Summary

Ein veränderter Split-TET2 Enzym für chemische-induzierbaren DNA Hydroxymethylation und epigenetische Umbau

Published: December 18, 2017
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Summary

Detaillierte Protokolle für die Einführung ein veränderter Split-TET2 Enzym (Apfelwein) in Säugerzellen für chemische induzierbaren DNA-Hydroxymethylation und epigenetische Umbau werden vorgestellt.

Abstract

DNA-Methylierung ist eine stabile und vererbbare epigenetische Modifikation im Säugetier-Genom und engagiert sich bei der Regulierung der Genexpression Zellfunktionen steuern. Die Umkehrung der DNA-Methylierung und DNA Demethylierung wird durch die zehn-elf-Translokation (TET)-Proteinfamilie von Dioxygenases vermittelt. Obwohl es weit berichtet wurde, dass aberrante DNA-Methylierung und Demethylierung Entwicklungsschäden und Krebs zugeordnet sind, tragen wie diese epigenetischen Veränderungen unmittelbar auf die nachträgliche Veränderung im gen-Expression oder Krankheit Fortschreiten bleibt unklar, hauptsächlich aufgrund der Mangel an zuverlässigen Tools genau hinzufügen oder Entfernen von DNA-Veränderungen im Genom mit definierten zeitlichen und räumlichen Auflösung. Um diese Hürde zu überwinden, entwarfen wir ein Split-TET2 Enzym, zeitliche Steuerung der 5-Methylcytosine (5mC) Oxidation und anschließenden Umbau des epigenetischen Staaten in Säugerzellen durch einfaches Hinzufügen von Chemikalien zu ermöglichen. Hier beschreiben wir Methoden für die Einführung einer Chemikalie-induzierbaren Epigenom umgestaltet Tools (Apfelwein), basierend auf ein Enzym entwickelt Split-TET2 in Säugetierzellen und Quantifizierung der chemischen induzierbaren Produktion des 5-Hydroxymethylcytosine (5hmC) mit Immunostaining, Durchflusszytometrie oder eine Dot-Blot-Test. Diese Chemikalie-induzierbaren Epigenom Umbau Werkzeug finden breite Verwendung in Verhören zellulare Systeme ohne Veränderung des genetischen Codes sowie in Epigenotype−phenotype Beziehungen in verschiedenen biologischen Systemen zu sondieren.

Introduction

DNA-Methylierung, meist bezieht sich auf die Zugabe von einer Methylgruppe an die Carbon 5 Position von Cytosin, 5-Methylcytosine (5mC) zu bilden, ist durch DNA-Methyl-Transferasen (DNMTs) katalysiert. 5mC fungiert als eine wichtige epigenetische Markierung im Säugetier-Genom, das oft für transkriptionellen Repression, X-Chromosom Inaktivierung und Transposon-Stummschaltung1signalisiert. Die Umkehrung der DNA-Methylierung wird durch die zehn Elfen Translokation (TET) Protein-Familie vermittelt. TET Enzyme gehören zum Eisen (II) und 2 Oxoglutarate abhängigen Dioxygenases, die die aufeinanderfolgenden Oxidation von 5mC, 5-Hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-Formylcytosine (5-Fu) und 5-Carboxycytosine (5caC) katalysieren. TET-vermittelten 5mC Oxidation stellt einen zusätzlichen epigenetischen Kontrolle über das Säugetier-Genom. Die Entdeckung der TET löste intensives Interesse an epigenetischen Bereich, die biologischen Funktionen von TET Proteine und ihre katalytische Hauptprodukt 5hmC zu enthüllen. 5hmC ist nicht nur ein Zwischenprodukt während der TET-vermittelte aktive DNA Demethylierung2,3,4, aber auch Handlungen als stabile epigenetische markieren,5,6,7,8 . Zwar DNA Hydroxymethylation hoch korreliert mit Genexpression und aberrante sind Veränderungen der DNA-Hydroxymethylation mit einige menschliche Störungen9,10,11, die kausale Beziehungen verbunden zwischen epigenetische Veränderungen an der DNA und die Phänotypen bleiben oft anspruchsvoll eingerichtet werden, die teilweise zugeschrieben werden kann, um den Mangel an zuverlässigen Werkzeug genau hinzufügen oder Entfernen von DNA-Veränderungen im Genom an definierten zeitlichen und räumlichen Auflösung.

Hier berichten wir über die Verwendung von einer Chemikalie-induzierbaren Epigenom Umbau Werkzeug (Apfelwein) zur Überwindung der Hürde mit Blick auf Studien von Kausalbeziehungen zwischen DNA-Hydroxymethylation und gen-Transkription. Das Design basiert auf der Annahme, dass die katalytische Domäne von TET2 (TET2CD) in zwei inaktive Fragmente ausgedrückt in Säugetierzellen aufgeteilt werden kann und seine enzymatische Funktion wiederhergestellt werden kann, indem ein chemisch induzierbare Dimerisierung Ansatz ( Abbildung 1A). Um ein Split-TET2CD-System zu etablieren, haben wir sechs Standorte in TET2CD, bestehend aus einem Cys-reiche Region und eine doppelsträngige β-Helix (DSBH) Falte, auf der Grundlage einer gemeldeten Kristallstruktur von TET2-DNA-Komplex, der eine geringe Komplexität Region12fehlt. Ein synthetisches Gen Kodierung Rapamycin-induzierbaren Dimerisierung Modul FK506 bindendes Protein 12 (FKBP12) und FKBP Rapamycin bindende Domäne (FRB) des Säugetier-Ziel von Rapamycin14,15, zusammen mit einem selbst anhaftenden Peptid T2A Polypeptid Sequenz16,17, wurde einzeln in ausgewählten Teilen Websites innerhalb TET2CD eingefügt. Die Auswahl von TET2 als unser engineering Ziel basiert auf folgenden Überlegungen. Erste, somatische Mutationen im TET2 mit gleichzeitiger Reduzierung der DNA-Hydroxymethylation sind häufig zu beobachten bei menschlichen Erkrankungen einschließlich myeloische Erkrankungen und Krebs10, liefert nützlichen Informationen auf sensiblen Standorten vermieden werden sollen einsetzen. Zweitens ist ein großer Teil der TET2 katalytische Domäne, besonders in die geringe Komplexität der Region, für die enzymatische Funktion12, so dass wir eine minimierte Split-TET2 für induzierbaren epigenetische Modifikationen Handwerk entbehrlich. Nach der Durchleuchtung über 15 Konstrukte, wurde ein Konstrukt, das höchste Rapamycin-induzierbaren Wiederherstellung der seine enzymatische Aktivität im Säugetier-System ausgestellt gewählt und als Apfelwein18bezeichnet. Wir beschreiben hier die Verwendung des mCherry-Tags Apfelwein induzierbaren DNA-Hydroxymethylation und epigenetische Umbau mit Rapamycin zu erreichen, und drei Methoden zur Validierung von Apfelwein-vermittelten 5hmC Produktion in einem Modell Zellsystem HEK293T zu präsentieren.

Protocol

(1) Zell-Kultur, Plasmid Transfection und chemische Induktion Kultur eine adhärente Zell-Linie (z. B. der menschlichen embryonalen Niere HEK293T Zelle) in Dulbeccos modifizierten Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % Hitze-inaktivierten fötalen Rinderserum, 100 U/mL Penicillin und Streptomycin bei 37 ° C mit 5 % CO2. Transfizieren Sie Zellen mit dem Apfelwein-Plasmid. Mindestens 18 Stunden vor Transfektion, 0,3 x 106 Samenzellen in 2,5 mL des en…

Representative Results

Chemische induzierbaren 5mC-5hmC-Umwandlung kann durch Immunostaining auf einzellige, Flow-Zytometrie-Analyse auf transfizierten (mCherry-positiv) Zell-Populationen, oder eine mehr quantitative Dot-Blot-Test wie in Abbildung 1dargestellt validiert werden. Die katalytische Domäne von TET2 oder TET2CD, wurden während der Studie als Positivkontrolle verwendet. Siehe Referenzen 18-20 für weitere Einzelheiten über die genomweite Kartierung von Rapamycin-induzi…

Discussion

Hier haben wir gezeigt, die Verwendung eines technischen Split-TET2 Enzyms, zeitliche Steuerung der DNA-Hydroxymethylation zu erreichen. Nach der Entdeckung des TET-Familie von 5-Methycytosine-Dioxygenase wurden viele Studien durchgeführt, um die biologischen Funktionen von TET Proteine und ihre katalytische Hauptprodukt 5hmC1,2,3zu entschlüsseln, 4,5,…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir bedanken uns bei den finanziellen Unterstützungen von den National Institutes of Health zu gewähren (R01GM112003, YZ), Welch Foundation (BE-1913 bis YZ), der American Cancer Society (RSG-16-215-01 FSME, YZ) und Cancer Prevention Research Institute of Texas (RR140053, YH, RP170660, YZ), der American Heart Association (16IRG27250155, YH), und John S. Dunn Stiftung Verbundforschung Award Programm.

Materials

Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668027
Rapamycin Sigma-Aldrich 37094
Paraformaldehyde, 16% Solution VWR 100503-916
Triton X-100 Amresco 0694-1L
Hydrochloric Acid Amresco 0369-500ML
Albumin, Bovine Amresco 0332-100G
Tween 20 Amresco 0777-1L
5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) antibody (pAb) Active Motif 39769
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11008
4,6-Diamidino-2-phenylindolde (DAPI) Biotium 40043
SVAC1E SHEL LAB Economy Vacuum Oven, 0.6 Cu.Ft. (17 L) SHEL LAB SVAC1E
UltraPure SSC, 20X Thermo Fisher Scientific 15557036
Bio-Dot Apparatus BIO-RAD 1706545
Anti-5-methylcytosine (5mC) Antibody, clone 33D3 Millipore MABE146
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076S
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074S
West-Q Pico Dura ECL Solution Gendepot W3653-100

References

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Cite This Article
Lee, M., Zhou, Y., Huang, Y. An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling. J. Vis. Exp. (130), e56858, doi:10.3791/56858 (2017).

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