En konstruert Split-TET2 enzymet for kjemisk-induserbart DNA Hydroxymethylation og Epigenetic Remodeling
Summary
Detaljert protokoller for å innføre et konstruert split-TET2 enzym (CiDER) i pattedyrceller for kjemiske induserbart DNA hydroxymethylation og epigenetic remodeling presenteres.
Abstract
DNA metylering er en stabil og arvelige epigenetic endring i pattedyr genomet og er involvert i å regulere genuttrykk å kontrollere cellulære funksjoner. Reversering av DNA metylering eller DNA demethylation, er formidlet av ti-elleve translokasjon (TET) protein familien dioxygenases. Selv om det har blitt mye rapportert at avvikende DNA metylering og demethylation er forbundet med utviklingsmessige defekter og kreft, hvordan disse epigenetic endringer direkte bidra til påfølgende endring i genet uttrykk eller sykdom progresjon fortsatt uklart, hovedsakelig på grunn av mangel på pålitelig verktøy nøyaktig legge til eller fjerne DNA endringer i genomet definerte timelige og romlig oppløsning. For å overvinne dette hinderet, utviklet vi en split-TET2 enzym aktivere timelige kontroll av 5-methylcytosine (5mC) oksidering og påfølgende ombygging av epigenetic stater i pattedyrceller ved å legge kjemikalier. Her beskriver vi metoder for å introdusere en kjemisk-induserbart epigenome remodeling verktøyet (CiDER), basert på et konstruert split-TET2 enzym, i pattedyrceller og kvantifisere kjemiske induserbart produksjonen av 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) med immunostai-flowcytometri eller en prikk-blot analysen. Kjemisk-induserbart epigenome remodeling verktøyet finner bred bruk i avhør cellulær systemer uten å endre den genetiske koden og utprøvende epigenotype−phenotype forholdet i ulike biologiske systemer.
Introduction
DNA metylering, hovedsakelig refererer til tillegg av en metylgruppe på karbon 5 plasseringen av cytosine til 5-methylcytosine (5mC), er katalysert av DNA metyl-transferases (DNMTs). 5mC fungerer som en stor epigenetic hake i pattedyr genomet som ofte signaler for transcriptional undertrykkelse, X-chromosome inaktivering og transposon stanse1. Reversering av DNA metylering er formidlet av ti-alvenes translokasjon (TET) protein familien. TET enzymer tilhører jern (II) og 2-oxoglutarate avhengig av dioxygenases som katalysere påfølgende oksidasjon av 5mC 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) og 5-carboxycytosine (5caC). 5mC TET-mediert oksidasjon legger et ekstra lag av epigenetic kontroll over pattedyr genomet. Oppdagelsen av TET har skapt intens interesse i feltet epigenetic å avsløre den biologiske funksjoner av TET proteiner og deres viktigste katalytisk produktet 5hmC. 5hmC er ikke bare et mellomledd i TET-mediert aktive DNA demethylation2,3,4, men også fungerer som en stabil epigenetic merke5,6,7,8 . Selv om DNA hydroxymethylation er sterkt korrelert med genuttrykk og avvikende er endringer i DNA hydroxymethylation forbundet med noen menneskelige lidelser9,10,11, årsakssammenhengen mellom epigenetic endringer på DNA og av fenotyper forblir ofte utfordrende etableres, som kan delvis tilskrives mangel på pålitelig verktøy nøyaktig legge til eller fjerne DNA endringer i genomet på definert timelige og romlig oppløsning.
Her rapporterer vi bruk av en kjemisk-induserbart epigenome remodeling verktøyet (CiDER) å overvinne hinder overfor studier av årsaksforhold mellom DNA hydroxymethylation og gene transkripsjon. Designen er basert på antagelsen om at katalytisk domenet til TET2 (TET2CD) kan deles inn i to inaktive fragmenter når uttrykt i pattedyrceller og enzymatiske funksjonen kan gjenopprettes ved å ta en kjemisk induserbart dimerization tilnærming ( Figur 1A). For å etablere en split-TET2CD systemet, valgte vi seks steder i TET2CD, består av en Cys-rik region og en dobbel-strandet β-helix (DSBH)-fold, basert på en rapportert krystallstruktur av TET2-DNA kompleks som mangler en lav kompleksitet regionen12. Et syntetisk gen koding rapamycin-induserbart dimerization modul FK506 binding protein 12 (FKBP12) og FKBP rapamycin bindende domene (FRB) av pattedyr målet på rapamycin14,15, med et selvstendig cleaving peptid T2A polypeptid sekvens16,17, ble individuelt satt inn i de valgte delte områdene innenfor TET2CD. Valg av TET2 som våre ingeniører mål er basert på følgende betraktninger. Første, somatiske mutasjoner i TET2 med samtidig reduksjon i DNA hydroxymethylation er ofte observert i menneskelige lidelser inkludert myelogen lidelser og kreft10, som gir nyttig informasjon om sensitive områder som må unngås for innsetting. Andre er en stor andel av TET2 katalytisk domenet, spesielt regionen lav kompleksitet, unnværlig for enzymatisk funksjonen12, dermed slik at vi kan lage en minimert split-TET2 for induserbart epigenetic endringer. Etter screening over 15 konstruksjoner, ble en konstruksjon som utstilt høyeste rapamycin-induserbart restaurering av den enzymatiske aktiviteten i pattedyr systemet valgt og angitt som CiDER18. Vi beskriver her bruken av mCherry-merket CiDER induserbart DNA hydroxymethylation og epigenetic remodeling med rapamycin og presentere tre metoder for validering CiDER-mediert 5hmC produksjon i en mobilnettet modellsystem HEK293T.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her har vi illustrert bruken av et konstruert split-TET2 enzym å oppnå verdslige kontroll av DNA hydroxymethylation. Etter oppdagelsen av TET familie av 5-methycytosine dioxygenase, har mange studier utført for å dechiffrere de biologiske funksjonene TET proteiner og deres store katalytisk produkt 5hmC1,2,3, 4,5,6,<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker finans støtter fra National Institutes of Health gir (R01GM112003 til YZ), Welch grunnlaget (BE-1913 til YZ), American Cancer Society (RSG-16-215-01 TBE til YZ), Cancer Prevention og Research Institute of Texas (RR140053 til YH, RP170660 til YZ), the American Heart Association (16IRG27250155 til YH), og John S. Dunn Foundation forskningssamarbeid Award programmet.
Materials
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | |
| Rapamycin | Sigma-Aldrich | 37094 | |
| Paraformaldehyde, 16% Solution | VWR | 100503-916 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694-1L | |
| Hydrochloric Acid | Amresco | 0369-500ML | |
| Albumin, Bovine | Amresco | 0332-100G | |
| Tween 20 | Amresco | 0777-1L | |
| 5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) antibody (pAb) | Active Motif | 39769 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| 4,6-Diamidino-2-phenylindolde (DAPI) | Biotium | 40043 | |
| SVAC1E SHEL LAB Economy Vacuum Oven, 0.6 Cu.Ft. (17 L) | SHEL LAB | SVAC1E | |
| UltraPure SSC, 20X | Thermo Fisher Scientific | 15557036 | |
| Bio-Dot Apparatus | BIO-RAD | 1706545 | |
| Anti-5-methylcytosine (5mC) Antibody, clone 33D3 | Millipore | MABE146 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076S | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074S | |
| West-Q Pico Dura ECL Solution | Gendepot | W3653-100 |
References
- Li, E., Zhang, Y. DNA methylation in mammals. Cold Spring Harbor Perspectv Biol. 6 (5), a019133 (2014).
- Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
- He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).
- Ito, S., et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).
- Spruijt, C. G., et al. Dynamic readers for 5-(hydroxy)methylcytosine and its oxidized derivatives. Cell. 152 (5), 1146-1159 (2013).
- Lio, C. W., et al. Tet2 and Tet3 cooperate with B-lineage transcription factors to regulate DNA modification and chromatin accessibility. eLife. 5, e18290 (2016).
- Kellinger, M. W., et al. 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription. Nat Struct Mol Biol. 19 (8), 831-833 (2012).
- Su, M., et al. 5-Formylcytosine Could Be a Semipermanent Base in Specific Genome Sites. Angew Chem Int Ed Engl. 55 (39), 11797-11800 (2016).
- Ko, M., et al. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature. 468 (7325), 839-843 (2010).
- Huang, Y., Rao, A. Connections between TET proteins and aberrant DNA modification in cancer. Trends Genet. 30 (10), 464-474 (2014).
- Lu, X., Zhao, B. S., He, C. TET family proteins: oxidation activity, interacting molecules, and functions in diseases. Chem Rev. 115 (6), 2225-2239 (2015).
- Hu, L., et al. Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation. Cell. 155 (7), 1545-1555 (2013).
- Hashimoto, H., et al. Structure of a Naegleria Tet-like dioxygenase in complex with 5-methylcytosine DNA. Nature. 506 (7488), 391-395 (2014).
- Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. J. Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex. J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).
- Clackson, T., et al. Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10437-10442 (1998).
- Ibrahimi, A., et al. Highly efficient multicistronic lentiviral vectors with peptide 2A sequences. Hum Gene Ther. 20 (8), 845-860 (2009).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLoS One. 6 (4), e18556 (2011).
- Lee, M., et al. Engineered Split-TET2 Enzyme for Inducible Epigenetic Remodeling. J Am Chem Soc. 139 (13), 4659-4662 (2017).
- Huang, Y., Pastor, W. A., Zepeda-Martínez, J. A., Rao, A. The anti-CMS technique for genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine. Nat Protoc. 7 (10), 1897-1908 (2012).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide. Curr Protoc Mol Biol. 109 (21.29), 1-9 (2015).
