Immunology and Infection

En roman mater-fritt System for masseproduksjon av Murine naturlige drepe celler In Vitro

Published: January 9, 2018 doi: 10.3791/56785

Patrick Ming-Kuen Tang^1,2, Philip Chiu-Tsun Tang², Jeff Yat-Fai Chung², Jessica Shuk Chun Hung², Qing-Ming Wang², Guang-Yu Lian², Jingyi Sheng², Xiao-Ru Huang², Ka-Fai To¹, Hui-Yao Lan²

¹Department of Anatomical and Cellular Pathology, The Chinese University of Hong Kong, ²Li Ka Shing Institute of Health Sciences and Department of Medicine & Therapeutics, The Chinese University of Hong Kong

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å masseprodusere gen-stanse murine NK celler ved hjelp av en mater-fri differensiering system for mekanistisk studie i vitro og i vivo.

Abstract

Naturlig morderen celler (NK) tilhører det medfødte immunsystemet og er en første linje anti-kreft immunforsvar forsvar; men de er undertrykt i svulst microenvironment og den underliggende mekanismen er fortsatt hovedsakelig ubekjent. Mangelen på en konsistent og pålitelig kilde av NK celler begrenser forskning fremdriften av NK celle immunitet. Her rapporterer vi et i vitro system som kan gi høy kvalitet og kvantitet av bein margtransplantasjon-avledet murine NK celler under en mater-fri tilstand. Enda viktigere, viser vi også at siRNA-mediert genet stanse vellykket hemmer E4bp4-avhengige NK celle modning ved hjelp av dette systemet. Dermed er denne romanen i vitro NK cellen differensiering systemet en biomateriale løsning for immunitet forskning.

Introduction

Kreft progresjon er i stor grad avhengig av svulst microenvironment¹^,², inkludert vert-avledet immunocytes, f.eks, NK celler. Flere studier har vist at intratumoral NK celler er negativt korrelert med tumor progresjon³^,⁴. I tillegg viste kliniske studier at NK cellen adoptivforeldre terapi er en mulig strategi for cancer⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹. NK cellebasert kreft immunterapi ble nylig foreslått som et terapeutisk alternativ for solide svulster, men utfordringene finnes utskillelsen av suppressive cytokiner og downregulation å aktivere ligander i microenvironment av solide svulster¹⁰^,¹¹. Omforming vekst faktor-β (TGF-β) har blitt foreslått for å spille en undertrykkende rolle i kreft, men paradoksalt kreftceller også produsere TGF-β1 for å støtte de tumor utvikling¹²^,¹³^,¹⁴ ^, ¹⁵. TGF-β signalering kan undertrykke cytolytic aktiviteten av NK celler via ned-regulere interferon respons og CD16-mediert interferon-gamma (IFN-γ) produksjon i vitro¹⁶^,¹⁷^, ¹⁸.

Selv om avbrudd av TGF-β signalering i svulst microenvironment kan være en mulig måte for å eliminere kreft, vil helt blokkere TGF-β signalering føre autoimmune sykdommer på grunn av sin anti-inflammatorisk funksjon, som dokumentert av utviklingen av uønskede bivirkninger, inkludert systemisk betennelse, modeller hjerte feil og autoimmunitet musen¹⁹. Dermed vil forstå arbeidsgruppen mekanisme av TGF-β-mediert immunsuppresjon føre til identifikasjon av en tilgjengelig terapeutisk mål for behandling av kreft.

For å belyse molekylære hendelsene nødvendig for NK celle utvikling, etablert Williams et al. et i vitro system for skille murine benmarg blodkreft stamceller i NK celler²⁰. Dette systemet muliggjør hovedsakelig mekanistisk studiet av NK celle utvikling, inkludert identifikasjon av romanen progenitors av NK celler²¹. Men det benmarg progenitors bør kultivert i systemet med støtte OP9 stromal celler som mater lag²⁰^,²¹, og denne heterogene celle befolkningen stort sett begrenser ytterligere anvendelsen av gen-forstyrre verktøy (f.ekssiRNA-mediert genet stanse) spesielt gjelder for unike NK-cellene.

Her beskriver vi en mater-fritt system som er utviklet ved ytterligere å endre systemet i vitro Williams et al²⁰. I systemet vårt, OP9 stromal mater cellene er ikke nødvendig, og i stedet OP9 betinget mediet brukes uten å påvirke differensiering av NK celler i vitro, og dette sist fører oss til å avdekke det TGF-β er kjøpedyktig fremme kreft progresjon via undertrykke E4bp4-avhengige NK celle utvikling i svulst microenvironment²². Dette nye systemet hell gir bakgrunn-fri metode for Klargjørende molekylær mekanismen av NK celle utvikling under bestemte forhold (f.ekshøy TGF-β1, siRNA-mediert genet stanse, etc.) i vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokollen er for å skaffe og skille Ben margtransplantasjon-avledet NK celler (BM-NK) basert på tidligere publiserte metoder²⁰^,²¹^,²². Alle prosedyrer med mus er godkjent av det dyr etikk eksperimentelle Committee (AEEC) på kinesisk Universitetet i Hongkong.

1. forberedelse av OP9 betinget Medium

Kultur murine stroma celle linjen OP9 i alpha-MEM inneholder 20% FBS, 100 U/mL penicillin G og 100 µg/mL streptomycin, på 37 ° C i et fuktet luft/CO₂ (95%: 5%).
1. Telle celler med en hemocytometer, deretter frø 2 x 10⁶ OP9 celleområdet til hver 75 cm² kultur kolbe med 15 mL av medium. Kultur for 48 timer.
2. Når kultur når 80% samløpet, vask flasken 10 mL PBS og legge til 20 mL av vanlig alpha-MEM medium (uten FBS og antibiotika) per kolbe.
Samle OP9 tilstand mediet fra kultur kolbe på 24 h, rydde opp celle rusk med 0,25 µm polyethersulfone (PES) filter og ta vare på 4 ° C (bruk innen 2 uker).

2. isolering av musen bein margtransplantasjon celler

Euthanize en 12-uke-gamle C57BL/6J mus med en pentobarbitone overdose (100 mg/kg, intraperitoneal injeksjon). Bekrefte død av mangel på pust, og deretter høste femur Ben med en kirurgisk kniv kutte på veikryss mellom bein og fjerne gjenværende muskler med bladet ved å forsiktig skrape.
Plasser bein i et 50 mL sentrifuge rør som inneholder kjølt sterilt alpha-MEM, og deretter utføre følgende i en biosafety kabinett.
Forkaste alpha-MEM medium, og skyll bein med 70% etanol for 30 s.
Vask bein med iskald sterilt PBS to ganger for å rydde opp de resterende etanol.
Overføre bein i en morter inneholder 5 mL av iskalde PBS og forsiktig fragmentize bein med en støter (ikke pulverisere dem).
Agitere bein forsiktig av virvlende pistil å løslate benmarg cellene i PBS. Samle PBS som inneholder benmarg cellene i en ny 50 mL sentrifuge tube.
Gjenta trinn 2.6 for fire ganger til beinfragmenter blir heldekkende hvit i fargen.
Sentrifuge røret 465 x g i 5 min på 4 ° C, og forkaste nedbryting.
Resuspend pellets med 18 mL steril destillert vann og la det stå i 30 å fjerne røde blodlegemer.
Legge til 2 mL iskald 10 X PBS stoppe reaksjonen, deretter filtrere blandingen gjennom en 70 µm celle sil for å fjerne lysed røde blod celler.
Sentrifuge røret 465 x g i 5 min på 4 ° C. Resuspend pellets med 20 mL iskald PBS.
Vask cellene ved å gjenta trinn 2.11 en gang.
Overføre celle pellets til et 100 mm sterilt Petriskål med 10 mL OP9 betinget medium fra trinn 1.2 supplert med 20% FBS og en blanding av 0,5 ng/mL murine IL-7, 30 ng/mL musen SCF og 100 U/mL murine flt3L.
Inkuber retten på 37 ° C med 5% CO₂ for 2 h. overføring fristilt cellene i en ny kultur container på en tetthet på 5 x 10⁵ levedyktig celler/mL (antall celler av hemocytometer med trypan-blå utelukkelse) med samme medium formel som i trinn 2.13 , og Inkuber på 37 ° C med 5% CO₂.
På dag 4 supplert endre betingelsen kultur til OP9 betinget middels med 20% FBS og 2000 U/mL murine IL-2.
Oppdatere kultur medium hver 3 dager. eldre NK celler kan oppnås ved dag 7 og kvalifisert i Seksjon 4.

3. siRNA-mediert Gene Silencing skille NK celler

Premix siRNA eller tull kontrollen (NC) med en transfection agent etter produkt manuell.
Utfør trinn 3.1 til enhver tid siden dagen 0.
Legge til 50 nM i siRNA eller NC blanding til cellene fra trinn 2.14.
Gjenta trinn 3.1 på hver middels forfriskninger (f.eksdag 0, 4 og 7) til eksperimentelle endepunktet.

4. analyse av NK celledifferensiering bruker flowcytometri

På et passende tidspunkt, samle suspensjon av differensiering cellene og vask med iskaldt PBS.
Fastsette cellene med cellen fiksering bufferen etter produkt manuell.
Vask fast cellene med iskald PBS, og deretter resuspend 1 x 10⁶ celler i 100 µL Flow cytometri flekker Buffer som inneholder Cy3-konjugerte anti-mus NKp46 og PE-konjugerte antistoffer for anti-mus-CD244 i fortynning forholdet 1: 100.
Stain prøven i mørket ved romtemperatur for 2T.
Resuspend farget prøvene med 300 µL av PBS, da anskaffe FACS data og analysere med Cytobank plattformen²⁰ (http://cytobank.org/).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Får representant resultater følger beskrevet protokollen. Totalt benmarg suspensjon celler ble dyrket under mater-fri differensiering system for 11 dager; betydelig økning i spredningen rate ble observert av dag 7 sammenlignet med antall totale celler på dag 0 (figur 1A). Eldre NK celler med høy kjernefysiske til cytoplasmatiske ratio og granule-rik cytoplasma morfologi ble funnet etter dag 6 i systemet (figur 1B).

For å belyse regulatoriske effekten av TGF-β1/Smad3 signalering i NK celledifferensiering, bein margtransplantasjon celler var transfekterte med siRNA mot E4bp4 mRNA (siE4bp4, som effektivt undertrykker E4bp4 mRNA nivå som vist i figur 2) eller tull styre på dag 0 og dag 4 i mater-cellen gratis system. Unike cellene ble kultivert i systemet med eller uten Smad3 hemmer SIS3 for 6 dager. Flyt analyse oppdaget at knockdown av E4bp4 hovedsakelig undertrykt NK celle modning som vist av reduksjonen i CD244^{+ ve} NKp46^ve umodne celler NK sammenlignet med NC-transfekterte kontroll, mens hemming av TGF-β1/Smad3 aktivisering betydelig redder siRNA-mediert undertrykkelse av NK celle modning sammenlignet med gruppen siE4BP4-transfekterte (Figur 3).

Figur 1 . Bilde av Ben margtransplantasjon-avledet NK celler fra mater-fri systemet. (A) vekst kurve av bein margtransplantasjon celler gjennomgår NK celledifferensiering i systemet til dag 11, ved celle teller. (B) modne NK celler med høy kjernefysiske til cytoplasmatiske ratio og granule-rik cytoplasma morfologi vises etter dag 6, som vist med piler. Forstørrelse 200 x, skala bar 50 µm. Data representerer betyr ± SEM for 3 uavhengige eksperimenter, ***p < 0,01. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2 . Effekten av siRNA-mediert genet silencing på bein margtransplantasjon celler i NK celledifferensiering på dag 6. Unike cellene var transfekterte med tull (NC) eller siRNA rettet mot murine E4bp4 mRNA (siE4bp4) på dag 0 og dag 4. Sanntid PCR viser at mRNA uttrykk nivå av E4bp4 ble betydelig redusert i si-E4bp4 behandlet NK celler på dag 6 sammenlignet med gruppen NC. Dataene representerer gjennomsnittlig ± SEM for 3 uavhengige eksperimenter, **p < 0,05. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3 . Stanse E4bp4 hemmer differensiering av murine Ben margtransplantasjon-avledet NK celler i en TGF-β1/Smad3-avhengige måte. (A) flyt cytometri analyser viser at knockdown av E4bp4 i stor grad reduserer produksjonen av umodne (CD244^{+ ve} NKp46^ve) NK celler på dag 6 sammenlignet med tull kontrollgruppen (NC) ved hjelp av mater-ledig system i vitro , som vesentlig kan reddes ved å undertrykke TGF-β1/Smad3 aktivisering med 1 µM av Smad3 hemmer SIS3. (B) kvantifisering av flyt analyseresultatene, ***p < 0,01 sammenlignet med NC; ^### p < 0,01 sammenlignet med siE4BP4-transfekterte gruppe. Representant data 3 uavhengige eksperimenter vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplementary Figure 1
Supplerende figur 1. Gating strategi for flyt analyse av NK celle markør uttrykk i total skille celler på dag 6. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I den nåværende arbeidet, har vi beskrev en roman metode for å produsere Ben margtransplantasjon-avledet murine NK celler i vitro. Cellen materen i det opprinnelige system²¹^,²² er erstattet av betinget mediet av OP9 celler, som i stor grad økte stabiliteten av differensiering. I tillegg systemet kan produsere høy mengde og renhet av modne NK celler i vitro samt i vivo analyser, som kan lette den mekanistiske studie samt translasjonsforskning NK celler i menneskelige sykdommer.

Metoden beskrevet er brukt for å undersøke regulerende rolle TGF-β1 signalering i NK celle undertrykkelse under kreft utvikling²³. Da var det ingen innflytelse fra materen celler, forbedret i stor grad effektiviteten i siRNA-mediert genet knockdown samt inhibitor-mediert hemming. Fravær av materen cellene OP9 tillater oss å tydelig vise den biologiske funksjonen til Smad3 i E4BP4-mediert NK celle utvikling, ved å vise knockdown eller hemming av målet gener i vitro²³.

Enda viktigere, kan dette systemet videre benyttes for å produsere en stor mengde genmodifiserte murine NK celler for i vivo analyser. For eksempel vi har produsert minst 1 x 10⁸ modne NK celler fra benmargen cellene i et enkelt museklikk av dette systemet, og NK cellene med knockdown med et bestemt ble blandet inn i svulst rentebærende hilsen/SCID musemodell å demonstrere forskjellen i kreft-drapet effekter i vivo²³. Faktisk kan andre endringer gjøres på NK cellene i dette systemet, som viral-mediert genet overuttrykte, celle flekker, etc.

Det bør imidlertid bemerkes at en maksimal 70% av modne NK celler kan produseres fra systemet på dag 9 (data ikke vist), som ligner resultatet av kultivert systemet med OP9 stromal vist av Williams et al. ²¹ for å overkomme denne begrensningen, blandet NK cellene kan bli ytterligere renset med en flyt sortering maskin, samt kommersielle NK celle isolasjon kits for å isolere befolkningen ønsket.

Som konklusjon, er en ny metode for å skille NK celler fra murine bein margtransplantasjon celler utviklet. Denne romanen system kan gi en mulighet for høy renhetsgrad og antall eldre NK celler for studiet av immunitet i menneskelige sykdommer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet av forskning tilskudd Council av Hongkong (GRF-468513, CUHK3/CRF/12R) og innovasjon og teknologi Fund av Hong Kong (ITS/227/15, ITS inngangen/164/16, ITS-inngangen/242/16), direkte stipend for forskning-CUHK (2016.035) og Hong Kong Scholar Programmet.

H.-Y.L. designet og overvåket alle eksperimenter og bidratt til manuskriptet forberedelse. PM-K.T. utført eksperimenter, analyserte data og bidratt til manuskriptet forberedelse. PC-T. T., J.Y.-FC, JS-C., H., Q.-M.W., G.-Y.L. samlet dyr prøver og deltok i dyreforsøk. JS, X.-R.H., og K.-F.T. bidro til manuskriptet forberedelse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
OP9 cell line	ATCC	ATCC^® CRL-2749^™
MEM α, no nucleosides	Gibco	22561021
Fetal Bovine Serum	Gibco	10500064
PBS, pH 7.4	Gibco	10010049
Recombinant Murine IL-7	PEPROTECH	217-17
Recombinant Murine SCF	PEPROTECH	250-03
Recombinant Murine Flt3-Ligand	PEPROTECH	250-31L
Recombinant Murine IL-2	PEPROTECH	212-12
Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent	Invitrogen	1377815
IC Fixation Buffer	eBioscience	00-8222-49
Flow Cytometry Staining Buffer	eBioscience	00-4222-26
PE-conjugated anti-mouse CD244	eBioscience	12-2441-83
Cy3-conjugated anti-mouse NKp46	Bioss	bs-2417R-cy3
Nonsense control (NC)	Ribobio	siN05815122147
siRNA against mouse E4BP4 mRNA	Ribobio	N/A	5′-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3′