Kimyasal-indüklenebilir DNA Hydroxymethylation ve epigenetik Remodeling için bir mühendislik Split-TET2 enzim
Summary
Memeli hücreleri kimyasal indüklenebilir DNA hydroxymethylation ve epigenetik remodeling için içine bir mühendislik Böl-TET2 enzim (elma şarabı) tanıtmak için detaylı protokolleri mevcuttur.
Abstract
DNA metilasyonu memeli genom bir istikrarlı ve kalıtsal epigenetik değişiklik ve hücresel işlevleri kontrol etmek için gen ifadesinin düzenlenmesine ilgilenmektedir. DNA metilasyonu veya DNA demethylation, ters dioxygenases on-on translocation (TET) protein ailesinde aracılık ettiği. Her ne kadar bu anormal DNA metilasyonu ve demethylation gelişimsel kusurlar ve kanser ile ilişkili olan yaygın olarak bildirilmiştir, nasıl epigenetik değişikliklerin doğrudan sonraki değişiklik gen ifade veya hastalık ilerleme katkıda büyük ölçüde doğru eklemek veya DNA genom tanımlanmış zamansal ve mekansal çözünürlükte içinde kaldırmak için güvenilir araçları eksikliği nedeniyle belirsizdir. Bu engeli aşmak için bir split-TET2 enzim 5-metilsitozin (5mC) oksidasyon zamansal kontrolünü ve sonraki memeli hücrelerinde epigenetik Birleşik sadece kimyasallar ekleyerek remodeling etkinleştirmek için tasarlanmıştır. Burada, bir kimyasal indüklenebilir epigenome tadilat araç (elma şarabı), memeli hücreleri ve ile 5 arasında bakterilerde görülen (5hmC) kimyasal indüklenebilir üretim miktarının bir mühendislik Böl-TET2 enzim üzerinde dayalı tanıtmak için yöntemleri tarif immunostaining, Akış Sitometresi veya bir nokta-leke tahlil. Bu kimyasal-indüklenebilir epigenome tadilat araç geniş kullanım hücresel sistemleri genetik kodu değiştirmeden sorguya yanı sıra çeşitli biyolojik sistemlerde epigenotype−phenotype ilişkiler sondalama bulacaksınız.
Introduction
DNA metilasyonu, çoğunlukla, DNA metil-Transferazlar tarafından (DNMTs) katalize sitozin karbon 5 konumunu 5-metilsitozin (5mC) oluşturmak için bir metil grubu eklenmesi anlamına gelir. 5mC büyük bir epigenetik işareti kez transkripsiyon baskı, x kromozomu inactivation ve transposon1susturmak için sinyalleri memeli genom, görür. DNA metilasyonu iptali on-Elf translocation (TET) protein ailesi tarafından aracılık ettiği. TET enzimler ait demir (II) ve 5 arasında bakterilerde görülen (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC) ve 5-carboxycytosine (5caC) 5mC art arda gelen oksidasyon katalizler 2-oxoglutarate bağımlı dioxygenases. TET-aracılı 5mC oksidasyon ek bir memeli genom üzerinde epigenetik kontrol katmanı uygular. TET keşfi TET proteinlerin biyolojik fonksiyonları ve onların büyük katalitik ürün 5hmC açıklayacak epigenetik alanındaki yoğun ilgi yol açtı. 5hmC sadece bir ara TET-aracılı aktif DNA demethylation2sırasında,3,4, değil ama aynı zamanda kararlı bir epigenetik görevi görür5,6,7,8 işareti . DNA hydroxymethylation son derece gen ekspresyonu ile ilişkili ve anormal olmasına rağmen DNA hydroxymethylation bazı insan bozuklukları9,10,11ile nedensel ilişkileri ilişkili değişikliklerdir DNA üzerindeki epigenetik değişiklikler ve fenotipleri arasında sık sık kurulacak zorlu kalır, hangi kısmen doğru eklemek veya DNA genom içinde kaldırmak için güvenilir aracı olmadığı için atfedilen zamansal ve mekansal tanımlı Çözünürlük.
Burada aracı (çalışmaların nedensel ilişkileri karşı karşıya engel aşmak için elma şarabı) arasında DNA hydroxymethylation ve gen transkripsiyonu remodeling bir kimyasal indüklenebilir epigenome kullanımı raporu Tasarım varsayımına dayanır bu TET2 katalitik etki alanını (TET2CD) memeli hücrelerinde ifade iki etkin olmayan parçaları içine bölünmüş ve enzimatik işlevi bir kimyasal indüklenebilir dimerization yaklaşım ( alarak geri yüklenebilir Şekil 1A). Böl-TET2CD sistemi kurmak için TET2CD, Cys-zengin bölge ve düşük karmaşıklık bölge12yoksun TET2-DNA kompleks bildirilen kristal yapısı temelinde bir çift iplikli β-helix (DSBH) kat oluşan altı sitelerinin seçilmesini. Sentetik bir gen Rapamycin indüklenebilir dimerization modülü FK506 bağlayıcı protein 12 (FKBP12) kodlama ve rapamycin14,15, kendi kendine sıyırmada peptid T2A birlikte memeli hedefinin FKBP rapamycin bağlayıcı etki (FRB) polipeptid sıra16,17, tek tek TET2CD içinde seçilen split siteleri içine eklenir. TET2 seçimi mühendislik hedefimiz olarak aşağıdaki önemli noktalar üzerinde temel alır. TET2 ilk, somatik mutasyonlar DNA hydroxymethylation eşlik eden azalma ile sık sık Miyeloid bozuklukları ve kanser10için kaçınılması gereken duyarlı sitelerin yararlı bilgiler sağlar, dahil olmak üzere insan hastalıklarda gözlenir ekleme. İkinci olarak, TET2 katalitik domain, özellikle düşük karmaşıklık bölgesinde, büyük bir kısmı böylece bize bir simge durumuna küçültülmüş Böl-TET2 indüklenebilir epigenetik değişiklikler için tekne etkinleştirme enzimatik işlevi12, gereksiz. 15 yapıları eleme sonra onun enzim aktivitesinin en yüksek rapamycin indüklenebilir restorasyon memeli sistemdeki sergilenen bir yapı seçilmiş ve elma şarabı18belirlenmiş. Biz burada indüklenebilir DNA hydroxymethylation ve epigenetik rapamycin ile yeniden elde etmek için mCherry öğesini elma suyu nasıl kullanılacağını açıklar ve elma şarabı aracılı 5hmC üretim modeli hücresel sisteminde HEK293T doğrulamak için üç yöntem mevcut.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada DNA hydroxymethylation zamansal kontrolünü elde etmek için bir mühendislik Böl-TET2 enzim kullanımı resimli. 5-methycytosine dioxygenase ailesinin TET keşfi, TET proteinler ve onların büyük katalitik ürün 5hmC1,2,3biyolojik fonksiyonları deşifre etmek için birçok çalışma gerçekleştirilmiş, 4,5,6…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz mali teşekkür çekmek–dan ulusal sağlık Enstitüleri (YZ R01GM112003), hibe Welch Vakfı (YZ için BE-1913), Amerikan Kanser Derneği (RSG-16-215-01 TBE YZ için), kanser önleme ve Texas Araştırma Enstitüsü (RR140053 YH için RP170660 YZ için), Amerikan Kalp Derneği (YH 16IRG27250155) ve John S. Dunn Vakfı ortak araştırma ödülü programı.
Materials
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | |
| Rapamycin | Sigma-Aldrich | 37094 | |
| Paraformaldehyde, 16% Solution | VWR | 100503-916 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694-1L | |
| Hydrochloric Acid | Amresco | 0369-500ML | |
| Albumin, Bovine | Amresco | 0332-100G | |
| Tween 20 | Amresco | 0777-1L | |
| 5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) antibody (pAb) | Active Motif | 39769 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| 4,6-Diamidino-2-phenylindolde (DAPI) | Biotium | 40043 | |
| SVAC1E SHEL LAB Economy Vacuum Oven, 0.6 Cu.Ft. (17 L) | SHEL LAB | SVAC1E | |
| UltraPure SSC, 20X | Thermo Fisher Scientific | 15557036 | |
| Bio-Dot Apparatus | BIO-RAD | 1706545 | |
| Anti-5-methylcytosine (5mC) Antibody, clone 33D3 | Millipore | MABE146 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076S | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074S | |
| West-Q Pico Dura ECL Solution | Gendepot | W3653-100 |
References
- Li, E., Zhang, Y. DNA methylation in mammals. Cold Spring Harbor Perspectv Biol. 6 (5), a019133 (2014).
- Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
- He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).
- Ito, S., et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).
- Spruijt, C. G., et al. Dynamic readers for 5-(hydroxy)methylcytosine and its oxidized derivatives. Cell. 152 (5), 1146-1159 (2013).
- Lio, C. W., et al. Tet2 and Tet3 cooperate with B-lineage transcription factors to regulate DNA modification and chromatin accessibility. eLife. 5, e18290 (2016).
- Kellinger, M. W., et al. 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription. Nat Struct Mol Biol. 19 (8), 831-833 (2012).
- Su, M., et al. 5-Formylcytosine Could Be a Semipermanent Base in Specific Genome Sites. Angew Chem Int Ed Engl. 55 (39), 11797-11800 (2016).
- Ko, M., et al. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature. 468 (7325), 839-843 (2010).
- Huang, Y., Rao, A. Connections between TET proteins and aberrant DNA modification in cancer. Trends Genet. 30 (10), 464-474 (2014).
- Lu, X., Zhao, B. S., He, C. TET family proteins: oxidation activity, interacting molecules, and functions in diseases. Chem Rev. 115 (6), 2225-2239 (2015).
- Hu, L., et al. Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation. Cell. 155 (7), 1545-1555 (2013).
- Hashimoto, H., et al. Structure of a Naegleria Tet-like dioxygenase in complex with 5-methylcytosine DNA. Nature. 506 (7488), 391-395 (2014).
- Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. J. Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex. J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).
- Clackson, T., et al. Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10437-10442 (1998).
- Ibrahimi, A., et al. Highly efficient multicistronic lentiviral vectors with peptide 2A sequences. Hum Gene Ther. 20 (8), 845-860 (2009).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLoS One. 6 (4), e18556 (2011).
- Lee, M., et al. Engineered Split-TET2 Enzyme for Inducible Epigenetic Remodeling. J Am Chem Soc. 139 (13), 4659-4662 (2017).
- Huang, Y., Pastor, W. A., Zepeda-Martínez, J. A., Rao, A. The anti-CMS technique for genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine. Nat Protoc. 7 (10), 1897-1908 (2012).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide. Curr Protoc Mol Biol. 109 (21.29), 1-9 (2015).
