्जा कोशिकाओं transfected सिरना के खिलाफ E4bp4 के साथ mRNA थे (siE4bp4, जो प्रभावी रूप से E4bp4 mRNA स्तर को दबा के रूप में चित्रा 2में दिखाया गया है) या बकवास फीडर-सेल फ्री सिस्टम में 0 दिन और 4 दिन पर नियंत्रण । अंतर कोशिकाओं के साथ या 6 दिनों के लिए Smad3 अवरोध करनेवाला SIS3 के बिना प्रणाली में कल्चरित थे. प्रवाह विश्लेषण का पता चला कि E4bp4 के पछाड़ना काफी हद तक NK कोशिका परिपक्वता दबा के रूप में CD244 में कमी के द्वारा दिखाए गए+ ve NKp46-ve अपरिपक्व NK कोशिकाओं नेकां-transfected नियंत्रण के साथ तुलना में, जबकि TGF के निषेध-β1/Smad3 सक्रियण काफी siE4BP4-transfected समूह के साथ तुलना में NK कोशिका परिपक्वता के सिरना मध्यस्थता दमन बचाता है (चित्रा 3) ।

Figure 1
चित्र 1 . अस्थि मज्जा की छवि-फीडर मुक्त प्रणाली से व्युत्पंन NK कोशिकाओं । (एक) अस्थि मज्जा प्रणाली में NK कोशिका भेदभाव के दौर से गुजर कोशिकाओं की वृद्धि वक्र दिन 11 तक, सेल गिनती द्वारा प्राप्त की । (ख) परिपक्व NK कोशिकाओं को उच्च परमाणु के साथ cytoplasmic अनुपात और granules से भरपूर कोशिका आकृति विज्ञान 6 दिन तक दिखाई देते हैं, के रूप में तीर से संकेत दिया । आवर्धन 200x, स्केल बार ५० µm । डेटा 3 स्वतंत्र प्रयोगों के लिए मतलब ± SEM का प्रतिनिधित्व करते हैं, * * *p < ०.०१ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 . सिरना की मध्यस्थता जीन मुंह के प्रभाव अस्थि मज्जा कोशिकाओं पर NK सेल भेदभाव के दौर से गुजर 6 । अंतर कोशिकाओं बकवास नियंत्रण (नेकां) या सिरना लक्ष्यीकरण murine E4bp4 mRNA (siE4bp4) दिन 0 और 4 दिन पर transfected थे । रीयल-टाइम पीसीआर से पता चलता है कि mRNA अभिव्यक्ति स्तर E4bp4 के एसआई-E4bp4 इलाज NK कोशिकाओं में 6 दिन पर नेकां समूह के साथ तुलना में कम था । डेटा 3 स्वतंत्र प्रयोगों के लिए ± SEM मतलब का प्रतिनिधित्व करते हैं, * *p < ०.०५ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 . E4bp4 के मुंह एक TGF-β1/Smad3-निर्भर तरीके से murine अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न NK कोशिकाओं के विभेद को रोकता है । (क) प्रवाह cytometry विश्लेषण से पता चलता है कि E4bp4 के पछाड़ना मोटे तौर पर उत्पादन में कमी आती है अपरिपक्व (CD244+ ve NKp46-ve) NK कोशिकाओं पर 6 दिन बकवास नियंत्रण (नेकां) समूह के साथ तुलना में फीडर-मुक्त प्रणाली का उपयोग करके इन विट्रो , जो काफी Smad3 अवरोधक SIS3 के 1 µ m के साथ TGF-β1/Smad3 सक्रियण को दबा कर बचाया जा सकता है । (B) प्रवाह विश्लेषण परिणामों की ठहराव, * * *p < ०.०१ की तुलना में नेकां; ### siE4BP4-transfected समूह की तुलना में p < ०.०१ । 3 स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि डेटा दिखाया जाता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Supplementary Figure 1
अनुपूरक आंकड़ा 1. 6 दिन पर कुल अंतर कोशिकाओं में NK सेल मार्कर अभिव्यक्ति के प्रवाह विश्लेषण के लिए गेटिंग रणनीति. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

वर्तमान काम में, हम अस्थि मज्जा के उत्पादन के लिए एक उपंयास विधि वर्णित है-व्युत्पंन murine NK कोशिकाओं में। मूल प्रणाली21,22 में सेल फीडर सफलतापूर्वक OP9 कोशिकाओं के सशर्त माध्यम है, जो काफी हद तक भेदभाव प्रणाली की स्थिरता में वृद्धि की जगह है । इसके अलावा, प्रणाली उच्च मात्रा और इन विट्रो में के लिए परिपक्व NK कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह से vivo में परख, जो यंत्रवत अध्ययन की सुविधा के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मानव रोगों में NK कोशिकाओं के शोधों के शोध कर सकते है की शुद्धता का उत्पादन कर सकते हैं ।

वर्णित विधि कैंसर विकास23के दौरान NK सेल दमन में TGF-β1 संकेतन की विनियामक भूमिका की जांच के लिए इस्तेमाल किया गया है । के रूप में वहाँ फीडर कोशिकाओं से कोई प्रभाव नहीं था, सिरना की दक्षता-मध्यस्थता जीन पछाड़ना के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अवरोधक मध्यस्थता निषेध काफी हद तक सुधार कर रहे हैं. फीडर कोशिकाओं OP9 की अनुपस्थिति हमें स्पष्ट रूप से E4BP4 में Smad3 के जैविक समारोह मध्यस्थता NK सेल विकास, पछाड़ना या लक्ष्य जीन की बाधा को दिखाकर इन विट्रो में23को प्रदर्शित करने के लिए अनुमति देता है ।

इससे भी महत्वपूर्ण बात, इस प्रणाली को और अधिक vivo में परख के लिए आनुवंशिक रूप से संशोधित murine NK कोशिकाओं की एक बड़ी राशि के उत्पादन के लिए उपयोग किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, हम इस प्रणाली के द्वारा एक ही माउस की अस्थि मज्जा कोशिकाओं से, और एक विशिष्ट जीन के पछाड़ना के साथ NK कोशिकाओं ट्यूमर असर मंजूरी/SCID माउस मॉडल में अंतर का प्रदर्शन करने के लिए संचार किया गया में कम से 1 x 108 परिपक्व NK कोशिकाओं का उत्पादन किया है वीवो मेंकैंसर-हत्या प्रभाव23. दरअसल, अन्य संशोधनों इस प्रणाली में NK कोशिकाओं पर किया जा सकता है, इस तरह के वायरल के रूप में मध्यस्थता जीन एक्सप्रेस, सेल धुंधला, आदि

हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि परिपक्व NK कोशिकाओं के एक अधिकतम ७०% 9 दिन पर प्रणाली से उत्पादन किया जा सकता है (नहीं दिखाया गया डेटा), जो OP9 stromal विलियंस एट अलद्वारा दिखाए गए के साथ संस्कृति प्रणाली के परिणाम के समान है । 21 इस सीमा को दूर करने के लिए, मिश्रित NK कोशिकाओं को आगे एक मशीन छंटाई प्रवाह के साथ शुद्ध किया जा सकता है, साथ ही साथ वाणिज्यिक NK सेल अलगाव किट के क्रम में वांछित जनसंख्या को अलग करने के लिए ।

अंत में, murine अस्थि मज्जा कोशिकाओं से NK कोशिकाओं विभेद के लिए एक नई विधि विकसित की है । यह उपंयास प्रणाली मानव रोगों में प्रतिरक्षा के अध्ययन के लिए परिपक्व NK कोशिकाओं की उच्च शुद्धता और मात्रा प्राप्त करने के लिए एक विकल्प प्रदान कर सकते हैं ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन के हांगकांग के अनुसंधान अनुदान परिषद द्वारा समर्थित किया गया था (GRF ४६८५१३, CUHK3/CRF/12R) और हांगकांग के नवाचार और प्रौद्योगिकी कोष (इसके/227/15, इसके InP/164/16, इसके-InP/242/16), अनुसंधान के लिए प्रत्यक्ष अनुदान-CUHK (२०१६.०३५), और हांगकांग के विद्वान कार्यक्रम.

एच.-Y.L. डिजाइन और सभी प्रयोगों की निगरानी और पांडुलिपि तैयारी में योगदान दिया । बजे-K.T. प्रयोगों का प्रदर्शन किया, डेटा का विश्लेषण और पांडुलिपि तैयारी में योगदान दिया । पीसी-टी. टी., J.Y.-एफसीए, जे-सी., एच., क्यू.-M.W., और जी.-Y.L. ने पशु नमूने एकत्र किए और पशु प्रयोगों में भाग लिया. जे, X.-R.H., और K.-F.T. पांडुलिपि तैयारी में योगदान दिया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
OP9 cell line ATCC ATCC® CRL-2749™
MEM α, no nucleosides Gibco 22561021
Fetal Bovine Serum Gibco 10500064
PBS, pH 7.4 Gibco 10010049
Recombinant Murine IL-7 PEPROTECH 217-17
Recombinant Murine SCF PEPROTECH 250-03
Recombinant Murine Flt3-Ligand PEPROTECH 250-31L
Recombinant Murine IL-2 PEPROTECH 212-12
Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent Invitrogen 1377815
IC Fixation Buffer  eBioscience 00-8222-49
Flow Cytometry Staining Buffer  eBioscience 00-4222-26
PE-conjugated anti-mouse CD244 eBioscience 12-2441-83
Cy3-conjugated anti-mouse NKp46 Bioss bs-2417R-cy3
Nonsense control (NC) Ribobio siN05815122147
siRNA against mouse E4BP4 mRNA Ribobio N/A 5′-GAUGAGGGUGUA
GUGGGCAAGUCUU-3′

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References

  1. Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. Cancer immunoediting: integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion. Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).
  2. Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response. Nature. 501 (7467), 346-354 (2013).
  3. Rusakiewicz, S., et al. Immune infiltrates are prognostic factors in localized gastrointestinal stromal tumors. Cancer Res. 73 (12), 3499-3510 (2013).
  4. Mamessier, E., et al. Human breast cancer cells enhance self tolerance by promoting evasion from NK cell antitumor immunity. J Clin Invest. 121 (9), 3609-3622 (2011).
  5. Stern, M., et al. Pre-emptive immunotherapy with purified natural killer cells after haploidentical SCT: a prospective phase II study in two centers. Bone Marrow Transplant. 48 (3), 433-438 (2013).
  6. Miller, J. S., et al. Successful adoptive transfer and in vivo expansion of human haploidentical NK cells in patients with cancer. Blood. 105 (8), 3051-3057 (2005).
  7. Rubnitz, J. E., et al. NKAML: a pilot study to determine the safety and feasibility of haploidentical natural killer cell transplantation in childhood acute myeloid leukemia. J Clin Oncol. 28 (6), 955-959 (2010).
  8. Curti, A., et al. Successful transfer of alloreactive haploidentical KIR ligand-mismatched natural killer cells after infusion in elderly high risk acute myeloid leukemia patients. Blood. 118 (12), 3273-3279 (2011).
  9. Bachanova, V., et al. Clearance of acute myeloid leukemia by haploidentical natural killer cells is improved using IL-2 diphtheria toxin fusion protein. Blood. 123 (25), 3855-3863 (2014).
  10. Stringaris, K., et al. Leukemia-induced phenotypic and functional defects in natural killer cells predict failure to achieve remission in acute myeloid leukemia. Haematologica. 99 (5), 836-847 (2014).
  11. Rouce, R. H., et al. The TGF-β/SMAD pathway is an important mechanism for NK cell immune evasion in childhood B-acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 30 (4), 800-811 (2016).
  12. Derynck, R., Akhurst, R. J., Balmain, A. TGF-β signaling in tumor suppression and cancer progression. Nature Genet. 29 (2), 117-129 (2001).
  13. Massague, J. TGFbeta in cancer. Cell. 134 (2), 215-230 (2008).
  14. Ikushima, H., Miyazono, K. TGFbeta signalling: a complex web in cancer progression. Nat Rev Cancer. 10 (6), 415-424 (2010).
  15. Pickup, M., Novitskiy, S., Moses, H. L. The roles of TGFβ in the tumour microenvironment. Nat Rev Cancer. 13 (11), 788-799 (2013).
  16. Rook, A. H., et al. Effects of transforming growth factor beta on the functions of natural killer cells: depressed cytolytic activity and blunting of interferon responsiveness. J Immunol. 136 (10), 3916-3920 (1986).
  17. Bellone, G., Aste-Amezaga, M., Trinchieri, G., Rodeck, U. Regulation of NK cell functions by TGF-beta 1. J Immunol. 155 (3), 1066-1073 (1995).
  18. Trotta, R., et al. TGF-β utilizes SMAD3 to inhibit CD16-mediated IFN-γ production and antibody-dependent cellular cytotoxicity in human NK cells. J Immunol. 181 (6), 3784-3792 (2008).
  19. Shull, M. M., et al. Targeted disruption of the mouse transforming growth factor-β1 gene results in multifocal inflammatory disease. Nature. 359 (6397), 693-699 (1992).
  20. Chen, T. J., Kotecha, N. Cytobank: providing an analytics platform for community cytometry data analysis and collaboration. Curr Top Microbiol Immunol. 377, 127-157 (2014).
  21. Williams, N. S., et al. Differentiation of NK1.1+, Ly49+ NK cells from flt3+ multipotent marrow progenitor cells. J Immunol. 163 (5), 2648-2656 (1999).
  22. Fathman, J. W., et al. Identification of the earliest natural killer cell-committed progenitor in murine bone marrow. Blood. 118 (20), 5439-5447 (2011).
  23. Tang, P. M., et al. Smad3 promotes cancer progression by inhibiting E4BP4-mediated NK cell development. Nat Commun. 6 (8), 14677 (2017).

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इम्यूनोलॉजी अंक १३१ NK सेल फीडर-फ्री जीन मुंह TGF-β1 विभेद OP9
एक उपंयास फीडर <em>इन विट्रो में</em> Murine प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए मुफ्त प्रणाली
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