Summary
Infeksjon av menneskelig vev med humant immunsviktvirus (HIV) ex vivo gir en verdifull 3D modell av virus patogenesen. Her beskriver vi en protokoll for å behandle og infisere vevsprøver fra menneskelige mandlene og kvinnelige genital mucosae med HIV-1 og opprettholde dem i kultur på flytende-luft-grensesnittet.
Abstract
Histocultures kan studere intercellulære interaksjoner i menneskelig vev, og de kan benyttes til modell vert-patogen interaksjoner under kontrollerte laboratorieforhold. Ex vivo infeksjon av menneskelig vev med humant immunsviktvirus (HIV), blant andre virus, har blitt brukt til å undersøke patogenesen ved tidlig sykdom, så vel som en plattform for å teste effekten og toksisitet av antivirale legemidler. I stede protokollen forklarer vi hvordan å behandle infisere med HIV-1 vev explants fra menneskelige mandlene og cervical mucosae og opprettholde dem i kultur over gelatin svamper på flytende-luft-grensesnittet for ca to uker. Innstillingen for ikke-polarized kultur maksimerer tilgang til næringsstoffer i kultur medium og oksygen, selv om progressiv tap av vev integritet og funksjonelle arkitekturer forblir den viktigste begrensningen. Denne metoden kan overvåke HIV-1 replikering og patogenesen ved hjelp av flere teknikker, inkludert immunanalyser, qPCR og flowcytometri. Betydning, kan fysiologiske variasjon mellom vev givere og mellom explants fra forskjellige områder av samme prøven, påvirke eksperimentelle resultater. For å sikre resultatet reproduserbarhet, er det viktig å bruke et tilstrekkelig antall explants, teknisk gjentak og donor-matchet kontroll betingelser til å normalisere resultatene fra experimental behandlinger når samle data fra flere eksperimenter (dvs. ., gjennomført ved hjelp av vev fra ulike givere) for statistisk analyse.
Introduction
Største bi-dimensjonale cellekulturer, her referert til som konvensjonelle, gjøre ikke rede for romlige og funksjonelle kommunikasjonen mellom rekke celletyper som utgjør vev og organer. Dette aspektet er av avgjørende betydning for eksperimentelle modeller av sykdom, som innblanding homøostatisk intercellulære interaksjoner er den drivende faktoren av alle patologi. Vev explants tilbyr store fordeler for modellering helse og sykdom hos mennesker fordi de beholder cytoarchitecture og mange viktige funksjonelle aspekter av organer som i vivo, men for en begrenset mengde tid1. For eksempel på ex vivo utfordring med tilbakekalling antigener, for eksempel difteritoksoid eller stivkrampe toxoid, svarer tonsillar vev med en energisk produksjon av antigen-spesifikke antistoffer2. Som alle andre ex vivo modell, histoculture har sine egne begrensninger: mellom donor variasjon, vev polarisering, begrenset vev overlevelse og problemer med overvåking celler utenfor dybden av AC confocal mikroskopi1. Likevel beholdes menneskelig vev explants en modell av valg å studere homøostatisk og patogene immunologiske prosesser hos mennesker, inkludert vert-patogen interaksjoner og potensielle terapeutiske tiltak3.
De kritiske hendelsene i HIV-1 patogenesen skje i vev. Infeksjoner i genital mucosa utgjør flertallet av alle HIV-1 overføring begivenheter verdensomspennende4. Lymfoidvev er den store virus replikering under akutt infeksjon og havner en betydelig mengde latently-infiserte celler5, og deres persistens representerer det viktigste hinderet å oppnå en kur6. Kultur og ex vivo utfordringen med menneskelig lymfoide og mucosal vev gir noen fordeler fremfor konvensjonelle systemer basert på isolerte celler for studiet av HIV-1. For eksempel, kan vev-resident celler støtte HIV-1 smitte i fravær av eksogene aktivisering, i motsetning til perifert blod mononukleære celler1. Bruk av lymfoid vev explants har gjort en bedre forståelse av noen viktige mekanismer underliggende CD4 T celle utarmingdvs., den tilskuer effekt7, som er kjennemerket på akutt infeksjon. Bevaring av strukturer som B celle follicles i lymfoidvev8 og epitel i kvinnelige genital mucosa explants9 tilbyr en unik mulighet til å integrere romlige og funksjonelle funksjoner av HIV-1 smitte på disse stedene. Til slutt, histocultures ble brukt til modellen og studere HIV-1 og herpesvirus co infeksjon10,11og prekliniske testing av et vindpust av håp og multitarget microbicides12, 13 , 14 , 15.
Her beskriver vi en detaljert protokoll for kulturen i menneskelig vev explants mandlene og mucosal vev fra lavere female genital tract (livmorhalsen), som dekker vev disseksjon å explant utfordring med HIV-1 i en ikke-polarized måte. Kulturen av vev explants på flytende-luft-grensesnittet ved hjelp av gelatin svamper støtte, maksimerer avsøring å luften oksygen mens gir tilgang til kultur medium næringsstoffer gjennom svampen kapillærene, dermed forsinke deres naturlig nedbrytning. Den mest umiddelbare muligheten til å vurdere HIV-1 replikering i vårt system er å måle mengden av viruset løslatt i explant kultur medium over tid immunanalyse eller qPCR. HIV-1 smitte og patogenesen (f.eks., CD4 T celle uttømming) kan også vurderes i vev explants av bulk RNA/DNA utvinning og qPCR, i situ flekker eller enkelt celle-analyse på vev fordøyelsen av flowcytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen for samling av menneskelig vev kan kreve etiske godkjenning av lokale kompetente myndigheter. Ved angitte operasjoner som tonsillectomy og hysterektomi, de er ikke samlet spesielt for forskning formålet og studien anses ikke mennesker forskning (National Institutes of Health. Forskning på mennesker. https://humansubjects.nih.gov/Walkthrough-Investigator#tabpanel11). Men å skaffe vev donorer personlig og medisinske data (f.eks., kjønn, alder, aktuell narkotikabruk, historie infeksjoner, etc.) som kan bidra til å tolke eksperimentelle resultater, utgjør bekymringer om samtykke og personvern som må adressert i protokollen for vev samling.
Forsiktig: Hele prosedyren skal utføres i en biologisk sikkerhet regjering. Alle menneskelige eksemplarer, inkludert de fra "sunn" individer, kan havn smittestoffer. Operatøren bør få opplæring arbeide med blodbårne patogener å håndtere trygt vevsprøver, selv om eksperimenter ikke involverer bruk av HIV. En risikovurdering av prosedyren i vev disseksjon og infeksjon med HIV bør utføres av opplært personale for å sikre sikkerheten til operatør og kolleger. Bruk av smittsomme HIV krever dedikert biosikkerhet nivå 2 eller 3 miljøer avhengig av land og Institutt-spesifikke regler for farlige biologicals og blodbårne patogener.
1. forberedelse Gelatin svamper
Merk: Selv om det ikke strengt nødvendig å forberede gelatin svamper før vev disseksjon, det er mer praktisk å følge rekkefølgen som er beskrevet her, spesielt når du håndterer store mengder av vev og/eller fra mange givere.
- Forberede kultur medium (CM) og supplere det med antibiotika løsning (Tircacillin-clavulanate mix) før bruk for å gjøre CMT (Tabell for materiale). Kast noen leftover antibiotika løsning.
Merk: Ticarcillin og clavulanate i CMT er dårlig stabil. Hvis nødvendig, å supplere CMT med antibiotika løsning etter ca 24 timer fra forberedelse. Det er ikke nødvendig å legge antibiotika løsning å explant mediet hver 24 h under kultur. - Fyll en 100 mm x 20 mm Petriskål med ca 20-30 mL av CMT.
Merk: Denne innstillingen er optimalt å forberede nok gelatin svamper to 6-vel plater eller en 12-vel plate samtidig. Hvis mange plater er nødvendig, bruk en bredere Petriskål og større CMT volum for å fremskynde utarbeidelse. - Overføre gelatin sponge(s) i Petriskål bruker sterilt tang. Våte svamper på begge sider og la svampene slikke medium for 1 min. Trykk svampene mot bunnen av Petriskål i ca 2 minutter med en bakteriefri slikkepott.
Merk: Dette trinnet er avgjørende fordi tilstedeværelsen av luftbobler i svampen vil sperre kapillærene som kultur medium næringsstoffer nå vev. Gelatin svamper er ekstremt skjøre når dehydrert. Skyv ned på svamp med spatelen, spesielt i begynnelsen, å unngå å bryte svamp. - Bruk sterilt saks til å klippe utvannet gelatin svampene i stykker av lik størrelsen på ca 1 cm2. Overføre 1 svamp stykke ved hjelp av pinsett i hver brønn av en kultur plate. Legge til 3-4 mL CMT i hver brønn av en 6-vel plate (mandlene) og 1 mL per brønn i en 12-vel plate (livmorhalsen). Sett platene i inkubator, satt på 37 ° C, 5% CO2, ≥ 90% fuktighet, til vev explants er klar til å lastes inn på svampene.
Merk: Volumet på CMT å legge inn platen skal justeres til tykkelsen på svamp å holde explants på flytende-luft-grensesnittet.
2. Disseksjon av menneskelig Tonsillar vev
Merk: Mandlene bør behandles så snart som mulig etter operasjonen, ideelt samme dagen. Eventuelt kan prøver stå over natten neddykket i CMT på 4 ° C.
- Tillate CM nok tid til å nå romtemperatur (RT) eller sette den i et vannbad pre varmet på 37 ° C. Supplere CM med antibiotika løsning (CMT) før bruk. Forkaste alle antibiotika løsning igjen. Hell 70% etanol løsning i en ren beholder å suge tang og skalpell når nødvendig under disseksjon prosedyren. Rengjør verktøy og endre skalpell bladet mellom disseksjoner av prøver fra ulike givere.
- Overføre mandlene fra beholderen transport til et 100 mm-Petri tallerken med 10-20 mL CMT bruker sterilt tang.
Merk: Prøver med utbredt områdene cauterized, blodig eller nekrotisk vev bør forkastes. - Bruke lokket av Petriskål som en skjæring overflate for å dissekere vev. Holder vevet forsiktig med tang, kutt hver mandel i flere store biter sterilt skalpell og blad.
Forsiktig: Håndtering sharp verktøy å dissekere menneske prøver øker risikoen for skade og forurensning. Operatøren bør vurdere iført metal, mesh, mot hansker som ekstra beskyttelse. - Fjern cauterized, blodig, og fibroid vev, og noen deler som inneholder tonsilloliths (calcified materiale) og/eller med grønn-brun farge med tang og skalpell.
Merk: Mens du arbeider på en del av, er det viktig å holde resten av vevet neddykket i medium å unngå vev uttørking. - Skåret brikkene vev i skiver ca 2 mm tykkelse. Fjerne uønskede deler som i forrige trinn. Skiver vev i 2 mm tykt strimler. Skjær strimler vev i 2 mm tykt kvartaler. Dette burde medføre vev explants omtrent 8 mm3.
- Overføre til explants til en ny 100 mm Petriskål inneholder 10-20 mL CMT å unngå vev uttørking mens du fortsetter med dissection. På slutten av disseksjon, snurr den å tilfeldig explant distribusjon. Sted 9 vev explants på hver gelatin svamp i en 6-vel plate ved hjelp av pinsett, slik at avstanden mellom dem. Tilbake platene til inkubator.
Merk: Vanligvis explants er kultivert over natten og vaksinasjon av kulturer med HIV-1 utføres neste dag. Dette er å sikre at ingen bakterier og sopp forurensning utvikler i kulturen. I tillegg celler har tendens til egress tonsillar vev explants etter disseksjon. Denne prosessen er hovedsakelig fullført innen de første 24 timer av kultur1. - Kast alle biologisk avfall i treffende beholdere etter instituttets regler for håndtering av farlige biologicals og bestemt risikovurdering.
3. infeksjon av Tonsillar vev Explants med HIV-1
Merk: For å redusere resultatet variasjon mellom uavhengige eksperimenter, samme virus utarbeidelse skal brukes for en hele studiet. Virus kan overføres i exogenously aktivert perifert blod mononukleære celler og deretter kulturen supernatant kan være aliquoted for lagring på-80 ° C å unngå gjentatt frysing og tining (Tabell for materiale).
- Sette CM i et vannbad pre varmet på 37 ° C. Supplere CM med antibiotika løsning (CMT) før bruk. Kast noen leftover antibiotika løsning.
- Sug opp mediet i 6-og plate(s) med en pipette, og kaste den i en container med desinfeksjonsmiddel. Tilt platen og skyv gelatin svampene til den øvre delen av brønnen tillate medium å samle nederst, og Sug opp og kaste den. Legge til 3-4 mL CMT i hver brønn.
- Tine HIV-1 virus forberedelse i vannbad på 37 ° C. Eventuelt fortynne virus lager med CM (tabell 1).
Merk: Virus aksjen bør fortynnes slik at den valgte inoculum finnes i et volum på 5-8 µL (tabell 1). For en effektiv infeksjon er det viktig å bruke den minste tid mellom tining HIV-1 utarbeidelse og infisere vev explants. - Pipetter virus inoculum direkte på hvert av de 9 explants på en gelatin svamp. Tilbake til plate(s) til inkubator når infeksjonen er fullført. Kast eventuelle gjenværende virus forberedelse. Fortsatt seksjon 5.
Merk: For å nøyaktig levere virus inoculum operatør bør vurdere bruker en omvendt pipettering teknikk og endrer dagens tips for hver godt. Dette innebærer skyve pipette stempelet ned til purge-posisjonen (det andre stoppet) å utarbeide virus inoculum, og skyve til første stopp å levere inoculum, som bidrar til å minimere boble dannes og feil forbundet med gjentatte prøvetaking av små volumer, dvs, 5-8 µL.
4. disseksjon og infeksjon i livmor Cervical Mucosa
Merk: For optimale resultater, explants av cervical mucosae skal behandles og infisert så snart som mulig etter operasjonen, ideelt samme dagen. Eventuelt kan prøver lagres neddykket i CMT på 4 ° C over natten, og infiserte umiddelbart etter disseksjon.
- Tillate CM nok tid til å nå RT eller sette den i et vannbad pre varmet på 37 ° C. Supplere CM med antibiotika løsning (CMT) før bruk. Kast noen leftover antibiotika løsning. Hell 70% etanol løsning i en ren beholder å suge den tang og skalpell når nødvendig under disseksjon prosedyren. Rengjør verktøy og endre skalpell bladet mellom disseksjoner av prøver fra flere givere.
- Bruker sterilt tang, overføre prøven fra beholderen transport til et 100 mm Petriskål inneholder 10-20 mL CMT.
- Bruke lokket av Petriskål som en skjæring overflate for å dissekere vevet. Holde vevet forsiktig med tang, separate mucosa for ectocervix eller livmorhalsen fra undersiden stromal og muskel vev (submucosa) med en skalpell og blad å få strimler av mucosa.
Merk: Mens du arbeider på en del av, er det viktig å holde resten av vevet neddykket i medium å unngå vev uttørking. - Skjær mucosa i 2-millimeters strimler, fjerne og forkaste submucosa så mye som mulig, slik at bare et 2 mm tykt lag av vev. Klippe strimler 2 mm tykt blokkene. Dette burde medføre vev explants omtrent 8 mm3.
Forsiktig: Håndtering sharp verktøy å dissekere menneske prøver øker risikoen for skade og forurensning. Operatøren bør vurdere iført metal, mesh, mot hansker som ekstra beskyttelse. - Overføring vev explants i en ny 100 mm Petriskål inneholder 10-20 mL CMT å unngå vev uttørking mens du fortsetter med dissection. På slutten av disseksjon, snurr den å tilfeldig explant distribusjon.
- Med sterilt tang, overføre explants til bakteriefri 1.5-mL konisk lysrør (maksimalt 16 explants per rør). Fjerne ethvert medium i røret ved hjelp av en pipette.
- Tine HIV-1 forberedelse i et vannbad på 37 ° C. Eventuelt fortynne virus lager CM. overføring viruset i lysrør som inneholder explants. Kast eventuelle gjenværende virus forberedelse.
Merk: Virus aksjen bør fortynnes slik at den valgte inoculum finnes i et volum på minimum 0,5 mL (tabell 1). For å redusere resultatet variasjon mellom uavhengige eksperimenter, skal samme virus utarbeidelse brukes for en hele studie (Tabell for materiale). - Overføre rør til en thermo-shaker og ruge 2 h på 37 ° C rocking på 300 rpm. Forsiktig Inverter rør et par ganger hver 30-60 minutter.
Merk: For en effektiv infeksjon er det viktig å bruke den minste tid mellom tining HIV-1 utarbeidelse og overføre rør til 37 ° C. - Fyll en 6-vel plate med 3-4 mL per brønn sterilt fosfat buffer saltoppløsning (PBS). På den med inkubering med HIV-1, forkaste alle virus forberedelse i lysrør i en beholder med desinfeksjonsmiddel med en pipette. Overfør explants til 6-vel platen inneholder PBS ved hjelp av pinsett.
- La explants hvile i PBS for 1 min på RT, og deretter vaske dem ved forsiktig pipettering opp PBS i brønnen 2 - 3 ganger. Kast PBS i en beholder med desinfeksjonsmiddel med en pipette. Legge til 3-4 mL nye PBS i hver brønn. Gjenta to ganger for totalt tre vasker. Kast PBS like før overføring av explants til svampene å unngå vev uttørking.
Merk: Explants cervical mucosa, og bestemt livmorhalsen, slipper store mengder Slim under infeksjon. Det er viktig å vaske og fjerne slim så mye som mulig fordi uspesifikke oppbevaring på explants og senere utgave av virus i kultur nedbryting kan maskere virus replikering. - Bruke pinsett, overføre 5-8 explants på hver gelatin svamp i en 12-vel plate. Returnere platen til inkubator.
- Kast alle biologisk avfall i treffende beholdere etter instituttets regler for håndtering av farlige biologicals og bestemt risikovurdering.
5. Histoculture
- Endre CM hver 3 dager fra tiden av smitte til dag 12-15 etter infeksjon. CM og/eller explants kan prøves regelmessig gjennom kultur tid til å vurdere HIV-1 replikering, blant andre parametere.
- Sette CM i et vannbad pre varmet på 37 ° C.
Merk: Det er ikke nødvendig å supplere CM med antibiotika løsning på dette stadiet. - Samle et utvalg av CM med en pipette og overføre den til bakteriefri 1.5 eller 2 mL skrukork lysrør for lagring på-80 ° C.
Merk: CM fra Repliker brønner er samlet på samling. - Høste vevet explants med sterilt tang, fjerne overflødig mediet på explants ved å plassere dem på et stykke papir (valgfritt) og overføre explants til bakteriefri 1.5 eller 2 mL skrukork lysrør. Behandle eller lagre vevsprøver som kreves av eksperimentet.
Merk: For flowcytometri, explants er umiddelbart fordøyd med en enzymatisk cocktail å få en enkeltcelle suspensjon (for mer detaljer se referanser 1, 9, 16 og 17). For RNA utvinning holdes explants i en RNA stabilisering løsning på 4 ° C over natten før du lagrer dem på-80 ° C. DNA utvinning eller i situ flekker (livmorhalsen), kan explants snapin-frosset i flytende nitrogen eller tørris/etanol slurry og lagret på-80 ° C. Tonsillar explants kan også løses ved neddykking i en løsning av PBS og 4% paraformaldehyde til i situ farging. - Sug opp den gjenværende CM i brønnen med en pipette, og kaste den inn i en container med desinfeksjonsmiddel. Vipp platen og skyv gelatin svampene til den øvre delen av brønnen tillate medium å samle på bunnen, og deretter Sug opp og kaste den.
- Legge til 3-4 mL CM i hver brønn. Bruker sterilt tang, returnere alle vev explants som falt til medium til gelatin svamp. Returnere platen til inkubator.
- På slutten av kultur, kast alle biologisk avfall i treffende beholdere etter instituttets regler for håndtering av farlige biologicals og bestemt risikovurdering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flere teknikker kan brukes til å vurdere HIV-1 replikasjon i vev explants. Våre standard lese-out er å måle mengden av HIV-1 p24kneble utgitt i CM over tid med en immunanalyse18.
Vev explants fra ulike givere, infisert med den samme inoculum på samme HIV-1 lager, kan gi ulike mengder virus (tabell 1). Dette skyldes flere faktorer, for eksempel antall og status for HIV-1 målet celler og tilstedeværelsen av co infisere patogener i vev16,19. I figur 1gir vi et eksempel på produktiv og mislykket HIV-1 smitte av cervical mucosa explants som definert av mengden p24kneble utgitt i CM sammenlignet med donor-matchet explants behandlet med antiretroviral narkotika lamivudin (3TC) som undertrykker helt HIV-1 replikering. Selv om denne kontrollen vises overflødig for infeksjon i vev explants fra donor i A, hjelper det i diskriminerende mislykket (B) fra produktiv infeksjon (C) i explants som gir lave nivåer av HIV-1 replikering.
Bruk av en antiretrovirale medisiner som en kontroll tilstand kan være nyttig å studere HIV-1 smitte i vev som havn lave antall målcellene, som cervical mucosa, og ved sakte-replikere HIV-1 varianter, som noen primære isolater. I tillegg for vev infisert med slike virus, er det viktig å vurdere å bruke mer følsomme gjenkjenningsmetoder, for eksempel qPCR.
Figur 1 : HIV-1 replikering i cervical mucosa explants fra tre ulike vev givere. Cervical vev explants var infisert med den samme inoculum av HIV-1Motkonto ved neddykking på virus lager og kultivert for 15 dager i tilstedeværelse eller fravær av antiretroviral narkotika lamivudin (3TC) på konsentrasjonen av 10 µM. kultur medium samplede hver 3 dager og eksempler fra Repliker brønner ble samlet på samling for analyse av HIV-1 replikering av HIV-1 p24kneble immunanalyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Vev type | Virus | Inoculum per explant (pg av HIV-1 p24kneble) | nei. av explants | Kultur medium volum (mL) | nei. brønner (teknisk gjentak) | HIV-1 p24kneble produksjon (ng/mL) |
| Tonsillar | HIV-1BaL | 350-500 | 9 | 3-4 | 2-3 | 1 – 10 |
| HIV-1LAI.04 | 9 | 3-4 | 2-3 | 1-100 | ||
| Livmorhalskreft | HIV-1BaL | 1500-2000 | 8 | 1 | 2 | 1 – 5 |
| HIV-1LAI.04 | 8 | 1 | 2 | undetectable |
Tabell 1: verdier av HIV-1 inoculum for infeksjon i vev explants og virus produksjon. Verdien av HIV-1 inoculum per personlige vev explant refererer til virus aksjer på konsentrasjonen av 50-70 ng/mL: et volum på 7 µL av ufortynnet virus lager brukes til å infisere hver tonsillar explant over en gelatin svamp; et volum på 500 µL av ufortynnet virus lager til å infisere 16 cervical explants ved neddykking i en 1,5 mL tube. Cervikal explants er grundig vasket i PBS før du overfører dem til gelatin svamper. Verdien av HIV-1 produksjonen av vev explants refererer til den samlede summen av p24kneble utgitt av 8 explants i 1 mL (livmorhalsen) eller 9 explants i 3-4 mL (mandlene) kultur medium (CM) samplet hver 3 dager over 12-15 dager kultur. CM fra Repliker brønner er samlet på samling for hvert punkt før du erstatter den med ferske CM. Verdien av p24kneble konsentrasjon målt på dag 3 ble ekskludert fra analysen fordi den delvis står for virus absorpsjon på explants og utgivelse i CM, dvs, inoculum bære-over. Infeksjonen av cervical vev med HIV-1LAI.04 fører vanligvis ikke synlig HIV-1 replikasjon i vår eksperimentelle system16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bruk av menneskelig vev explants for studiet av HIV-1 smitte gir fordeler fremfor tradisjonelle bi-dimensjonale og største eksperimentelle systemer, for eksempel primær celler eller linjer, grunn av sin overlegne evne til å reprodusere intercellulære interaksjoner og Cellular funksjoner (f.ekscytokiner produksjonen) som i vivo. Likevel tonsillar og cervical vev skiller i mange aspekter inkludert antall og fenotypiske og funksjonelle egenskaper HIV målet celler1,16. Av samme grunn utføre HIV-1 varianter med forskjellige co reseptor tropism (f.eksCCR5-tropic HIV-1BaL vs CXCR4-tropic HIV-1LAI.04) forskjellig både i mandlene og cervix (tabell 1). Fordelingen av HIV coreceptors på målcellene immun induktive og effektor nettsteder bare delvis kontoer for lokale mottakelighet for infeksjon: CD4 T celler bærer CXCR4 er mer rikelig enn CCR5-uttrykke celler i tonsillar vev, dermed forklare høyere replikering nivåer av HIV-1LAI.04 enn HIV-1Motkonto, men receptors er like representert i cervical mucosa16. Likevel, vi sjelden oppdaget produktiv virus replikering i cervical vev utfordret med HIV-1LAI.04, som er i tråd med fortrinnsrett overføring av personlige HIV-1 CCR5-tropic varianter i vivo20 . Dette tyder på at HIV-1 målcellene differensiering og aktivisering status kan til slutt bestemmer deres evne til å støtte HIV-1 replikering16.
Gelatin svamper er hemostatic enheter fra renset svin hud (kollagen), som er utformet for å være helt absorbert av kroppen etter noen uker. Vi anbefaler å bruke produkter som viser langsomme nedbrytning rate i kultur som de passer bedre til formålet med opprettholde vev explants på flytende-luft-grensesnittet for 2-3 uker. Vi anbefaler også teste forskjellige bunker av det samme produktet å vurdere konsistent ytelse på explant kultur.
Tilsvarende kan type og masse fosterets bovin serum (FBS) påvirke HIV-1 replikering nivåer. Vi anbefaler testing flere masse FBS for CM optimalisering og bruke den samme masse FBS for en hele studiet. Vi rutinemessig teste FBS på vev explants fra 10 givere og velg som gir den høyeste HIV-1-replikeringen.
For de fleste av eksperimenter basseng vi explants fra livmorhalsen og ectocervix å maksimere antall eksperimentelle forhold. Man kan vurdere å holde dem atskilt på grunn av deres forskjellige strukturelle og immunologiske funksjoner21. Også endocervikalt explants utgivelse og fortsette å produsere en stor mengde Slim i kultur som kan forstyrre nedstrøms. Ettersom området som dekkes av livmorhalsen er mye mindre enn ectocervix, det er utfordrende å utføre HIV infeksjon eksperimenter på endocervikalt mucosa replikerer bruker et tilstrekkelig antall explants og teknisk.
Utfører HIV-1 smitte ved neddykking av cervical explants maksimerer sjansene for å få en produktiv infeksjon på grunn av lavere CD4 T celler i mucosa sammenlignet med lymfoidvev. Av samme grunn, cervical vev er mer følsomme for natten lagringsplass og gir høyere HIV-1 replikering når infisert kort tid etter operasjonen og umiddelbart etter disseksjon. Selv om infeksjon ved neddykking på virus lager kan utføres også for tonsillar vev for å sikre ensartet eksponering for explants virus, innebærer denne tilnærmingen høyere vev manipulasjon og celle tap enn infeksjon av explants på gelatin svamper som beskrevet i protokollen.
Polarisert systemer av HIV-1 utfordring og kultur av slimhinnene vev finnes og som brukes i andre laboratorier3,22,23,24,25. Selv om disse systemene er en verdifull modell av HIV-1 oppføring og gjennomtrengning i mucosa, deres oppsett er generelt mer tidkrevende og krever omfattende vev manipulasjon. Ikke-polarisert modeller av slimhinnene overføring/patogenesen fortsatt tilby en gyldig plattform for å undersøke regulering av HIV-1 replikering og lokale pool av HIV-infiserte celler av endogene og ytre faktorer9,17 , 26, inkludert narkotika12,13,14,15.
Mellom donor variasjon kan representere en viktig sak for resultatet reproduserbarhet mellom uavhengige eksperimenter utført med prøver fra flere givere. Variasjon i mobilnettet komposisjon kan påvirke områder i samme prøven, dvs, intra-giver variasjon. Å redusere variasjonen og riktig tolke resultatene, er det viktig å definere alle vilkår i et eksperiment med et tilstrekkelig antall explants fra samme donor (donor-matchet betingelser). Resultatene kan normaliseres en intern kontroll når samle data fra flere eksperimenter for statistisk analyse. For å redusere intra-giver variasjon, anbefaler vi inkludert si 2 teknisk gjentak for hver eksperimentelle tilstand, totalt 18 explants av tonsillar vev (9/vel), og 10-16 explants av cervical mucosa (5-8/vel) (tabell 1). Tilgjengeligheten av medisinske poster og inkludering av ytterligere analyse av pasienten materiale og/eller eksperimentelle forhold, for eksempel å ta provoserende status for en prøve, kan betydelig forbedre resultatet tolkning (se referansen 9 et eksempel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Foundation Blanceflor Vittorio Ludovisi nee Bildt (http://blanceflor.se/), Foundation svenske leger mot AIDS (http://www.aidsfond.se/, ref. FOa2014-0006) og Fondazione Andrea e Libi Lorini (http : / / fondazionelorini.it/) til Andrea Introini.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelfoam 12-7 mm Absorbable gelatin sponge | Pfizer | NDC: 0009-0315-08 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
| SPONGOSTAN Standard 70 × 50 × 10 mm Absorbable haemostatic gelatin sponge | Ferrosan Medical Devices | MS0002 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
| RPMI 1640 with phenol red and glutamine | ThermoFisher Scientific | 21875034 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Modified Eagle's medium (MEM) non-essential aminoacids (100x) | ThermoFisher Scientific | 11140035 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Sodium pyruvate, 100 mM (100x) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Gentamicin 50 mg/mL (1000x) | ThermoFisher Scientific | 15750037 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Amphotericin B 250 μg/mL (100x) | ThermoFisher Scientific | 15290018 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Fetal bovine serum (FBS) | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). | ||
| Ticarcillin disodium salt | Sigma-Aldrich | T5639-1G | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3 g) and potassium clavulanate (100 mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
| Potassium clavulanate | Sigma-Aldrich | 33454-100MG | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3 g) and potassium clavulanate (100 mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
| Sterile phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 w/o calcium, magnesium and phenol red | To use for storage and transportation of surgical specimens. PBS can be replaced with another isotonic solution with physiologic pH. Culture medium is best for overnight storage. | ||
| Sterile cell culture grade water | |||
| Sterile transportation container | |||
| 70% ethanol solution | |||
| Disinfectant solution for biological waste disposal | |||
| Sterile metal forceps or tweezers | |||
| Sterile metal scissors | |||
| Sterile flat weighing metal spatula | |||
| Sterile scalpels and blades | |||
| 6-well cell culture plates | |||
| 12-well cell culture plates | |||
| Sterile Petri dish, 100 mm × 20 mm | |||
| Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1BaL | NIH AIDS Reagent Program | 510 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1LAI.04 | NIH AIDS Reagent Program | 2522 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Lamivudine (3TC) | NIH AIDS Reagent Program | 8146 | Resuspend in DMSO at 10 mg/mL, aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Biological safety cabinet | |||
| Water-jacketed CO2 incubator, set at 37 °C, 5% CO2, ≥ 90% humidity | |||
| Water bath set at 37 °C | |||
| Sterile 1.5 and 2mL screw cap tubes | |||
| Dry bath shaker with heating block for 1.5 mL tubes, set at 37 °C, 300 rpm |
References
- Grivel, J. C., Margolis, L. Use of human tissue explants to study human infectious agents. Nature protoc. 4 (2), 256-269 (2009).
- Glushakova, S., Grivel, J. C., Fitzgerald, W., Sylwester, A., Zimmerberg, J., Margolis, L. B. Evidence for the HIV-1 phenotype switch as a causal factor in acquired immunodeficiency. Nat Med. 4 (2), 346-349 (1998).
- Dezzutti, C. S. Animal and human mucosal tissue models to study HIV biomedical interventions: can we predict success. J Int AIDS Soc. 18 (1), 20301 (2015).
- Global epidemic Update 2016. UNAIDS. , Available from: http://www.unaids.org/en/resources/documents/2016/Global-AIDS-update-2016 (2016).
- Lederman, M. M., Margolis, L. The lymph node in HIV pathogenesis. Semin Immunol. 20 (3), 187-195 (2008).
- Chun, T. W., Moir, S., Fauci, A. S. HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure. Nat Immunol. 16 (6), 584-589 (2015).
- Biancotto, A., et al. HIV-1 induced activation of CD4+ T cells creates new targets for HIV-1 infection in human lymphoid tissue ex vivo. Blood. 111 (2), 699-704 (2008).
- Van Laar, J. M., et al. Sustained secretion of immunoglobulin by long-lived human tonsil plasma cells. Am J Pathol. 171 (3), 917-927 (2007).
- Introini, A., et al. Seminal plasma induces inflammation and enhances HIV-1 replication in human cervical tissue explants. PLoS Pathog. 13 (5), 1006402 (2017).
- Grivel, J. C., et al. Suppression of CCR5- but not CXCR4-tropic HIV-1 in lymphoid tissue by human herpesvirus 6. Nat Med. 7 (11), 1232-1235 (2001).
- Rollenhagen, C., Lathrop, M. J., Macura, S. L., Doncel, G. F., Asin, S. N. Herpes simplex virus type-2 stimulates HIV-1 replication in cervical tissues: implications for HIV-1 transmission and efficacy of anti-HIV-1 microbicides. Mucosal Immunol. 7 (5), 1165-1174 (2014).
- Lisco, A., et al. Acyclovir is activated into a HIV-1 reverse transcriptase inhibitor in herpesvirus-infected human tissues. Cell Host Microbe. 4 (3), 260-270 (2008).
- Vanpouille, C., et al. A common anti-cytomegalovirus drug, ganciclovir, inhibits HIV-1 replication in human tissues ex vivo. AIDS. 31 (11), 1519-1528 (2017).
- Andrei, G., et al. Topical tenofovir, a microbicide effective against HIV, inhibits herpes simplex virus-2 replication. Cell Host Microbe. 10 (4), 379-389 (2011).
- Greenhead, P., Hayes, P., Watts, P. S., Laing, K. G., Griffin, G. E., Shattock, R. J. Parameters of human immunodeficiency virus infection of human cervical tissue and inhibition by vaginal virucides. J Virol. 74 (12), 5577-5586 (2012).
- Saba, E., et al. HIV-1 sexual transmission: early events of HIV-1 infection of human cervico-vaginal tissue in an optimized ex vivo model. Mucosal Immunol. 3 (3), 280-290 (2010).
- Introini, A., Vanpouille, C., Lisco, A., Grivel, J. C., Margolis, L. Interleukin-7 facilitates HIV-1 transmission to cervico-vaginal tissue ex vivo. PLoS Pathog. 9 (2), 1003148 (2013).
- Biancotto, A., et al. A highly sensitive and dynamic immunofluorescent cytometric bead assay for the detection of HIV-1 p24. J Virol Methods. 157 (1), 98-101 (2009).
- Lisco, A., Vanpouille, C., Margolis, L. War and peace between microbes: HIV-1 interactions with coinfecting viruses. Cell Host Microbe. 6 (5), 403-408 (2009).
- Keele, B. F., et al. Identification and characterization of transmitted and early founder virus envelopes in primary HIV-1 infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (21), 7552-7557 (2008).
- Pudney, J., Quayle, A. J., Anderson, D. J. Immunological microenvironments in the human vagina and cervix: mediators of cellular immunity are concentrated in the cervical transformation zone. Biol Reprod. 73 (6), 1253-1263 (2005).
- Ganor, Y., et al. Within 1h, HIV-1 uses viral synapses to enter efficiently the inner, but not outer, foreskin mucosa and engages Langerhans-T cell conjugates. Mucosal Immunol. 3 (5), 506-522 (2010).
- Cavarelli, M., Foglieni, C., Rescigno, M., Scarlatti, G. R5 HIV-1 envelope attracts dendritic cells to cross the human intestinal epithelium and sample luminal virions via engagement of the CCR5. EMBO Mol Med. 5 (5), 776-794 (2013).
- Cummins, J. E., et al. Preclinical testing of candidate topical microbicides for anti-human immunodeficiency virus type 1 activity and tissue toxicity in a human cervical explant culture. Antimicrob Agents Chemother. 51 (5), 1770-1779 (2007).
- Abner, S. R., et al. A human colorectal explant culture to evaluate topical microbicides for the prevention of HIV infection. J Infect Dis. 192 (9), 1545-1556 (2005).
- Saba, E., et al. Productive HIV-1 infection of human cervical tissue ex vivo is associated with the secretory phase of the menstrual cycle. Mucosal Immunol. 6 (6), 1081-1090 (2013).
