Summary
인간의 조직 비보 전 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)의 감염 바이러스 병의 귀중 한 3D 모델을 제공합니다. 여기, 우리는 프로토콜 처리 및 조직 표본에서 인간의 편도 에이즈-1 여성 생식 기 거칠어 감염과 액체 공기 인터페이스에 문화에서 그들을 유지 하는 것을 설명 합니다.
Abstract
Histocultures 허용 인간의 조직 내에서 세포 상호 작용을 공부 하 고 그들은 통제 된 실험실 조건에서 모델 호스트 병원 체 상호 작용을 채택 될 수 있다. 인간의 조직 중 다른 바이러스, 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)의 감염 ex vivo 효능 및 항 바이러스 약물의 독성을 테스트 플랫폼으로 초기 질병 병 인, 조사를 성공적으로 사용 되었습니다. 현재 프로토콜에서 우리가 처리와 에이즈-1 조직 explants 인간의 편도 및 자 궁 경부 거칠어, 감염 약 2 주 동안 액체 공기 인터페이스에 젤라틴 스폰지 위에 문화에서 그들을 유지 하는 방법을 설명 합니다. 이 아닌-편광 culture 설정 조직의 무결성과 기능적 아키텍처의 진보적인 손실의 주요 제한 남아 있지만 문화 매체에 산소, 영양소에 대 한 액세스를 극대화 합니다. 이 메서드는 hiv-1 복제 및 병 인 immunoassays, cytometry, 정량, 등 여러 가지 기술을 사용 하 여 모니터링을 수 있습니다. 중요성, 생리 변화 같은 표본의 다른 지역에서 explants 사이 에서도 조직 기증자, 사이의 실험 결과 영향을 크게 수 있습니다. 결과 재현성을 보장 하기 위해, 그것은 중요 explants, 기술 복제, 조건과 일치 하는 기증자 컨트롤의 적절 한 번호를 사용 하 여 여러 실험에서 데이터를 컴파일할 때 실험적 치료의 결과 정규화 (즉, ., 다른 기증자에서 직물을 사용 하 여 실시) 통계 분석을 위해.
Introduction
여기 언급으로 종래의 monotypic bi 차원 세포 배양 조직을 구성 하는 세포 유형의 큰 다양성 및 기관 간의 공간 및 기능 통신에 대 한 계정을 하지 않습니다. 이 점은 질병의 실험 모델에 대 한 파라마운트 중요성의 방해가 homeostatic 세포 상호 작용은 모든 병 리의 운전 요인. 조직 explants 그들은 vivo에서, 비록 제한 된 양의 시간1대는 cytoarchitecture와 기관의 많은 중요 한 기능적 측면을 유지 하기 때문에 건강 및 인 간에 있는 질병을 모델링 하기 위한 주요 이점을 제공 합니다. 예를 들어 디프테리아 사망 toxoid 등 파상풍 사망 toxoid, 회 항으로 비보 전 도전 시 편도 선 조직 항 원 특정 항 체2의 활발 한 생산 응답합니다. 어떤 다른 비보 전 모델 처럼, histoculture는 그것의 자신의 제한이: 간 기증자, 조직 분극, 제한 된 조직 생존, 변화와 confocal 현미경 검사 법1의 깊이 넘어 셀 모니터링에 어려움. 그럼에도 불구 하 고, 인간의 조직 explants 호스트 병원 체 상호 작용 및 잠재적인 치료 내정간섭3를 포함 하 여 인간에서 항상성 및 병원 성 면역 과정을 공부 하는 선택의 모델을 남아 있다.
에이즈-1 병의 중요 한 이벤트는 조직에서 자리를 차지할. 생식 기 점 막의 감염 모든 hiv-1 전송 이벤트 전세계4의 대부분을 차지 한다. 림프 조직 급성 감염 시 바이러스 복제의 주요 사이트 latently 감염 세포5의 뜻깊은 수영장을 비호 하 고 그들의 지 속성 치료6을 달성 하기 위해 주요 장애물을 나타냅니다. 인간 림프 및 점 막 조직의 문화 및 비보 전 도전 에이즈-1의 연구에 대 한 격리 된 세포에 따라 기존의 시스템에 비해 몇 가지 장점을 제공 합니다. 예를 들어, 조직 상주 세포 주변 혈액 단 셀1반대로 exogenous 활성화의 부재에 에이즈-1 감염을 지원할 수 있습니다. 림프 조직 explants의 사용 기본 CD4 T 세포 소모즉, 방관자 효과7, 급성 감염의 특징은 몇 가지 주요 메커니즘의 더 나은 이해를 허용 했다. 림프 조직8 여 포 B 셀 등 여성 생식 기 점 막 explants9 상피 구조의 보전이이 사이트에서 에이즈-1 감염의 공간 및 기능 기능을 통합 독특한 기회를 제공 합니다. Antiretrovirals 및 multitarget microbicides12, 의 전 임상 시험에 대 한 뿐만 아니라 모델을 연구 및 herpesvirus 공동 감염10,11, histocultures 성공적으로 사용 되었다 마지막으로, 13 , 14 , 15.
여기, 편도 선 및 낮은 여성의 성 기 요로 (자 궁 경부)에서 점 막 조직에서 얻은 인간 조직 explants의 문화에 대 한 자세한 프로토콜 덮고 비 편광 방식으로 에이즈-1 도전 explant를 조직 해 부 설명 합니다. 문화 지원, 젤라틴 스폰지를 사용 하 여 액체 공기 인터페이스에서 조직 explants의 모세 혈관, 따라서 그들의 자연적인 감퇴를 지연 스폰지를 통해 문화 매체 영양소에 대 한 액세스를 제공 하면서 산소를 공기에 노출을 극대화 합니다. Hiv-1 복제를 평가 하는 우리의 시스템에 가장 즉각적인 방법은 immunoassay 또는 정량 시간이 지남에 explant 문화 매체에 발표 하는 바이러스의 양을 측정 하는 것입니다. 에이즈-1 감염 및 병 인 (예., CD4 T 세포 소모) cytometry 여 조직 explants 대량 RNA/DNA 추출 및 정량, 제자리에서 얼룩, 또는 조직 소화 시 단일 세포 분석 평가할 수 있습니다.
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Protocol
인간의 조직의 컬렉션에 대 한 프로토콜 로컬 관할 당국에 의해 윤리적인 승인을 요구할 수 있습니다. 편도 선 수술, 자 군 절제 등 지정 된 수술의 경우는 표본은 연구 목적을 위해 특별히 수집 하 고 연구에 여겨진다 인간 대상 연구 (건강의 국가 학회. 인간 주제에 연구입니다. https://humansubjects.nih.gov/walkthrough-investigator#tabpanel11)입니다. 그러나, 조직 기증자 개인 및 의료 데이터를 가져오기 (예., 성별, 나이, 현재 약물 사용, 감염 등의 역사)를 해석 하는 실험 결과 동의 해야 하는 개인 정보 보호에 대 한 포즈 우려 도움이 될 수 있습니다 조직 컬렉션에 대 한 프로토콜에서 해결.
주의: 전체 프로시저가 수행 되어야 합니다 밖으로 생물 안전 캐비닛에. '건강 한' 개인에서 그들을 포함 하 여 모든 인간의 표본, 전염 성 요원을 항구 수 있습니다. 연산자는 실험 HIV의 사용을 포함 하지 않는 경우에 안전 하 게 처리 조직 표본, 혈액을 매개로 병원 체와 함께 작동 하도록 훈련을 받아야 한다. 조직 해 부 및 hiv 감염의 절차의 위험 평가 연산자 및 동료의 안전을 보장 하기 위해 훈련 된 직원에 의해 수행 되어야 합니다. HIV 감염의 사용 국가 유해 체액 및 혈액을 매개로 병원 균 연구소 관련 규정에 따라 전용된 biosafety 수준 2 또는 3 환경을 필요합니다.
1입니다. 젤라틴 스폰지의 준비
참고: 비록 그것이 엄격 하 게 조직 해 부 하기 전에 젤라틴 스폰지를 준비 하는 데 필요한, 그것은 더 편리 조직의 또는 많은 기증자에서 큰 금액을 처리 하는 경우에 특히, 여기에 설명 된 순서에 따라.
- 문화 매체 (CM)를 준비 하 고 항생제 솔루션 (Tircacillin-clavulanate 믹스) CMT (자료 테이블)을 사용 하기 전에 그것을 보충. 모든 남은 항생제 솔루션을 삭제 합니다.
참고: Ticarcillin 및 CMT에서 clavulanate 제대로 안정 있습니다. 필요한 경우, 다시 보충 CMT 항생제 솔루션 준비에서 약 24 시간 후. 매체 마다 24 h 동안 문화 explant을 항생제 솔루션을 추가 하는 필요 하지 않습니다. - CMT의 약 20-30 mL로 100 m m x 20 mm 페 트리 접시를 채우십시오.
참고:이 설정은 최적의 시간에 두 6-잘 접시 또는 한 12-잘 접시에 대 한 충분 한 젤라틴 스폰지를 준비 하는. 많은 접시 필요한 경우 속도 준비를 더 넓은 샬레와 큰 CMT 볼륨을 사용 합니다. - 소독 집게를 사용 하 여 배양 접시에 젤라틴 sponge(s)를 전송 합니다. 양쪽에 스폰지를 젖은 고 1 분 살 균 주걱을 사용 하 여 약 2 분 페 트리 접시의 바닥에 스폰지를 눌러에 대 한 매체를 흡수 하기 위해 스폰지.
참고:이 단계는 중요 한 중요성의 때문 스펀지에서 공기 방울의 존재는 문화 매체 영양소는 조직에 도달 하는 모세 혈관 차단입니다. 젤라틴 스폰지는 탈수 때 매우 취 성. 부드럽게 아래로 눌러 스폰지에 처음 특히 주걱으로 스폰지를 위반을 피하기 위해. - 약 1 c m2의 동일한 크기의 조각으로 rehydrated 젤라틴 스폰지를 잘라 사용 무 균가 위. 1 스폰지 조각 문화 접시의 각 음에 집게를 사용 하 여 전송 합니다. 12-잘 접시 (경부)에 각 음 6 잘 플레이트 (편도)의 그리고 잘 당 1 mL에 CMT의 3-4 mL를 추가 합니다. 조직 explants는 스폰지에 로드할 준비가 될 때까지 37 ° C, 5% CO2, ≥ 90% 습도 설정 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
참고: 접시에 추가 하는 CMT의 볼륨 explants는 액체-공기 인터페이스에서 유지 하는 스폰지의 두께를 조정 한다.
2입니다. 인간의 편도 선 조직의 해 부
참고: 편도 해야 처리, 수술 후 즉시 이상적으로 수술 당일. 또는, 표본 남아 있을 수 있습니다 하룻밤에 잠긴된 CMT 4 ° c.에
- CM 수 있도록 충분 한 시간을 실 온 (RT)에 도달 하거나 물 욕조에 넣어 37 ° c.에 미리 예 열 사용 하기 전에 항생제 솔루션 (CMT) CM를 보충 한다. 남은 모든 항생제 솔루션을 삭제 합니다. 포 셉, 메스 해 부 절차 동안 필요할 때마다을 깨끗 한 용기에 70% 에탄올 용액을 붓는 다. 도구를 청소 하 고 다른 기증자 로부터 표본 해 사이 메스 블레이드를 변경.
- 소독 집게를 사용 하 여 CMT의 10-20 mL를 포함 하는 100 mm 페 트리 접시에 편도 운송 컨테이너에서 전송.
참고: 멎, 피 묻은, 광범위 한 분야와 표본 또는 괴 사 성 조직 폐기 해야한다. - 절단 표면으로 페 트리 접시의 뚜껑을 사용 하 여 조직 해 부. 집게와 조직을 부드럽게 잡고, 살 균 메스와 블레이드를 사용 하 여 여러 큰 조각으로 각 편도 선 잘라.
주의: 처리 날카로운 도구를 인간의 표본을 해 부 부상 및 오염 위험을 증가. 연산자 추가 보호로 금속, 메쉬, 절단 방지 장갑 착용을 고려해 야 합니다. - 제거, 피 묻은, 멎 고 섬유질 조직, 그리고 모든 부품 및/또는 녹색 갈색 색상으로 사용 하 여 집게 메스 tonsilloliths (석 회 질된 물질)을 포함 하.
참고: 조직에의 한 조각에 대 한 작업, 그것은 조직의 건조를 피하기 위해 중간에 빠져들 조직의 나머지를 유지 하는 것이 중요. - 두께에서 약 2 m m의 조각으로 각 조직 조각을 잘라. 이전 단계에서 모든 원치 않는 부분을 제거 합니다. 2 m m 두께 스트립에 조직 조각을 잘라. 2 m m 두꺼운 블록으로 조직 스트립을 잘라. 이 약 8 m m3의 조직 explants 될 해야 합니다.
- 해 부와 함께 진행 하는 동안 조직의 건조를 피하기 위해 CMT의 10-20 mL를 포함 새로운 100 mm 페 트리 접시에는 explants 전송. 해 부의 끝에, 무작위로 explant 분포 접시를 소용돌이 친다. 장소 9 조직 explants 그들 사이 공간이 집게를 사용 하 여 6 잘 플레이트에 각 젤라틴 스폰지 위에. 인큐베이터에 접시를 반환 합니다.
참고: 일반적으로, explants 교양 하룻밤와 에이즈-1 문화의 접종 다음 날 수행 됩니다. 이것은 세균 이나 곰 팡이 오염 없이 문화에서 개발 다는 것을 확인 하입니다. 또한, 세포는 절 개 후 편도 선 조직 explants 탈출구 경향이 있다. 이 과정은 크게 문화1의 첫 24 시간 이내 완료 됩니다. - 유해 체액 및 특정 위험 평가 처리에 연구소의 규정에 따라 적절 한 컨테이너에서 모든 생물 학적 폐기물의 처분.
3. 편도 선 조직 감염 Explants 에이즈-1
참고: 독립적인 실험 사이의 결과 변화를 줄이기 위해, 동일한 바이러스 준비 전체 연구를 위해 사용 될 해야 합니다. 것 활성화 된 주변 혈액 단 세포에 바이러스를 전파 수 고 표면에 뜨는 문화 반복 중지 및 재개 (자료 테이블)을 피하기 위해 aliquoted-80 ° C에서 저장 될 수 있습니다.
- 37 ° c.에 미리 예 열 물 욕조에 CM을 넣어 사용 하기 전에 항생제 솔루션 (CMT) CM를 보충 한다. 모든 남은 항생제 솔루션을 삭제 합니다.
- 피 펫과 6-잘 plate(s)에 매체를 발음 하 고 살 균 제 솔루션 컨테이너에서 삭제. 접시를 기울기와 잘 수 있도록 하단에 수집 하 고 발음 그것을 버리고 중간의 위쪽 부분에 젤라틴 스폰지를 부드럽게 밀어. 각 우물에 CMT의 3-4 mL를 추가 합니다.
- 37 ° c.에 물 목욕에 있는 에이즈-1 바이러스 준비를 녹여 필요한 경우, CM (표 1)와 함께 바이러스 재고 희석.
참고: 선택한 inoculum 5-8 µ L (표 1)의 볼륨에 포함 된 있도록 바이러스 주식 희석 수 한다. 효율적인 감염, 그것은 녹고 HIV-1 준비와 조직 explants 감염 사이 필요한 최소 시간을 사용 하 여 중요 한. - 바로 위에 젤라틴 스펀지에 9 explants의 각 바이러스 inoculum 플라스틱 감염이 완료 되 자 마자 인큐베이터에는 plate(s)를 반환 합니다. 모든 잔여 바이러스 준비를 삭제 합니다. 섹션 5를 계속 합니다.
참고: 정확 하 게 제공 바이러스 inoculum 연산자를 고려해 야 역방향 pipetting 기술을 사용 하 여 모든 음에 대 한 팁을 변경 합니다. 이 피 펫 피스톤 지우기 위치 (두 번째 정류장)를 바이러스 inoculum, 아래로 밀어 포함 하 고 작은 반복된 샘플링 연관 거품 형성을 최소화 하 고 오류 inoculum을 전달 하기 위해 첫 번째 정류장에 추진 볼륨, 즉, 5-8 µ L.
4. 해 부 및 자 궁 경부 점 막의 감염
참고: 최적의 결과 위해 자 궁 경부 거칠어 explants 해야 처리 되며 이상적으로 수술 당일 수술 후 가능한 한 빨리 감염. 또는, 표본 저장할 수 있습니다 하룻밤, 4 ° C에서 CMT에 잠수 하 고 감염 된 절 개 후 즉시.
- CM 수 있도록 충분 한 시간을 RT에 도달 하거나 물 욕조에 넣어 37 ° c.에 미리 예 열 사용 하기 전에 항생제 솔루션 (CMT) CM를 보충 한다. 모든 남은 항생제 솔루션을 삭제 합니다. 집게와 메스 해 부 절차 동안 필요할 때마다을 깨끗 한 용기에 70% 에탄올 용액을 붓는 다. 도구를 청소 하 고 해 여러 기증자 로부터 표본 사이 메스 블레이드를 변경.
- 소독 집게를 사용 하 여 전송할 샘플 운송 컨테이너에서 100 mm 페 트리 접시 CMT의 10-20 mL를 포함 하.
- 절단 표면으로 페 트리 접시의 뚜껑을 사용 하 여 조직의 해 부. 집게, 조직 부드럽게 개최 ectocervix endocervix의 점 막 stromal 밑에서 고 점 막의 근육 조직 (submucosa) 메스와 블레이드를 제거 합니다.
참고: 조직에의 한 조각에 대 한 작업, 그것은 조직의 건조를 피하기 위해 중간에 빠져들 조직의 나머지를 유지 하는 것이 중요. - 점 막 2 m m 넓은 스트립으로 잘라 제거 하 고 조직의 단지 2 m m 두꺼운 층을 떠나 가능한 많은 submucosa 삭제. 2 m m 두꺼운 블록으로 스트립을 잘라. 이 약 8 m m3의 조직 explants 될 해야 합니다.
주의: 처리 날카로운 도구를 인간의 표본을 해 부 부상 및 오염 위험을 증가. 연산자 추가 보호로 금속, 메쉬, 절단 방지 장갑 착용을 고려해 야 합니다. - 해 부와 함께 진행 하는 동안 조직의 건조를 피하기 위해 CMT의 10-20 mL를 포함 새로운 100 mm 페 트리 접시에 전송 조직 explants. 해 부의 끝에, 무작위로 explant 분포 접시를 소용돌이 친다.
- 살 균 겸 살 균 1.5 mL 원뿔 tube(s) (관 당 최대 16 explants)으로 explants 전송할. 피 펫을 사용 하 여 튜브에 모든 매체를 제거 합니다.
- 37 ° c.에 물 목욕에 있는 에이즈-1 준비 해 동 필요한 경우는 explants 포함 된 tube(s)에 CM. 전송 바이러스 바이러스 재고 희석. 모든 잔여 바이러스 준비를 삭제 합니다.
참고: 선택한 inoculum 최소 0.5 mL (표 1)의 볼륨에 포함 된 있도록 바이러스 주식 희석 수 한다. 독립적인 실험 사이의 결과 변화를 줄이기 위해, 동일한 바이러스 준비는 전체 연구 (자료 테이블)에 사용 되어야 한다. - 온도-통에 튜브를 전송 및 300 rpm에서 락 37 ° C에서 2 시간에 대 한 품 어. 부드럽게 튜브 몇 매 30-60 분 번 반전.
참고: 효율적인 감염, 그것은 녹고 HIV-1 준비 하 고 37 ° c.를 튜브를 전송 사이 필요한 최소 시간을 사용 하 여 중요 한 - 3-4 mL의 멸 균 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 당로 6-잘 접시를 채우십시오. 에 있는 에이즈-1 보육의 살 균 제 솔루션을 피 펫을 사용 하 여 컨테이너에는 tube(s)에서 모든 바이러스 준비 취소. 6 잘 플레이트 집게를 사용 하 여 PBS를 포함 하는 explants 전송할.
- RT, 1 분에 대 한 PBS에 나머지 explants 허용 하 고 다음 그들을 씻어 부드럽게 pipetting으로 위아래 PBS 우물에 2-3 번. 살 균 제 솔루션을 피 펫을 사용 하 여 컨테이너에 PBS를 삭제 합니다. 각 우물에 새로운 PBS의 3-4 mL를 추가 합니다. 3 세척의 총에 대 한 두 번 더 반복 합니다. 바로 조직의 건조를 피하기 위해 스폰지는 explants 전송 전에 PBS를 삭제 합니다.
참고: Explants 특정 endocervix, 그리고 자 궁 경부 점 막의 감염 시 점액의 큰 금액을 놓습니다. 그것은 씻어 explants 및 문화 상쾌한에 바이러스의 후속 릴리스 난다 보존 바이러스 복제를 마스크 수 있기 때문에 가능한 많은 점액을 제거 하는 중요 한. - 12-잘 접시에 각 젤라틴 스폰지 위에 5-8 explants 전송 집게를 사용 하 여. 인큐베이터에 접시를 반환 합니다.
- 유해 체액 및 특정 위험 평가 처리에 연구소의 규정에 따라 적절 한 컨테이너에서 모든 생물 학적 폐기물의 처분.
5입니다. Histoculture
- 감염 된 후 12-15 날까지 감염의 시간에서 출발 3 일 마다 CM 변경 합니다. CM 및 explants는 다른 매개 변수 중 hiv-1 복제를 평가 하기 위해 문화 시간에 걸쳐 정기적으로 샘플링할 수 있다.
- 37 ° c.에 미리 예 열 물 욕조에 CM을 넣어
참고: 그것은이 단계에서 항생제 솔루션 CM을 보완 하기 위해 필요 하지 않습니다. - 피 펫와 CM의 샘플을 수집 하 고 살 균 1.5 또는 2 mL 나사 모자 tube(s)-80 ° c.에 저장용으로 전송
참고: 복제 우물에서 CM 컬렉션에서 풀링됩니다. - 소독 집게와 조직 explants 수확 (옵션), 종이에 그들을 배치 하 여 explants에 초과 매체를 제거 하 고 explants 살 균 1.5 또는 2 mL 나사 모자 tube(s)로 전송. 처리 하거나 실험에 의해 필요에 따라 조직 샘플을 저장 합니다.
참고: cytometry, 위해 explants는 즉시 소화 (자세한 내용은 참조 하십시오 참조 1, 9, 16, 및 17)에 대 한 단일 세포 현 탁 액을 얻기 위해 효소 칵테일으로. RNA 추출 explants-80 ° c.에서 그들을 저장 하기 전에 하룻밤 4 ° C에서 RNA 안정화 솔루션에 유지 됩니다. DNA 추출 또는 제자리에 (자 궁 경부) 얼룩, explants 스냅-액체 질소 나 드라이 아이스/에탄올 슬러리에 냉동 고 수-80 ° c.에 저장 또는 편도 선 explants는 제자리에 얼룩에 대 한 PBS와 4 %paraformaldehyde 해결책에 있는 침수에 의해 해결할 수 있습니다. - 잔여 CM에는 피 펫을 잘 발음 하 고 살 균 제 솔루션 컨테이너에 그것을 폐기. 접시를 기울기 고 하단, 수집 매체 수 있도록 우물의 상단 부분에 젤라틴 스폰지를 부드럽게 밀어 고 발음 그것을 폐기.
- 각 우물에 CM의 3-4 mL를 추가 합니다. 소독 집게를 사용 하 여 어떤 조직 explants는 젤라틴 스폰지를 중간에 반환 합니다. 인큐베이터에 접시를 반환 합니다.
- 문화의 끝에, 유해 체액 및 특정 위험 평가 처리에 연구소의 규정에 따라 적절 한 컨테이너에서 모든 생물 학적 폐기물의 처분.
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Representative Results
조직 explants에서 hiv-1 복제를 평가 하기 위해 몇 가지 기법을 사용할 수 있습니다. 우리의 표준 읽어 에이즈-1 p24개 그 immunoassay18시간이 지남에 cm에서 발표의 양을 측정 하는 것입니다.
같은 HIV-1 재고의 동일한 inoculum 감염 다른 기증자 로부터 조직 explants는 다른 양의 바이러스 (표 1)를 얻을 수 있습니다. 이것은 수와 에이즈-1 대상 셀의 상태와 공동 감염 조직16,19에서 병원 균의 존재 등 여러 가지 요인 때문 이다. 그림 1에서 제공 하는 자 궁 경부 점 막 explants p24 cm 일치 하는 기증자 explants 투여 약물 lamivudine (3TC)로 치료에 비해 발표개 그 의 양을 의해 정의 된 대로의 생산적이 고 조산 에이즈-1 감염의 예 그는 완전히 hiv-1 복제를 억제합니다. 이 컨트롤이 나타납니다 조직 explants의 감염에 대 한 불필요 한 A에 기증자에서 비록 그것 (B) (C)에서 explants hiv-1 복제의 저급을 생성 하는 생산적인 감염에서에서 조산 감 별에 도움이 됩니다.
제어 조건으로 투여 약물의 사용 공부 에이즈-1 감염 대상 셀, 자 궁 경부 점 막 같은 느린 복제 HIV-1 변형, 일부 기본 격리 등을 사용할 때의 낮은 수 항구 조직에 유용할 수 있습니다. 또한, 이러한 바이러스에 감염 된 조직에 대 한 더 민감한 탐지 방법, 예를 들어 정량 Pcr를 사용 하 여 중요 하다.
그림 1 : 자 궁 경부 점 막에서 hiv-1 복제 3 다른 조직 기증자 로부터 explants. 자 궁 경부 조직 explants 에이즈-1벨 의 동일한 inoculum 바이러스 주식에 침수에 의해 감염 되었고 10 µ M. 문화 매체의 농도에서 투여 약물 lamivudine (3TC)의 유무에 15 일 동안 교양 샘플링 모든 3 일 및 복제 우물에서 샘플 1 HIV p24개 그 immunoassay 여 hiv-1 복제의 분석에 대 한 컬렉션에서 풀링된 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 조직 유형 | 바이러스 | Inoculum explant (에이즈-1 p24개 그의 pg) 당 | 롤 explants의 | 문화 매체 볼륨 (mL) | 롤 우물 (기술 복제)의 | 에이즈-1 p24개 그 생산 (ng/mL) |
| 편도 선 | 에이즈-1발 | 350-500 | 9 | 3-4 | 2-3 | 1-10 |
| 에이즈-1LAI.04 | 9 | 3-4 | 2-3 | 1-100 | ||
| 자 궁 경부 | 에이즈-1발 | 1500-2000 | 8 | 1 | 2 | 1-5 |
| 에이즈-1LAI.04 | 8 | 1 | 2 | 탐지 |
표 1: V-1 inoculum 조직 explants 및 바이러스의 감염에 대 한의 값을 참조. 에이즈-1 inoculum 당 개별 조직 explant의 값이 50-70 ng/mL의 농도에서 바이러스 주식 참조: undiluted 바이러스 주식의 7 µ L의 볼륨은 젤라틴 스폰지; 위에 각 편도 선 explant 감염 하는 데 사용 됩니다 undiluted 바이러스 주식의 500 µ L 양의 1.5 mL 튜브에 침수에 의해 16 자 궁 경부 explants 감염 하는 데 사용 됩니다. 자 궁 경부 explants 젤라틴 스폰지에 그들을 전송 하기 전에 PBS에 광범위 하 게 세척 된다. 에이즈-1 생산 조직 explants의 값 p24개 그 1 ml (경부), 8 explants 또는 9 explants 문화의 12-15 일 동안 3 일 마다 샘플링 문화 매체 (CM)의 3-4 mL (편도)에 의해 발표의 누적 금액을 말합니다. 복제 우물에서 CM은 신선한 CM와 그것을 교체 하기 전에 각 시간 지점에 대 한 컬렉션에서 풀링된. 부분적으로 차지 바이러스 흡수 explants 및 CM, 즉, inoculum 월 후속 릴리스 때문에 p24개 그 농도 3 일에 측정의 가치 분석에서 제외 했다. 일반적으로, HIV-1LAI.04 와 자 궁 경부 조직의 감염 우리의 실험 시스템16감지 hiv-1 복제 연결 되지 않습니다.
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Discussion
인간의 조직 사용 explants 에이즈-1 감염의 연구는 전통적인 bi 차원 및 monotypic 실험 시스템 1 차 셀 또는 셀 라인, 세포 상호 작용 재현 하 그들의 뛰어난 능력 때문에 이점을 제공 하 고 휴대 기능 vivo에서그들은 (예를 들어, cytokine 생산). 그럼에도 불구 하 고, 편도 선 및 자 궁 경부 조직 수, 및 HIV 대상 셀1,16의 phenotypic와 기능적 특성 등 여러 측면에서 다르다. 같은 이유로 HIV-1 변형 (예:, CCR5 회귀선 HIV-1발 CXCR4 회귀선 HIV-1LAI.04대) 아니라 다른 공동 수용 체 차 있는 굴곡 운동으로 편도 자 궁 경부 (표 1)에서 다르게 수행합니다. 대상 세포에서 면역 유도 및 이펙터에 에이즈 coreceptors의 배포 사이트 일부만 로컬 민감성 감염에 대 한 계정: CXCR4 들고 CD4 T 세포는 CCR5 표현 셀 보다 더 풍부한 편도 선 조직에 따라서 설명 복제의 상부 V-1LAI.04 보다 에이즈-1발, 하지만 수용 체 자 궁 경부 점 막16에 동등 하 게 표시 됩니다. 그럼에도 불구 하 고, 우리가 거의 감지 생산성 바이러스 복제 에이즈-1LAI.04 vivo에서20 개별 CCR5 회귀선 HIV-1 변종의 우선 전송 라인은 도전 하는 자 궁 경부 조직에 . 이 HIV-1 대상 세포의 분화 및 활성화 상태 hiv-1 복제16을 지원 하기 위해 그들의 능력을 결정 궁극적으로 수 있습니다 제안 합니다.
젤라틴 스폰지는 hemostatic 순화 돼지 피부 (콜라겐)에서 얻은 몇 주 후 인체에 완전히 흡수 하도록 설계 되었습니다. 그들은 맞게 2-3 주 동안 액체 공기 인터페이스에서 조직 explants 유지의 목적으로 문화에 느린 저하 속도 보여주는 제품을 사용 하는 것이 좋습니다. Explant 문화에 일관 된 성능을 평가 하는 동일한 제품의 다른 배치 테스트 것이 좋습니다.
마찬가지로, 유형 및 소 태아 혈 청 (FBS)의 많은 hiv-1 복제 수준 달라질 수 있습니다. 우리 테스트 FBS CM 최적화에 대 한 여러 많은 조언을 하 고 전체 연구 FBS의 같은 많은 사용 합니다. 우리는 정기적으로 10 기증자 로부터 조직 explants에 FBS를 테스트 하 고 가장 높은 hiv-1 복제를 제공 하는 많은 선택.
실험의 대부분, 우리 풀 explants endocervix 및 실험 조건 수를 최대화 하는 ectocervix에서. 하나는 그들의 다른 구조 및 면 역학적 기능21때문에 분리 그들을 유지 하는 것을 고려할 수 있습니다. 또한, endocervical explants 출시 하 고 계속 다운스트림 분석을 방해할 수 있는 문화에 점액의 상당량을 생산 하. 으로 보고 endocervix 영역 보다 훨씬 작습니다 ectocervix, 그것은 도전 endocervical 점 막에 독점적으로 HIV 감염 실험을 수행 하는 적절 한 사용 하 여 explants의 숫자 및 기술적인 복제 합니다.
에이즈-1 감염 자 궁 경부 explants의 침수에 의해 수행 CD4 T 세포 림프 조직에 비해 점 막에 존재의 낮은 수 때문에 생산적인 감염을 얻기의 기회를 극대화 합니다. 같은 이유로 자 궁 경부 조직 하룻밤 스토리지에 더 과민 하 고 더 높은 HIV-1 복제 및 즉시 절 개 후 수술 후 감염을 생성 합니다. 바이러스 주식에 침수에 의해 감염 바이러스에 explants의 균일 한 노출 되도록 편도 선 조직에 대 한 또한 수행할 수 있습니다, 있지만이 이렇게 설명한 젤라틴 스폰지에 explants의 감염 보다 더 높은 조직 조작 및 셀 손실 수반 프로토콜.
에이즈-1 도전 편광된 시스템 및 점 막 조직의 문화 존재 하 고 현재 다른 실험실3,22,23,,2425에 사용 됩니다. 이러한 시스템은 에이즈-1 및 점 막으로 침투의 귀중 한 모델, 비록 그들의 설정 일반적으로 더 많은 시간이 소요 되 고 광범위 한 조직 조작 해야 할 수 있습니다. 점 막 전송/pathogenesis의 모델 비 편광 여전히 내 인 성 및 외 인 요인9,17 에 의해 에이즈에 감염 된 세포의 hiv-1 복제의 규칙 그리고 지역 조사를 유효한 플랫폼 제공 , 26,12,13,,1415약 등.
간 기증자 가변성 여러 기증자 로부터 견본을 사용 하 여 실시 하는 독립 실험 사이의 결과 재현성에 대 한 주요 문제를 나타낼 수 있습니다. 세포 구성에 변화는 동일한 표본, 즉, 내부 기증자 가변성 내의 지역 영향을 또한 수 있습니다. 줄이고 변화 결과 제대로 해석, 모든 조건 같은 기증자 (기증자 일치 조건)에서 얻은 explants의 적절 한 번호를 사용 하 여 하나의 실험에서 설정 중요 하다. 결과는 데이터 통계 분석에 대 한 여러 실험에서 컴파일할 때 내부 컨트롤에 정규화 될 수 있습니다. 내부-기증자 다양성을 줄이기 위해, 편도 선 조직 (9/잘)의 18 explants 및 자 궁 경부 점 막 (5-8/잘) (표 1)의 10-16 explants의 총 각 실험 조건에 대 한 최소한 2 기술 복제를 포함 하는 것이 좋습니다. 의료 기록의 가용성 및 환자 자료의 예를 들어 주소는 견본의 염증 성 상태 실험 조건 추가 분석 포함 크게 향상 시킬 수 있습니다 결과 해석 (참조 9에 대 한 예)입니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 재단 Blanceflor 본 콤 파 니 비시 옛 Bildt (http://blanceflor.se/), 에이즈 (http://www.aidsfond.se/, 참고 FOa2014-0006)와 피코 안드레아 전자 리비 Lorini (http에 대하여 재단 스웨덴 의사에서 교부 금에 의해 지원 되었다 : / / fondazionelorini.it/) 안드레아 Introini에.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelfoam 12-7 mm Absorbable gelatin sponge | Pfizer | NDC: 0009-0315-08 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
| SPONGOSTAN Standard 70 × 50 × 10 mm Absorbable haemostatic gelatin sponge | Ferrosan Medical Devices | MS0002 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
| RPMI 1640 with phenol red and glutamine | ThermoFisher Scientific | 21875034 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Modified Eagle's medium (MEM) non-essential aminoacids (100x) | ThermoFisher Scientific | 11140035 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Sodium pyruvate, 100 mM (100x) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Gentamicin 50 mg/mL (1000x) | ThermoFisher Scientific | 15750037 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Amphotericin B 250 μg/mL (100x) | ThermoFisher Scientific | 15290018 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Fetal bovine serum (FBS) | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). | ||
| Ticarcillin disodium salt | Sigma-Aldrich | T5639-1G | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3 g) and potassium clavulanate (100 mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
| Potassium clavulanate | Sigma-Aldrich | 33454-100MG | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3 g) and potassium clavulanate (100 mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
| Sterile phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 w/o calcium, magnesium and phenol red | To use for storage and transportation of surgical specimens. PBS can be replaced with another isotonic solution with physiologic pH. Culture medium is best for overnight storage. | ||
| Sterile cell culture grade water | |||
| Sterile transportation container | |||
| 70% ethanol solution | |||
| Disinfectant solution for biological waste disposal | |||
| Sterile metal forceps or tweezers | |||
| Sterile metal scissors | |||
| Sterile flat weighing metal spatula | |||
| Sterile scalpels and blades | |||
| 6-well cell culture plates | |||
| 12-well cell culture plates | |||
| Sterile Petri dish, 100 mm × 20 mm | |||
| Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1BaL | NIH AIDS Reagent Program | 510 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1LAI.04 | NIH AIDS Reagent Program | 2522 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Lamivudine (3TC) | NIH AIDS Reagent Program | 8146 | Resuspend in DMSO at 10 mg/mL, aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Biological safety cabinet | |||
| Water-jacketed CO2 incubator, set at 37 °C, 5% CO2, ≥ 90% humidity | |||
| Water bath set at 37 °C | |||
| Sterile 1.5 and 2mL screw cap tubes | |||
| Dry bath shaker with heating block for 1.5 mL tubes, set at 37 °C, 300 rpm |
References
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