化学誘導型 DNA Hydroxymethylation およびエピジェネティックな改造のために設計された分割型 TET2 酵素
Summary
哺乳類細胞化学誘導型 DNA hydroxymethylation およびエピジェネティックな改造のために設計された分割型 TET2 酵素 (サイダー) を導入するための詳細なプロトコルが表示されます。
Abstract
DNA メチル化は、哺乳類のゲノムの安定性と遺伝性のエピジェネティックな修飾と細胞機能を制御する遺伝子発現の調節に関与しています。DNA のメチル化や DNA 脱メチル化の逆転は、dioxygenases の 10-11 転流 (テト) 蛋白質家族によって媒介されます。異常な DNA のメチル化および脱メチル化、発育障害や癌に関連付けられて広く報告されたが、どのようにこれらのエピジェネティックな変化に直接貢献遺伝子発現や疾患の進行の後の変化正確に定義された時間的・空間的解像度でゲノムの DNA の変更を削除追加する信頼性の高いツールの不足が主原因、不明のまま。このハードルを克服するためには、5-メチルシトシン (5mC) の酸化反応の時間的制御と化学物質を追加するだけで哺乳類細胞におけるエピジェネティックな状態のそれに続く改造する分割型 TET2 酵素を設計されています。ここで、哺乳類細胞との 5-ヒドロキシメチルシトシン (5hmC) の化学誘導生産の定量化に設計された分割型 TET2 酵素に基づく化学誘導性エピゲノム改造ツール (サイダー) を導入するための方法を説明します。免疫染色、フローサイトメトリーやドット ・ ブロット分析。遺伝コードを変更することがなくセルラー システムを尋問でだけでなく、epigenotype−phenotype の関係を様々 な生物系の調査に、この化学誘導性エピゲノムの改造ツールは広い使用を見つけます。
Introduction
DNA のメチル化は大抵 5-メチルシトシン (5mC) を形成するシトシンの炭素 5 位置へメチル グループの付加を指し、DNA メチルのトランスフェラーゼ (種) によって触媒されます。5mC は、しばしば信号転写抑制、x 染色体不活性化とトランスポゾンのサイレンシング1哺乳類のゲノムの主要なエピジェネティックなマークとして機能します。DNA のメチル化の逆転は、10 エルフ転座 (テト) 蛋白質家族によって媒介されます。テト酵素は鉄 (II) に属する、2-オキソグルタル酸依存 dioxygenases 5-ヒドロキシメチルシトシン (5hmC)、5 formylcytosine (5 fC) および 5-carboxycytosine (5caC) 5mC の連続的な酸化を触媒します。テトを介した 5mC 酸化は、哺乳類のゲノム上のエピジェネティックな制御の追加層を課しています。テトの発見は、TET タンパク質の生物学的機能とその主要な触媒製品 5hmC を発表するエピジェネティックな分野に強い関心を呼んでいます。5hmC はテトを介したアクティブな DNA 脱メチル化2,3,4中の中間だけではないが、安定したエピジェネティックな行為が5,6,7,8 をマークするも.DNA hydroxymethylation の変更がいくつかの人間の疾患9,10,11, 因果関係に関連付けられている DNA hydroxymethylation 遺伝子の発現と相関性の異常がエピジェネティック修飾 dna と表現型の間おく確立への挑戦、時空に定義されて正確にゲノムの DNA の変更を削除追加する信頼性の高いツールの不足にすることができます部分的に帰される解像度。
ここで化学誘導性エピゲノム DNA hydroxymethylation および遺伝子のトランスクリプションの間ツールの因果関係の研究が直面しているハードルを克服するために (サイダー) を改造の使用を報告します。デザインが仮定に基づいている TET2 の触媒ドメイン (TET2CD) は、哺乳類細胞で発現したとき 2 つのアクティブでないフラグメントに分割でき、酵素としての働きを化学的に誘導性二量体化アプローチ (によって復元できます図 1 a)。分割 TET2CD システムを確立するには、システイン豊富な地域と二重鎖 β ヘリックス (DSBH) 倍、低複雑さ領域12を欠いている TET2 DNA 複合体の報告された結晶構造から成る TET2CD の六つのサイトを選択します。合成遺伝子ラパマイシン誘導二量体化モジュール FK506 結合タンパク質 12 (FKBP12) およびラパマイシン14,の15割自己ペプチド T2A とともに哺乳類ターゲットの FKBP ラパマイシン結合ドメイン (FRB)ポリペプチド順序16,17は、TET2CD 内の選択した分割のサイトに個別に挿入されました。当社のエンジニア リングの対象として TET2 の選択は、次の考慮事項に基づきます。骨髄性疾患癌10、使用を避けるために敏感なサイトに有用な情報を提供するなどの人間の疾患でしばしば DNA hydroxymethylation の併用削減と TET2 最初、体細胞変異が観測されます。挿入。第二に、複雑性が低い地域では特に TET2 触媒ドメインの大部分は酵素の機能12、こうして誘導エピジェネティック修飾の最小分割 TET2 をクラフトする私たちを有効にするために不可欠です。以上 15 構造をスクリーニングした後哺乳類システムでその酵素活性の高いラパマイシン誘導復元を展示構成は選択、サイダー18に指定します。ここ誘導型 DNA hydroxymethylation およびラパマイシンのエピジェネティックな改造を達成するためにタグ付きの mCherry サイダーの使用を記述し、HEK293T 細胞系における 5hmC のサイダーを介した生産を検証するための 3 つの方法を提示します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで我々 は DNA hydroxymethylation の時間的制御を達成するために設計された分割型 TET2 酵素の使用を説明しています。5 methycytosine ジオキシゲナーゼのテト家族の発見、多くの研究を行った TET タンパク質とその主要な触媒製品 5hmC1,2,の3、生体の機能を解読するには 4,5…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々 は金融に感謝健康の国民の協会からのサポートを許可 (YZ に R01GM112003)、ウェルチ財団 (YZ には BE-1913 年)、テキサス州の研究所、アメリカの癌協会 (YZ に RSG-16-215-01 TBE) がん予防 (YH、まで RR140053RP170660 YZ) には、アメリカ心臓協会 (YH まで 16IRG27250155)、ジョン s. ダン財団共同研究賞プログラム。
Materials
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | |
| Rapamycin | Sigma-Aldrich | 37094 | |
| Paraformaldehyde, 16% Solution | VWR | 100503-916 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694-1L | |
| Hydrochloric Acid | Amresco | 0369-500ML | |
| Albumin, Bovine | Amresco | 0332-100G | |
| Tween 20 | Amresco | 0777-1L | |
| 5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) antibody (pAb) | Active Motif | 39769 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| 4,6-Diamidino-2-phenylindolde (DAPI) | Biotium | 40043 | |
| SVAC1E SHEL LAB Economy Vacuum Oven, 0.6 Cu.Ft. (17 L) | SHEL LAB | SVAC1E | |
| UltraPure SSC, 20X | Thermo Fisher Scientific | 15557036 | |
| Bio-Dot Apparatus | BIO-RAD | 1706545 | |
| Anti-5-methylcytosine (5mC) Antibody, clone 33D3 | Millipore | MABE146 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076S | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074S | |
| West-Q Pico Dura ECL Solution | Gendepot | W3653-100 |
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