En manipuleret Split-TET2 enzym til kemikalie-inducerbar DNA Hydroxymethylation og epigenetiske Remodeling
Summary
Detaljerede protokoller for at indføre et manipuleret split-TET2 enzym (CiDER) i pattedyrceller for kemiske inducerbar DNA hydroxymethylation og epigenetiske remodeling præsenteres.
Abstract
DNA methylering er en stabil og arvelige epigenetiske ændringer i det mammale genom og er involveret i reguleringen af genekspression for at styre cellulære funktioner. Tilbageførsel af DNA methylering, eller DNA demetylering, er medieret af ti-elleve translokation (TET) protein familie af dioxygenases. Selv om det har været almindeligt rapporterede, at afvigende DNA methylering og demetylering er forbundet med udviklingsmæssige defekter og kræft, hvordan disse epigenetiske ændringer direkte bidrage til den efterfølgende ændring i genet udtryk eller sygdom progression er fortsat uklart, i vid udstrækning på grund af manglen på pålidelige værktøjer til præcist tilføje eller fjerne DNA ændringer i genomet ved definerede tidsmæssige og rumlige opløsning. For at overvinde denne forhindring, vi har designet en split-TET2 enzym til at aktiverer tidsmæssige kontrol af 5-methylcytosine (5mC) oxidation og efterfølgende remodellering af epigenetiske stater i pattedyrceller ved blot at tilføje kemikalier. Her, beskriver vi metoder til at indføre et kemikalie-inducerbar epigenome remodeling værktøj (CiDER), baseret på en manipuleret split-TET2 enzym, i pattedyrsceller og kvantificere kemiske inducerbar produktionen af 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) med immunfarvning, flowcytometri eller en dot-skamplet assay. Dette kemikalie-inducerbar epigenome remodeling værktøj vil finde bred anvendelse i spørgekriterierne cellulære systemer uden at ændre den genetiske kode, samt i sondering epigenotype−phenotype forbindelser i forskellige biologiske systemer.
Introduction
DNA methylering, for det meste henvist til tilføjelse af en methylgruppe til carbon 5 position af cytosin at danne 5-methylcytosine (5mC), er katalyseret af DNA methyl-transferaser (DNMTs). 5mC fungerer som en stor epigenetiske mark i det mammale genom, der ofte signaler for transcriptional undertrykkelse, x-kromosom Inaktiveringen og transposon silencing1. Tilbageførsel af DNA methylering er medieret af Ten-elven translokation (TET) protein familie. TET enzymer tilhører jern (II) og 2-oxoglutarate afhængigt af dioxygenases, som katalysere den successive oxidation af 5mC til 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) og 5-carboxycytosine (5caC). TET-medieret 5mC oxidation pålægger et ekstra lag af epigenetiske kontrol over det mammale genom. Opdagelsen af TET har udløste intense interesse i den epigenetiske felt hen til afsløre de biologiske funktioner af TET proteiner og deres store katalytisk produkt 5hmC. 5hmC er ikke kun et mellemprodukt under TET-medieret aktive DNA demetylering2,3,4, men også fungerer som en stabil epigenetiske mark5,6,7,8 . Selv om DNA hydroxymethylation er stærkt korreleret med gene expression og afvigende er ændringer i DNA hydroxymethylation forbundet med nogle menneskelige lidelser9,10,11, de kausale relationer mellem epigenetiske ændringer på DNA og fænotyper forbliver ofte udfordrende at være etableret, som delvist kan tilskrives manglen på pålidelige værktøj til præcist tilføje eller fjerne DNA ændringer i genomet på defineret tidsmæssige og rumlige opløsning.
Her rapporterer vi brugen af et kemikalie-inducerbar epigenome remodeling værktøj (CiDER) til at overvinde den forhindring, som står over for undersøgelser af årsagssammenhænge mellem DNA hydroxymethylation og gen transskription. Designet er baseret på antagelsen, at det katalytiske domæne af TET2 (TET2CD) kan opdeles i to inaktive fragmenter når udtrykt i pattedyrsceller og dens enzymatisk funktion kan genoprettes ved at tage en kemisk inducerbar dimerization tilgang ( Figur 1A). For at etablere en split-TET2CD system, udvalgte vi seks steder i TET2CD, sammensat af en Cys-rige region og en dobbelt-strenget β-helix (DSBH) fold, på grundlag af en rapporteret krystalstruktur af TET2-DNA-kompleks, der mangler en lav kompleksitet region12. En syntetisk gen, der koder rapamycin-inducerbar dimerization modul FK506 bindende protein 12 (FKBP12) og FKBP rapamycin bindende domæne (FRB) til pattedyr målet på rapamycin14,15, sammen med en selvstændig cleaving peptid T2A polypeptid sekvens16,17, var individuelt indsat i de valgte split websteder inden for TET2CD. Udvalg af TET2 som vores engineering mål bygger på følgende betragtninger. Første, somatiske mutationer i TET2 med samtidige reduktion i DNA hydroxymethylation er ofte observeret i menneskelige lidelser, herunder myeloide sygdomme og kræft10, som giver nyttige oplysninger om følsomme steder skal undgås for indsættelse. For det andet er en stor del af TET2 katalytiske domæne, især regionen lav kompleksitet, undværes til enzymatisk funktion12, således at vi kan udforme en minimeret split-TET2 for inducerbar epigenetiske modifikationer. Efter screening over 15 konstruktioner, blev en konstruktion, der udstillede højeste rapamycin-inducerbar restaurering af RuBisCOs enzymaktivitet i pattedyr systemet valgt og udpeget som CiDER18. Vi beskriver heri brugen af mCherry-mærkede CiDER at opnå inducerbar DNA hydroxymethylation og epigenetiske remodeling med rapamycin og præsentere tre metoder til at validere CiDER-medieret 5hmC produktion i en model cellulære system HEK293T.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her har vi illustreret brugen af en manipuleret split-TET2 enzym til at opnå tidsmæssige kontrol af DNA hydroxymethylation. Efter opdagelsen af TET familie af 5-methycytosine dioxygenase, mange undersøgelser er blevet udført til at dechifrere de biologiske funktioner af TET proteiner og deres store katalytisk produkt 5hmC1,2,3, 4,5,<sup class="…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker de finansielle støtter fra National Institutes of Health giver (R01GM112003 til YZ), Welch Foundation (BE-1913 til YZ), the American Cancer Society (RSG-16-215-01 TBE at YZ), forebyggelse af kræft og Research Institute of Texas (RR140053 til YH, RP170660 til YZ), the American Heart Association (16IRG27250155 til YH), og John S. Dunn Foundation forskningssamarbejde Award Program.
Materials
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | |
| Rapamycin | Sigma-Aldrich | 37094 | |
| Paraformaldehyde, 16% Solution | VWR | 100503-916 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694-1L | |
| Hydrochloric Acid | Amresco | 0369-500ML | |
| Albumin, Bovine | Amresco | 0332-100G | |
| Tween 20 | Amresco | 0777-1L | |
| 5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) antibody (pAb) | Active Motif | 39769 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| 4,6-Diamidino-2-phenylindolde (DAPI) | Biotium | 40043 | |
| SVAC1E SHEL LAB Economy Vacuum Oven, 0.6 Cu.Ft. (17 L) | SHEL LAB | SVAC1E | |
| UltraPure SSC, 20X | Thermo Fisher Scientific | 15557036 | |
| Bio-Dot Apparatus | BIO-RAD | 1706545 | |
| Anti-5-methylcytosine (5mC) Antibody, clone 33D3 | Millipore | MABE146 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076S | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074S | |
| West-Q Pico Dura ECL Solution | Gendepot | W3653-100 |
References
- Li, E., Zhang, Y. DNA methylation in mammals. Cold Spring Harbor Perspectv Biol. 6 (5), a019133 (2014).
- Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
- He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).
- Ito, S., et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).
- Spruijt, C. G., et al. Dynamic readers for 5-(hydroxy)methylcytosine and its oxidized derivatives. Cell. 152 (5), 1146-1159 (2013).
- Lio, C. W., et al. Tet2 and Tet3 cooperate with B-lineage transcription factors to regulate DNA modification and chromatin accessibility. eLife. 5, e18290 (2016).
- Kellinger, M. W., et al. 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription. Nat Struct Mol Biol. 19 (8), 831-833 (2012).
- Su, M., et al. 5-Formylcytosine Could Be a Semipermanent Base in Specific Genome Sites. Angew Chem Int Ed Engl. 55 (39), 11797-11800 (2016).
- Ko, M., et al. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature. 468 (7325), 839-843 (2010).
- Huang, Y., Rao, A. Connections between TET proteins and aberrant DNA modification in cancer. Trends Genet. 30 (10), 464-474 (2014).
- Lu, X., Zhao, B. S., He, C. TET family proteins: oxidation activity, interacting molecules, and functions in diseases. Chem Rev. 115 (6), 2225-2239 (2015).
- Hu, L., et al. Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation. Cell. 155 (7), 1545-1555 (2013).
- Hashimoto, H., et al. Structure of a Naegleria Tet-like dioxygenase in complex with 5-methylcytosine DNA. Nature. 506 (7488), 391-395 (2014).
- Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. J. Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex. J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).
- Clackson, T., et al. Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10437-10442 (1998).
- Ibrahimi, A., et al. Highly efficient multicistronic lentiviral vectors with peptide 2A sequences. Hum Gene Ther. 20 (8), 845-860 (2009).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLoS One. 6 (4), e18556 (2011).
- Lee, M., et al. Engineered Split-TET2 Enzyme for Inducible Epigenetic Remodeling. J Am Chem Soc. 139 (13), 4659-4662 (2017).
- Huang, Y., Pastor, W. A., Zepeda-Martínez, J. A., Rao, A. The anti-CMS technique for genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine. Nat Protoc. 7 (10), 1897-1908 (2012).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide. Curr Protoc Mol Biol. 109 (21.29), 1-9 (2015).
