화학을 유도할 수 있는 DNA Hydroxymethylation 및 후 리 모델링 설계 분할-TET2 효소
Summary
자세한 프로토콜 설계 분할-TET2 효소 (사이 다) 화학 유도할 수 있는 DNA hydroxymethylation 및 후 리 모델링 포유류 세포에 도입 되 게 됩니다.
Abstract
DNA 메 틸 화 포유류 게놈에 안정적이 고 상속 후 성적인 수정 이며, 세포 기능 제어 유전자 발현 조절에 관여. DNA 메 틸 화, 또는 DNA demethylation의 반전은 dioxygenases의 10-11 전 (TET) 단백질 가족에 의해 중재 됩니다. 그것은 널리 알려졌다 탈 DNA 메 틸 화와 demethylation 발달 결함과 암와 관련 된, 있지만 어떻게 이러한 후 성적인 변경을 직접 기여할 진 식 또는 질병 진행에 후속 변경 신뢰할 수 있는 도구를 정확 하 게 추가 또는 정의 된 시간적, 공간적 해상도에서 게놈에 있는 DNA 수정 제거의 부족 때문에 크게 불분명 남아 있습니다. 이 장애물을 극복 하기 위해 우리는 분할 TET2 효소를 5-methylcytosine (5mC) 산화의 일시적인 제어 및 후속 개장 하는 포유류 세포에 있는 후 성적인 국가의 단순히 화학 물질을 추가 하 여 사용할 수 있도록 설계 되었습니다. 여기, 우리 화학을 유도할 수 있는 epigenome 개장 도구 (사이 다), 포유류 세포와 함께 5-hydroxymethylcytosine (5hmC)의 화학 유도할 수 있는 생산 측정 조작된 분할-TET2 효소에 따라 도입 방법 설명 immunostaining, cytometry 또는 점 오 점 분석 결과. 이 화학을 유도할 수 있는 epigenome 개장 도구 유전자 코드를 변경 하지 않고 셀룰러 시스템 질문 뿐만 아니라 다양 한 생물 학적 시스템에서 epigenotype−phenotype 관계를 프로 빙에 광범위 한 사용을 찾을 것입니다.
Introduction
DNA 메 틸 화, 주로 5-methylcytosine (5mC) 형성 시 토 신의 탄소 5 위치에 메 틸 그룹의 추가를 나타냅니다, 그리고 DNA 메 틸-transferases (DNMTs)에 의해 촉매. 5mC transcriptional 억제, x 염색체 비활성화와 transposon 입을1에 대 한 신호를 종종 포유류 게놈에 있는 주요 epigenetic 마크 역할을 합니다. DNA 메 틸 화의 반전 10-엘 프 전 (TET) 단백질 가족에 의해 중재 됩니다. TET 효소 철 (II)에 속하는 5mC 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC) 및 5-carboxycytosine (5caC)의 연속 산화 촉매는 종속 dioxygenases 2 oxoglutarate. TET 중재 5mC 산화 epigenetic 제어할 포유류 게놈의 추가 계층을 부과 한다. TET의 발견 TET 단백질의 생물 학적 기능 및 그들의 주요 촉매 제품 5hmC 공개 후 필드에 강렬한 관심을 촉발 했다. 5hmC 하지만 중간 TET 중재 활성 DNA demethylation2,,34일 동안 이지만 또한 epigenetic 안정 역할 표시5,6,7,8 . DNA hydroxymethylation에서 변경 일부 인간의 장애9,,1011, 인과 관계와 연결 된 DNA hydroxymethylation은 높은 유전자 발현과 관련 된 탈 선 후 성적인 수정 DNA에는 고기 사이 종종 남아 설립 도전, 시간적 및 공간적 정의 신뢰할 수 있는 도구를 정확 하 게 추가 또는에서 게놈에 있는 DNA 수정 제거의 부족에 부분적으로 관찰 될 수 있습니다. 해상도입니다.
여기 우리는 화학을 유도할 수 있는 epigenome 도구 (사과주) 인과 관계의 연구를 직면 하는 장애물을 극복 하기 위해 DNA hydroxymethylation와 유전자 전사 사이 개장의 사용을 보고 합니다. 가정에는 디자인을 기반으로 하는 TET2의 촉매 도메인 (TET2CD) 2 개의 비활성 파편 포유류 세포에서 표현 하는 때로 분할할 수 있습니다 및 화학적으로 유도할 수 있는 이합체 화 접근법 ( 여 효소 기능을 복원할 수 있습니다 그림 1A). 분할-TET2CD 시스템을 설정 하기 위해 우리는 TET2CD, Cys 풍부한 지역 및 더블-좌초 β 나선 (DSBH) 배, TET2 DNA 복잡 한 낮은 복잡성 지역12부족의 보고 된 결정 구조 기초의 구성에서 6 사이트를 선택. 합성 유전자 인코딩 rapamycin 유도할 수 있는 이합체 화 모듈 FK506 바인딩 단백질 12 (FKBP12)와 FKBP rapamycin 바인딩 도메인 (FRB) rapamycin14,15, 자체 cleaving 펩타이드 T2A 함께 포유류 대상의 polypeptide 시퀀스16,17, TET2CD 내의 선택한 분할 사이트에 개별적으로 삽입 되었다. 우리의 엔지니어링 대상으로 TET2의 선택 다음과 같은 고려 사항을 기반으로 합니다. 수 반하는 감소 된 DNA hydroxymethylation TET2에서 첫 번째, 체세포 돌연변이 골수성 질환 등 암10, 대 피할 수 민감한 사이트에 유용한 정보를 제공 하는 인간의 장애에서 자주 관찰 된다 삽입입니다. 둘째, TET2 촉매 도메인, 특히 낮은 복잡성 지역의 큰 분수는 효소 기능12, 유도할 수 있는 후 성적인 수정에 대 한 최소화 된 분할 TET2 공예를 활성화를 위해 불가결 이다. 15 구조, 심사 후 포유류 시스템에서 그것의 효소 활동의 가장 높은 rapamycin 유도할 수 있는 복원 전시 하는 구문 선택 되었고 사과 쥬 스18로 지정. 우리는 여기 유도할 수 있는 DNA hydroxymethylation 및 rapamycin와 리 모델링 후 사과 mCherry 태그를 사용 하 여 설명 하 고 사과 중재 5hmC 생산 모델 셀룰러 시스템 HEK293T에서에서 유효성 검사에 세 가지 방법 제시.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기 우리 DNA hydroxymethylation의 일시적인 제어를 달성 하기 위해 설계 된 분할-TET2 효소를 사용 하 여를 일러스트 있다. TET 가족 5-methycytosine dioxygenase의의 발견, 많은 연구 해독 TET 단백질과 그들의 주요 촉매 제품 5hmC,12,3,의 생물 학적 기능 수행 되었습니다. 4,5,<sup clas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리 금융 감사 지원 건강의 국가 학회에서 부여 (R01GM112003 YZ), 웰 치 재단 (YZ에 될-1913 년), 미국 암 협회 (YZ에 RSG-16-215-01 TBE), 암 예방 및 연구 연구소의 텍사스 (YH에 RR140053 YZ RP170660), 미국 심장 협회 (YH에 16IRG27250155), 그리고 존 S. 던 재단 공동 연구 보너스 프로그램.
Materials
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | |
| Rapamycin | Sigma-Aldrich | 37094 | |
| Paraformaldehyde, 16% Solution | VWR | 100503-916 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694-1L | |
| Hydrochloric Acid | Amresco | 0369-500ML | |
| Albumin, Bovine | Amresco | 0332-100G | |
| Tween 20 | Amresco | 0777-1L | |
| 5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) antibody (pAb) | Active Motif | 39769 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| 4,6-Diamidino-2-phenylindolde (DAPI) | Biotium | 40043 | |
| SVAC1E SHEL LAB Economy Vacuum Oven, 0.6 Cu.Ft. (17 L) | SHEL LAB | SVAC1E | |
| UltraPure SSC, 20X | Thermo Fisher Scientific | 15557036 | |
| Bio-Dot Apparatus | BIO-RAD | 1706545 | |
| Anti-5-methylcytosine (5mC) Antibody, clone 33D3 | Millipore | MABE146 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076S | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074S | |
| West-Q Pico Dura ECL Solution | Gendepot | W3653-100 |
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