एक इंजीनियर भाजित-रासायनिक TET2 एंजाइम inducible डीएनए Hydroxymethylation और Epigenetic remodeling के लिए
Summary
एक इंजीनियर विभाजन-TET2 एंजाइम (साइडर) स्तनधारी कोशिकाओं में रासायनिक inducible डीएनए hydroxymethylation और epigenetic remodeling के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं शुरू करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल ।
Abstract
डीएनए मिथाइल स्तनधारी जीनोम में एक स्थिर और heritable epigenetic संशोधन है और सेलुलर कार्यों को नियंत्रित करने के लिए जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने में शामिल है । डीएनए मिथाइल के उलटा, या डीएनए में मिथाइल, dioxygenases के दस ग्यारह translocation (TET) प्रोटीन परिवार द्वारा मध्यस्थता है । हालांकि यह व्यापक रूप से सूचित किया गया है कि ंयायपालिका डीएनए मिथाइल और मिथाइल विकासात्मक दोषों और कैंसर के साथ जुड़े हैं, कैसे इन epigenetic परिवर्तन सीधे जीन अभिव्यक्ति या रोग प्रगति में बाद में बदलाव के लिए योगदान अस्पष्ट रहता है, मोटे तौर पर विश्वसनीय उपकरण की कमी के कारण को सही ढंग से जोड़ने या परिभाषित लौकिक और स्थानिक संकल्प में जीनोम में डीएनए संशोधनों को हटा दें । इस बाधा को दूर करने के लिए, हम एक विभाजन TET2 एंजाइम बस रसायनों को जोड़ने के द्वारा 5-methylcytosine (5mC) ऑक्सीकरण और स्तनधारी कोशिकाओं में epigenetic राज्यों के बाद remodeling के लौकिक नियंत्रण को सक्षम करने के लिए डिज़ाइन किया गया । यहां, हम एक इंजीनियर विभाजन-TET2 एंजाइम के आधार पर एक रासायनिक-inducible epigenome remodeling उपकरण (साइडर), शुरू करने के लिए तरीकों का वर्णन स्तनधारी कोशिकाओं में और 5 के रासायनिक inducible उत्पादन को बढ़ाता-hydroxymethylcytosine (5hmC) के साथ immunostaining, फ्लो cytometry या एक डॉट-ब्लाट परख । यह केमिकल-inducible epigenome रिमॉडलिंग टूल जेनेटिक कोड में फेरबदल किए बिना सेलुलर सिस्टम को पूछताछ में व्यापक उपयोग के साथ-साथ विभिन्न जैविक प्रणालियों में epigenotype − phenotype संबंधों की जांच करने में भी मिलेगा ।
Introduction
डीएनए मिथाइल, अधिकांशतः 5-methylcytosine (5mC) बनाने के लिए cytosine की कार्बन 5 स्थिति को एक मिथाइल समूह के जोड़ को संदर्भित करता है, डीएनए मिथाइल-transferases (DNMTs) द्वारा catalyzed है । 5mC स्तनधारी जीनोम में एक प्रमुख epigenetic निशान के रूप में कार्य करता है कि अक्सर transcriptional दमन, एक्स गुणसूत्र निष्क्रियता और transposon मुंह1के लिए संकेत । डीएनए मिथाइल के उलटा होने से दस-elven translocation (TET) प्रोटीन परिवार की मध्यस्थता होती है. TET एंजाइमों का लोहा (II) और 2-oxoglutarate आश्रित dioxygenases जो 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) और 5-carboxycytosine (5caC) के 5mC के परवर्ती ऑक्सीकरण उत्प्रेरित होते हैं । TET-मध्यस्थता 5mC ऑक्सीकरण स्तनधारी जीनोम पर epigenetic नियंत्रण की एक अतिरिक्त परत लगाता है । tet की खोज को लेकर epigenetic क्षेत्र में tet प्रोटीन और उनके प्रमुख उत्प्रेरक उत्पाद 5hmC के जैविक कार्यों का अनावरण करने में तीव्र रुचि छिड़ी हुई है. 5hmC न केवल एक मध्यवर्ती के दौरान TET-मध्यस्थता सक्रिय डीएनए2,3,4, लेकिन यह भी एक स्थिर epigenetic निशान के रूप में कार्य करता है5,6,7,8 . हालांकि डीएनए hydroxymethylation उच्च जीन अभिव्यक्ति और डीएनए hydroxymethylation में ंयायपालिका परिवर्तन के साथ संबंधित है कुछ मानव विकारों के साथ जुड़े रहे है9,10,11, कारण संबंध डीएनए और phenotypes पर epigenetic संशोधनों के बीच अक्सर स्थापित होने के लिए चुनौतीपूर्ण है, जो आंशिक रूप से विश्वसनीय उपकरण की कमी के लिए जिंमेदार सही ढंग से जोड़ने या हटाने के लिए परिभाषित लौकिक और स्थानिक में जीनोम में डीएनए संशोधनों को दूर किया जा सकता है रह संकल्प.
यहां हम एक रासायनिक inducible epigenome remodeling उपकरण (साइडर) के उपयोग के लिए डीएनए hydroxymethylation और जीन प्रतिलेखन के बीच कारण संबंधों के अध्ययन का सामना करना पड़ बाधा पर काबू पाने की रिपोर्ट । डिजाइन इस धारणा पर आधारित है कि TET2 (TET2CD) के उत्प्रेरक डोमेन दो निष्क्रिय टुकड़ों में विभाजित किया जा सकता है जब स्तनधारी कोशिकाओं और उसके एंजाइमी समारोह में व्यक्त एक रासायनिक inducible dimerization दृष्टिकोण लेने से बहाल किया जा सकता है ( चित्र 1a) । एक विभाजन-TET2CD प्रणाली स्थापित करने के लिए, हम TET2CD में छह साइटों का चयन किया, एक Cys-अमीर क्षेत्र और एक डबल-कतरा β-कुण्डल (DSBH) गुना, TET2-डीएनए परिसर की रिपोर्ट क्रिस्टल संरचना के आधार पर है कि एक कम जटिलता क्षेत्र की कमी का बना12। एक सिंथेटिक जीन एंकोडिंग rapamycin-inducible dimerization मॉड्यूल FK506 बंधन प्रोटीन 12 (FKBP12) और FKBP rapamycin बंधन डोमेन (FRB) के स्तनधारी लक्ष्य के rapamycin14,15, साथ में एक स्व-सट पेप्टाइड T2A पॉलीपेप्टाइड अनुक्रम16,17, व्यक्तिगत रूप से TET2CD के भीतर चयनित विभाजित साइटों में सम्मिलित किया गया था । हमारे इंजीनियरिंग लक्ष् य के रूप में TET2 का चयन निं नलिखित बातों पर आधारित है । पहले, डीएनए hydroxymethylation में सहवर्ती कमी के साथ TET2 में दैहिक उत्परिवर्तनों अक्सर माइलॉयड विकारों और कैंसर10, जो संवेदनशील साइटों पर उपयोगी जानकारी प्रदान करता है के लिए टाल दिया सहित मानव विकारों में मनाया जाता है लन. दूसरा, TET2 उत्प्रेरक डोमेन का एक बड़ा अंश, विशेष रूप से कम जटिलता क्षेत्र, एंजाइमी समारोह के लिए औषधालय12, इस प्रकार हमें inducible epigenetic संशोधनों के लिए एक छोटे से विभाजित-TET2 शिल्प के लिए सक्षम करने के लिए । पर स्क्रीनिंग के बाद 15 निर्माण, एक निर्माण कि स्तनधारी प्रणाली में अपनी एंजाइमी गतिविधि के उच्चतम rapamycin-inducible बहाली का प्रदर्शन चुना और साइडर18के रूप में नामित किया गया था । हम वर्णन के साथ साथ mCherry के उपयोग के साथ साथ inducible डीएनए को प्राप्त करने के लिए hydroxymethylation और epigenetic rapamycin के साथ remodeling, और एक मॉडल सेलुलर प्रणाली 5hmC में एक साइडर मध्यस्थता HEK293T उत्पादन मान्य करने के लिए तीन तरीकों वर्तमान.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ हम एक इंजीनियर विभाजन का उपयोग सचित्र है-TET2 एंजाइम डीएनए hydroxymethylation के लौकिक नियंत्रण को प्राप्त करने के लिए. 5-methycytosine dioxygenase के tet परिवार की खोज के बाद, कई अध्ययनों से tet प्रोटीन के जैविक कार्यों को समझने के लि…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम स्वास्थ्य अनुदान के राष्ट्रीय संस्थानों (R01GM112003 YZ), वेल्च फाउंडेशन (BE-१९१३ को YZ), अमेरिकन कैंसर सोसायटी (RSG-16-215-01 TBE को YZ), कैंसर की रोकथाम और टेक्सास के अनुसंधान संस्थान (RR140053 करने के लिए YH से वित्तीय सहायता का शुक्र है, RP170660 to YZ), अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (16IRG27250155 to YH), और जॉन एस डन फाउंडेशन सहयोगी अनुसंधान पुरस्कार कार्यक्रम ।
Materials
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | |
| Rapamycin | Sigma-Aldrich | 37094 | |
| Paraformaldehyde, 16% Solution | VWR | 100503-916 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694-1L | |
| Hydrochloric Acid | Amresco | 0369-500ML | |
| Albumin, Bovine | Amresco | 0332-100G | |
| Tween 20 | Amresco | 0777-1L | |
| 5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) antibody (pAb) | Active Motif | 39769 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| 4,6-Diamidino-2-phenylindolde (DAPI) | Biotium | 40043 | |
| SVAC1E SHEL LAB Economy Vacuum Oven, 0.6 Cu.Ft. (17 L) | SHEL LAB | SVAC1E | |
| UltraPure SSC, 20X | Thermo Fisher Scientific | 15557036 | |
| Bio-Dot Apparatus | BIO-RAD | 1706545 | |
| Anti-5-methylcytosine (5mC) Antibody, clone 33D3 | Millipore | MABE146 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076S | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074S | |
| West-Q Pico Dura ECL Solution | Gendepot | W3653-100 |
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