Summary
Dieses Manuskript beschreibt das Protokoll für Bimolekulare Ergänzung Affinitätsreinigung (BiCAP). Diese neuartige Methode ermöglicht bestimmte Isolierung und Charakterisierung der nachgeschalteten Proteomic zwei interagierenden Proteine während ausgenommen un komplexiert einzelne Proteine sowie komplexe mit konkurrierenden Bindungspartner gebildet.
Abstract
Die Montage von Proteinkomplexen ist ein zentraler Mechanismus zugrunde liegt die Regulierung der vielen Zelle Signalwege. Ein wichtiger Schwerpunkt der biomedizinischen Forschung ist entziffern, wie diese dynamische Proteinkomplexe handeln, um Signale aus mehreren Quellen um eine spezifische biologische Reaktion direkt zu integrieren, und wie dies in vielen Krankheit Einstellungen dereguliert wird. Trotz der Bedeutung dieses wichtigen biochemischen Mechanismus gibt es ein Mangel an experimentellen Techniken, die die spezifisch und sensitiv Dekonvolution dieser Multi-Molekulare Signalisierung komplexe erleichtern können.
Hier richtet sich dieses Manko durch die Kombination eines Protein-Ergänzung-Assays mit einer Konformation-spezifische gemeinnützige, die wir Bimolekulare Ergänzung Affinitätsreinigung (BiCAP) bezeichnet haben. Diese neuartige Technik ermöglicht die spezielle Isolierung und nachgelagerten Proteomic Charakterisierung jedes Paar von interagierenden Proteine, unter Ausschluss des un-komplexiert einzelne Proteine und komplexe mit konkurrierenden Bindungspartner gebildet.
BiCAP-Technik ist anpassungsfähig an eine breite Palette von nachgelagerten experimentelle Tests und der hohe Grad an Spezifität bot durch diese Technik ermöglicht mehr differenzierte Untersuchungen in die Mechanik der Protein komplexen Baugruppe als derzeit möglich ist mit Standard-Affinität Reinigungstechniken.
Introduction
Protein-komplexen Baugruppe ist ein Schlüsselprozess bei der Aufrechterhaltung der raumzeitlichen Spezifität von vielen Signalisierung Wege1,2. Während die kritische Natur dieser regulatorische Rolle allgemein anerkannt ist, gibt es ein Mangel an experimentellen Techniken zur Verfügung, um diese komplexe unter die Lupe nehmen. Die meisten phänotypische Studien konzentrieren sich auf Interaktionen mit einzelne Proteine oder die sequentielle Bereicherung einzelner komplexe Komponenten. Hier präsentieren wir eine Technik für die Isolierung von einem spezifischen Protein-Dimer, während mit Ausnahme der einzelnen Moieties Komponente Proteine sowie komplexe mit konkurrierenden verbindliche Partner3gebildet. Wir haben diese Technik namens Bimolekulare Ergänzung Affinitätsreinigung (BiCAP), es ist eine Kombination eines bereits vorhandenen Protein Fragment Komplementierung Assays, Bimolekulare Fluoreszenz-Ergänzung (BiFC), mit dem neuartigen Einsatz von einer Konformation-spezifische rekombinante gemeinnützige GFP und seine Derivate (siehe Table of Materials).
Ein typische Protein-Fragment Komplementierung Assay stützt sich auf den Ausdruck der "Köder" und "Beute" Proteine verschmolzen um Fragmente der Reporter wie Luciferase4, β-Galaktosidase5oder grün fluoreszierendes Protein (GFP)6 ( teilen Abbildung 1A). Durch das Zusammenspiel der Köder und Beute Proteine sollen die Split-Reporter-Domänen in eine funktionale Struktur, so dass die Interaktion des Köders Umfalten und Beute Proteine visualisiert oder quantifiziert werden. BiCAP wurde von einer Version dieser Technik, die aus der Fragmente der GFP Variante Venus verwenden. Fluoreszierendes Protein-Ergänzung-Assays sind eine beliebte Methode zur Visualisierung von Protein-Protein-Interaktionen in einer live-Zelle, aber bis jetzt wurden auf diese eine Funktion7beschränkt. BiCAP stellt einen bedeutenden Fortschritt in dieser Hinsicht, da diese Technik nicht nur zur Visualisierung, aber auch die Isolation und Verhöre der daraus resultierenden Protein-Protein Interaktion erlaubt.
Abbildung 1: die strukturelle wichtigsten hinter die BiCAP Technik. (A) ein Schema skizziert die wichtigsten hinter Bimolekulare Fluoreszenz Ergänzung zeigt "bait" und "Beute" Proteine mit der N-terminalen V1 oder V2 C-terminale Fragmente des Full-Length Venus Proteins markiert. (B) strukturelle Analyse der Interaktion (Cyan) Schnittstelle zwischen der GFP gemeinnützige (grün) und rekombinierte Venus, welche die Position der (grau) V1 und V2 (orange) Fragmente (PDB Beitritt 3OGO). Diese Zahl ist neu veröffentlichte FromCroucher Et Al.3 Abdruck mit freundlicher Genehmigung von AAAS. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
BiCAP macht Technik verwenden zwei nicht fluoreszierenden Fragmente der Venus (benannt V1 und V2), die mit einem niedrigen Grad von Affinität zu verbinden, es sei denn, eine Interaktion zwischen ihrer Fusion Partner auftritt. In diesem Fall Einspritzen die beiden geteilten Domains in die funktionale β-Fass-Struktur der Fluorophor (Abbildung 1 b)6. Die entscheidende Neuerung des BiCAP stammt aus der Einführung des rekombinanten GFP-gemeinnützige, die eine dreidimensionale Epitop auf dem β-Fass GFP (und Varianten wie Venus) erkennt, die nur auf die korrekt rekombinierte und gefalteten Fluorophor ( vorhanden ist Abbildung 1 b)8. Entscheidend ist, bindet die GFP gemeinnützige nicht entweder die einzelnen Fragmente der Venus. Dies erleichtert die Isolierung von Proteinen Dimere erst, nachdem die beiden Proteine, einen Komplex aus eigenem Antrieb gebildet haben, führt zu mehr repräsentative Ergebnisse als die erworbenen aus Methoden, die machen von chemisch induzierten, erzwungene Interaktionen9verwenden.
BiCAP ist eine leistungsstarke Technik, die speziell auf Multi-Protein-komplexe, die potenziell können, mit einer Anzahl von downstream-Anwendungen kombiniert werden, die Granularität der unser Verständnis von der Rolle zu verbessern, die diese komplexe in der Signaltransduktion spielen . Es umfasst auch das wichtige Merkmal der Visualisierung von Protein-Interaktionen in Situermöglicht. Bis heute BiCAP als eine wirksame Methode zur Analyse der Interaktom von Rezeptor-Tyrosin-Kinase (RTK) Dimere3nachgewiesen, aber die Anpassungsfähigkeit dieser Methode bedeutet, dass es in fast jedem Protein Interaktion Kontext angenommen werden kann.
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Protocol
(1) Plasmid Klonen
Hinweis: Um Plasmid-Vektoren mit den V1 oder V2 Tags verschmolzen, der N-Terminus oder C-Terminus des Gens von Interesse zu erzeugen, BiFC Ziel Vektoren hinterlegt worden mit Addgene [N-Terminal-Tag: pDEST-V1-ORF (#73635), pDEST-V2-ORF (#73636). C-terminale Tag: pDEST-ORF-V1 (#73637), pDEST-ORF-V2 (#73638)]. Gen/s von Interesse müssen in bestimmten Rekombination Klonen kompatibel Eintrag Vektoren (z.B. pDONR223 oder pENTR221), ohne Stop-Codons, zum Klonen fortsetzen werden. Viele kompatible Klone sind bereits im Plasmid Sammlungen, darunter die Säugetier-Genom-Sammlung (https://genecollections.nci.nih.gov/MGC/) verfügbar.
- Führen Sie eine Rekombination Reaktion um das Gen des Interesses zwischen den AttR-Standorten des entsprechenden Vektors BiFC Ziel einzufügen:
- Fügen Sie in ein 0,2 mL-Tube 150 ng Eintrag Vektor, 150 ng BiFC Ziel Vektor und 8 µL TE-Puffer (pH 8,0).
- Fügen Sie 2 µL Rekombinase Enzym-Mix (siehe Tabelle der Materialien). Gut mischen und kurz Zentrifugieren.
- Inkubieren Sie die Reaktion für 1 h bei Raumtemperatur oder bei 16 ° C über Nacht.
- Die Reaktion von 1 µL Proteinase K-Lösung und Inkubation bei 37 ° C für 10 min zu stoppen.
- Hitze-Schock-kompetente Zellen (siehe Tabelle der Materialien) mit der LR Reaktionsprodukt zu verwandeln:
Hinweis: Jede grundlegende Belastung kann denkbar an dieser Stelle verwendet werden, solange es nicht die Ccdb Gegengift, enthält die die gezielte Auswahl der Plasmide, die mit dem Einsatz verhindern würde.- Kompetente Zellen auf Eis Auftauen und 50 µL Zellen in ein 14 mL Runde Talsohle Polypropylen-Rohr übertragen.
- Die Zellen 1 µL Reaktionsprodukt hinzufügen und vorsichtig mischen. Inkubieren Sie für 20 min auf Eis.
- Erhitzen Sie Schock im Wasserbad 42 ° C für 45 s. sofort wieder für 2 min Eis.
- Fügen Sie 1 mL LB Medien und unter Schütteln bei 37 ° C für 1 h inkubieren.
- Die Transformation auf eine 10 cm-Agar-Platte mit Ampicillin-Platte (100 µg/mL) und über Nacht bei 37 ° C inkubieren.
- Reinigung von BiFC Plasmid.
- Plasmid aus einer einzelnen Kolonie zu reinigen, 100 mL LB Medien zu einem großen konischen Kolben und hinzufügen Ampicillin (100 µg/mL). Mehrere Kolonien auf dem Bildschirm, Runde Talsohle Polypropylenröhrchen 14 mL 5 mL LB Medien hinzufügen und fügen Sie Ampicillin (100 µg/mL).
- Mit einem sterilen Impfschlinge, nehmen Sie eine einzige Kolonie von der Agarplatte. Legen Sie die Impfschlinge in den LB Medien und kurz mixen.
- Decken Sie die Spitze der konischen Flasche mit Alu-Folie und Inkubation über Nacht bei 37 ° C mit schütteln.
- Transfektion Grade Plasmid DNA mit Hilfe einer standard Maxiprep oder Midiprep Plasmid DNA zu produzieren Reinigung kit (siehe Tabelle der Materialien)10. Qualität der DNA durch Absorption Spektren zu bewerten.
Hinweis: Sollte DNA haben ein Verhältnis von A260/A280 > 1,8 und ein Verhältnis von A260/A230 > 2.0. An dieser Stelle empfiehlt es sich, mehrere einzelne Kolonien für effiziente Ausdruck einfügen und Tag überprüfen Bildschirm.
2. Handy-Kultur und Transfektion
Hinweis: Zur Transfektion der BiFC Vektoren ist es wichtig, eine hohe Effizienz und relativ homogene Transfektion zu erreichen. Die Vektoren werden wahrscheinlich mit jedem standard Transfection Reagens kompatibel, und die Transfektion Bedingungen sollten entsprechend optimiert werden. Zum Ausführen der Massenspektrometrie Kulturzellen wir in der Regel innerhalb von 10 cm Gerichte, obwohl dies auch proportional verkleinert werden kann, kleinere Gerichte oder Platten für Experimente, die weniger Material benötigen.
- 1.0 × 106 HEK293T Samenzellen in einer 10 cm Schüssel mit 10 mL DMEM Medien, ergänzt mit 10 % FBS und Penicillin/Streptomycin (1: 100).
- Verdünnen Sie 2,5 µg von jeder BiFC Vektor in 500 µL Puffer Transfektion (siehe Tabelle der Materialien) in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.
- Fügen Sie 10 µL Transfection Reagens (siehe Tabelle der Materialien).
- Vortex-Mischung für 10 s, dann kurz Zentrifuge. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Die Platte, tropfenweise die DNA Transfektion Mischung hinzufügen. Inkubieren Sie die Zellen für eine ausreichende Zeitspanne für die BiFC Schmelzverfahren Proteine interagieren und Venus, die Falten und Fluorophor Reifung, in der Regel ca. 8-24 h.
Hinweis: Die Peak-Anregung für Venus ist 515 nm und seiner Peak-Emission ist 528 nm, obwohl dies ohne weiteres angesehen wird, mit einem standard Leuchtstofflampen Mikroskop so eingerichtet, dass die GFP Fluoreszenz sichtbar zu machen.
3. die Probenvorbereitung
-
Ernte von Lysaten
- Vor der lysate Entnahme vorbereiten Zelle Lysis Puffer [50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 % (V/V) nichtionische Reinigungsmittel (siehe Tabelle der Materialien)]. Shop bei 4 ° C.
- Unmittelbar vor der Ernte, 10 mL von Zelle Lysis Puffer mit Protease-Inhibitor und Phosphatase-Inhibitor (siehe Tabelle der Materialien) zu ergänzen. Halten Sie ergänzt Zelle Lysis Puffer auf Eis.
- Waschen Sie Zellen in eiskaltem PBS zweimal. Aspirieren der PBS und 1 mL eiskaltes ergänzt Zelle Lysis Puffer. Legen Sie die Schale auf Eis, sicherzustellen, dass der Puffer über die gesamte Fläche verteilt ist.
- Inkubieren Sie für ca. 5 min auf Eis, dann verwenden Sie einen Zelle Schaber (siehe Tabelle der Materialien), die Zellen zu kratzen und zu einem vorgekühlt 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch übertragen.
- Entfernen Sie zelltrümmer durch Zentrifugieren der gesammelten lysate auf 18.000 × g für 5 min bei 4 ° C und Übertragung gelöscht überstand in frischen Mikrozentrifugenröhrchen.
Hinweis: an dieser Stelle die lysate können sofort eingesetzt oder bei-80 ° c gelagert Es wird auch empfohlen, eine Aliquote von Rohöl lysate zu halten, damit die Effizienz der Transfektion und der Affinitätsreinigung validiert werden kann.
-
Affinitätsreinigung
Hinweis: Der BiCAP Isolierung Schritt erfolgt mit der GFP-gemeinnützige konjugiert, Agarose Korne (siehe Tabelle der Materialien).- Bereiten Sie die Agarose-Perlen durch eine angemessene Lautstärke (20 µL pro Probe) + 10 µL überschüssige in 1 mL PBS waschen. Die Perlen bei 300 X g zentrifugieren und den überstand zu entfernen.
- Jede lysate Probe 20 µL hinzufügen.
- Inkubieren Sie die Proben für 2 h bei 4 ° C mit End-to-End-Rotation.
Hinweis: an dieser Stelle können die Proben für die SDS-PAGE und westliche Beflecken oder Analyse durch Massenspektrometrie vorbereitet werden.
-
Vorbereitung der BiCAP Fließmittel für das westliche Beflecken.
- Zentrifugieren Sie die Perlen bei 300 x g und waschen dreimal in Zelle Lysis Puffer.
- Aufschwemmen der gewaschenen Perlen in 50 µL Puffer entsprechend verdünnten Probe (siehe Tabelle der Materialien) und die Proben bei 95 ° C für ca. 2-3 min erwärmen.
Hinweis: Proben vorbereitet auf diese Weise können für mehrere Monate bei-20 ° C gelagert werden. - Durchführen Sie SDS-PAGE und Western Blot-11 für den Tag V1 und V2 Tags (siehe Tabelle der Materialien), als auch wie jede andere Proteine des Interesses.
-
Vorbereitung der BiCAP Laufmittel für die Massenspektrometrie.
Hinweis: Für die Analyse durch quantitative markierungsfreie Massenspektrometrie (LFQ), empfiehlt es sich die Vorbereitung der Proben in mindestens vierfacher um robuste statistische Aussagekraft zu gewährleisten.- Zentrifugieren Sie die Perlen bei 300 x g und sechsmal unter Zelle Lysis Puffer ohne Reinigungsmittel reinigen. Dies ist notwendig, entfernen das überschüssige Protein und das Waschmittel, das Massenspektrometrie Analyse beeinträchtigen wird. Sofort mit dem nächsten Schritt fortfahren Sie, oder speichern Sie die Perlen bei-80 ° C.
- Trypsinize Perlen in 60 µL Puffer 1 [2 M Harnstoff, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 µg/mL Trypsin]. Lassen Sie die Perlen für 30 min bei 27 ° C in einem Thermomixer bei 800 u/min schütteln zu verdauen.
- Kurz Zentrifugieren Sie Perlen, dann sammeln Sie überstand und Transfer zu Mikrozentrifugenröhrchen (siehe Tabelle der Materialien).
- Waschen Sie die Perlen in 25 µL Puffer 2 [2 M Harnstoff, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM Dithiothreitol], um die gebundenen Proteine zu reduzieren.
- Bündeln Sie die Perlen und überstand in einem Microcentrifuge Schlauch. Lassen Sie die Verdauung über Nacht bei Raumtemperatur erfolgen.
- Alkylat Proben von jeder Probe 20 µL des Iodoacetamide (5 mg/mL Reinstwasser) hinzufügen und in der Dunkelheit für 30 min inkubieren.
- Hemmen Sie Verdauung durch Behandlung von jeder Probe mit 1 µL Trifluoroacetic Säure (TFA). Dieser Schritt wird auch die Proben in Vorbereitung auf die Bühne Trinkgeld Ansäuern.
- Konstrukt C18 Bühne kippt durch Stapeln 6 Schichten von 1 mm Festphasenextraktion C18 (Octadecyl) Membran Festplatten (siehe Tabelle der Materialien) in 200 µL Mikropipette Tipp. Bereiten Sie einen einzigen Tipp für jede Probe.
- Nass die Bühne Tipps mit Methanol und equilibrate mit 50 µL 0,1 % (V/V) Trifluoroacetic Säure (TFA), 80 % (V/V) Acetonitril.
- Waschen Sie die Spitzen mit 50 µL 0,1 % (V/V) TFA.
- Die gesäuerte Peptide auf der Bühne-Tipps zu laden und dann eluieren mit 0,1 % (V/V) TFA, 80 % (V/V) Acetonitril in zwei Schritten.
- Die Proben unter Verwendung eines Vakuum-Konzentrators zu verdampfen.
- Bei Bedarf speichern Sie getrocknete Peptide bei-80 ° C.
4. Massenspektrometrie.
- Aufschwemmen Sie Proben in 15 µL 5 % Ameisensäure, 2 % Acetonitril (in Reinstwasser).
- Laden Sie sorgfältig 6 µL auf ein LC-Platte und Ort in einer NanoLC-HPLC-Anlage (siehe Tabelle der Materialien).
- Packen Sie ein 20 cm, 75 µM Innendurchmesser Spalte mit 1,9 µm C18 stationäre Phase Partikel (siehe Tabelle der Materialien). 5 µL Peptid auf jede Spalte zu laden.
- Eluieren Sie Peptide mit einem linearen Farbverlauf von Acetonitril bei 250 nL/min über 140 min und von Nanoelectrospray in einem linearen Falle Quadropole (LTQ) Hybrid Massenspektrometer gekoppelt an die NanoLC-HPLC-System einführen.
- Tandem-MS-Daten für die Top-10 am häufigsten vorkommenden Ionen pro Scan über einen 140-Minuten-Gradienten zu sammeln. Randomisieren Sie die Reihenfolge der Datenerhebung und den Austausch mit BSA verkehren zwischen jeder Probe, zeitliche Verzerrung zu minimieren.
5. Analyse
- Verarbeiten Sie MS-Rohdaten mit Standardeinstellung innerhalb von MaxQuant Software-Version 1.2.7.4 zu und analysieren Sie MaxQuant über modifizierte Version des Perseus-statistische Analyse-Workflows in der R-Software-Umgebung3ausgegeben.
Hinweis: Die statistische Analyse Workflow ab diesem Zeitpunkt wird in Abbildung 2zusammengefasst. Kurz, LFQ Intensitäten von Proteinen identifiziert, mit MaxQuant verwandelt und gefolgt von Normalisierung und Zurechnung gefiltert. Interagierenden Proteine Dimer Paare sind im Vergleich zu ein Venus-Steuerelement auszuschließende unspezifischen Hintergrund Bindemittel, mit t-Test und Benjamini-Hochberg-Korrektur für multiple Vergleiche des Schülers gekennzeichnet. Die Datenqualität wird durch Vergleiche der einzelnen Histogramme, multiplen Regression und hierarchischen clustering bestätigt.
Abbildung 2: Gliederung der statistischen Analyse-Workflows. Flussdiagramm der statistischen Analyse Pipeline zum Analysieren der LFQ Intensitäten von Proteinen aus rohen Massenspektrometrie Daten verarbeitet, mit MaxQuant identifiziert. Grüne Kisten: Filterung, blauen Kästen: Transformation/Normalisierung/Skalierung, braun Boxen: Daten-Qualitätskontrolle, gelb-Boxen: semi-quantitativen Ausgrenzung/vergleichende Analyse, graue Kästen: Statistische Analyse. Diese Zahl ist neu veröffentlichte FromCroucher Et Al.3 Abdruck mit freundlicher Genehmigung von AAAS. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Representative Results
Nach dem Einsatz von Rekombination Klonen zum Generieren von V1 und V2 tagged Gene of Interest mit BiFC pDEST Plasmide, Co-Transfektion von zwei Plasmide mit Pair interagierenden Proteine führt bei der Erzeugung von ein Fluoreszenzsignal Venus nach ca. 8-24 Stunden. Bei fehlender ein positives Signal ist es möglich, dass die Protein-Interaktion durch die Wahl der Zelllinie nicht auftreten kann, ist eine niedrige Transfection Leistungsfähigkeit oder dass die Ausrichtung der BiFC Tags nicht optimal. Fehlerbehebung für jedes dieser Szenarien wird im folgenden erörtert.
Wir haben zuvor eine positive Wechselwirkung für eine Reihe von verschiedenen Protein-Typen ~ 16 Stunden nach der Co-Transfektion von HEK-293T Zellen beobachtet. Dazu gehören die Dimerisierung von RTK ERBB2 an der Plasmamembran (Abbildung 3A)3 und die Bindung von Ubiquitin E3 Ligase UBR5, tritt überwiegend innerhalb der Kern (Abbildung 3A)12. Die Fähigkeit zu visualisieren, die spezifische subzelluläre Lokalisierung dieser Protein-Protein-Interaktionen, im Gegensatz zu der ganzen Zelle Fluoreszenz des Full-Length Venus Proteins (Abbildung 3A), ist die primäre Funktion der bestehenden BiFC Technik. Aber die wichtigste Neuerung der BiCAP-Technik ist die Fähigkeit, gezielt zu reinigen und charakterisieren diese interagierenden Proteine.
Abbildung 3: BiCAP ermöglicht die Visualisierung und Isolierung von interagierenden Proteine. (A) konfokale Fluoreszenz-Mikroskopie Analyse der das Fluoreszenzsignal produziert durch das Full-Length Venus-Protein, das Zusammenspiel zwischen ERBB2-V1 und ERBB2-V2 und das Zusammenspiel zwischen UBR5-V1 und V2-Ubiquitin nach Transfektion in HEK-293T Zellen. Maßstabsbalken, 10 µm. (B) HEK-293T Zellen wurden mit einer Kontrolle Plasmid mit Full-Length Venus, ERBB2-V1, ERBB2-V2 oder ERBB2-V1 und ERBB2-V2, transfiziert gefolgt von Immunopräzipitation mit der GFP-gemeinnützige und westliche Beflecken mit der angegebenen Antikörper. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Diese spezifische Reinigung gewährten BiCAP-Protokoll kann leicht beobachtet werden, nach der Transfektion von einer Kontrolle Plasmid enthält das Album Venus-Protein, individuelle Plasmide, die Vertreter V1 oder V2 getaggt Proteine enthalten oder die Co-Transfektion von diesen zwei Plasmide (Abb. 3 b). Nach Transfektion von diese Plasmide in HEK-293T Zellen und einer 16 h Inkubation zeigt die Vorbereitung der rohen Lysates für das westliche Beflecken mit V1 und V2 Tag Antikörpern, dass jedes tagged Protein innerhalb der entsprechenden Probe vorhanden ist. Jedoch erkannt folgende Affinitätsreinigung mit der GFP-gemeinnützige, nur das Full-Length Venus Kontrolle Protein und der interagierenden V1 und V2 tagged Proteine innerhalb der Co-Transfektion Probe werden können (Abb. 3 b).
Diese selektive Reinigung der interagierenden Proteine kann durch eine Reihe von nachgelagerten Verfahren verfolgt werden. In unserem jüngsten Veröffentlichung3 verwendet wir die BiCAP-Workflow zur Massenspektrometrie Interaktom RTK ERBB2 als ein Homodimer oder ein Heterodimer mit EGFR und ERBB3 analysieren (Abbildung 4). Indem Sie unsere Daten-Analyse-Pipeline (Abbildung 2) und Visualisierung der Daten anhand Cytoscape13 identifizierten wir unterschiedliche Teilmengen von Proteinen, die interagiert mit allen drei ERBB2-Dimere oder wurden speziell für ein paar Dimere oder einer Einzelperson Dimer. Eine genauere Analyse dieser Interaktion Profile ermöglicht neuartige Adapter Proteinbindung Regulierung Dimer-spezifische Signal Transduction Ereignisse identifizieren, die nicht möglich gewesen wäre mit standard co-Immunopräzipitation Ansätzen.
Abbildung 4: Analyse der Interaktom Vielfalt ERBB2-haltigen Dimere. Die Rezeptor-Köder für BiCAP verwendet werden gezeigt in Orange, die Kerngruppe der 10 Proteine für die Interaktom alle drei Rezeptor Dimere blau dargestellt ist. Üblich, zwei Rezeptor-Dimere interagierenden Proteine werden in grün und an einen Rezeptor in grau dargestellt. Diese Zahl ist neu veröffentlichte FromCroucher Et Al.3 Abdruck mit freundlicher Genehmigung von AAAS. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
BiCAP ist eine leistungsfähige Methode zur Isolierung von spezifischen Proteins Dimere beim Ausschließen der einzelnen Komponenten und ihre konkurrierende verbindliche Partner3. BiCAP basiert auf Anpassung eines Fluoreszenz Protein-Ergänzung Assays BiFC6genannt. Bestehende Methoden, einschließlich BiFC und Nähe Ligatur-Assays, zu visualisieren und zu quantifizieren, Protein-Interaktionen in lebenden Zellen7ausgiebig, aber kein wirksames Mittel zur Isolierung und Charakterisierung der Dimere aus gebildet Diese Interaktionen.
Protein-Ergänzung basierte Affinitätsreinigung, die Techniken haben auch weiterhin entwickeln. Schopp Et Al. beschrieben vor kurzem ein System für Protein Dimer Nähe Kennzeichnung mit BioID14. Durch die Verschmelzung der Split-Fragmente von Biotin-Ligase BirA an zwei interagierenden Proteine, geleitet sie Anreicherung von Ago2 mit Proteinkomplexe MiRNA-vermittelten gen-silencing beteiligt. Split-BioID ergänzt BiCAP darin, dass für die selektive Anreicherung von Proteinen innerhalb Nähe Bereich BioID, wo BiCAP direkte komplexen interagierenden bereichert.
BiCAP-Technik hängt die effiziente Transfektion der BiFC Vektoren. Während wir routinemäßig HEK293T Zellen als eine robuste und leicht zu transfizieren Zelllinie verwenden, kann die Verwendung dieser Zelllinie die Identifizierung potentiell zellspezifische Interaktionspartner ausschließen. Wir empfehlen daher, dass die Wahl der Zell-Linie für jedes Experiment, vor allem für Studien mit einer bestimmten Krankheit Fokus sorgfältig abgewogen werden. Darüber hinaus sollte die Optimierung der Transfektion Bedingungen auch für jede Versuchsanordnung durchgeführt werden. Die Werte des Protokolls stehen im Einklang mit unserer Arbeit auf ERBB2 und waren so kalibriert, dass die Ebenen des endogenen ERBB2 innerhalb brustkrebszelllinien anzugleichen. Es ist ratsam, wenn zu Beginn der Untersuchung einer spezifischen Protein-Protein-Interaktion durchzuführen mehrere Studien mit unterschiedlichen Mengen der beiden Konstrukte um Ausdruck zu erreichen, die Ebenen stehen im Einklang mit den anwesenden in einen physiologischen oder Patho-physiologischen Einstellung.
Ein weiteres wichtiges Element dieses Protokolls ist die richtige Zeit für die Proben geernteten folgende Transfektion zu bestimmen. Während die Bildung von Proteinkomplexen ist in der Regel ein vorübergehender Prozess mit den einzelnen Komponenten kombinieren und Demontage im Laufe der Zeit haben die schnittsicheren Fragmente der Venus eine sehr langsame Dissoziation-Quote, die nicht ihrer Fusion Partner widerspiegeln kann. In der Praxis bedeutet dies, dass ein relativ strenger Zeitrahmen nach Transfektion notwendig ist, um ein realistisches Ergebnis liefern und verhindern die Ansammlung von sehr stark exprimierten Protein-Aggregate. In der Regel, sobald BiFC Fluoreszenz unter dem standard Weitfeld-fluoreszierende Mikroskop (z. B. ~ 16 Stunden für ErbB2-Dimere) zu beobachten ist, Zellen zubereitet werden für die Ernte Lysates oder imaging, obwohl dies möglicherweise für jede bestimmte Köder angepasst werden und Protein zum Opfer.
Unsere aktuelle Publikation demonstriert das Dienstprogramm BiCAP zur Isolierung von RTK Dimere3. Dieser Versuchsaufbau hatte den Vorteil einer bekannten Ausrichtung für die Protein-Interaktion, ermöglicht die direkte Ausrichtung der intrazellulären, C-terminalen Ende jeder Rezeptor-Tags V1 und V2. Die enge Ausrichtung dieser Tags ist notwendig für ihre neu Falten, und bei der Untersuchung von Proteinen Interaktionen ohne eine bekannte Orientierung ist es entscheidend für alle Varianten des N-terminalen und C-terminalen Tag Fusionen zu generieren, um eine Kombination zu identifizieren, die ein positives Signal der BiFC führt. Auch mit der Aufnahme dieser Optimierungsschritt gibt es noch die Möglichkeit eines falsch negativen wenn die Ausrichtung einer spezifischen Protein-Interaktion völlig jede Interaktion zwischen den Tags schließt.
Umgekehrt sollte auch darauf geachtet werden, das Auftreten einer falsch positiven Interaktion zu verhindern. An längere Zeit (> 36 h), wir haben zuvor die Entstehung von unspezifischen Hintergrundfluoreszenz mit einigen Protein Interaktion Paaren beobachtet. Soweit möglich, sollten nicht-wechselwirkenden Kontrollen auch aufgenommen werden, die Spezifität der beobachteten Protein Interaktion zu gewährleisten und einen geeigneten Zeitrahmen für die Analyse nach Transfektion zu informieren.
BiCAP ist eine anpassungsfähige Technik, die auf fast jedes Paar von interagierenden Proteine anwendbar ist. Um das Dienstprogramm dieser Technik zu demonstrieren haben wir Interaktom Daten erzeugt durch den Einsatz von Massenspektrometrie vorgestellt. Die gereinigten komplexe sollte jedoch kompatibel mit jeder gewünschten nachgelagerten Assay. Zum Beispiel, während das BiCAP-Protokoll die Reinigung von interagierenden Proteine ermöglicht, haben es auch genomische Anwendungen durch die nachgeschaltete Verwendung des CHIP-Seq neben Proteomics. Die Anwendung der BiCAP in dieser Umgebung böte steigende Niveaus des Details für DNA-bindende Motive der spezifischen Transkriptionsfaktoren, die ebenfalls stark durch komplexe Dimerisierung Muster geregelt wird.
BiCAP stellt daher eine robuste Adaption von Protein Fragment Komplementierung Assays, ermöglicht es das Verhör von biochemischen und genomische Netzwerke mit erheblich höherer Auflösung. Anpassung und Erweiterung der BiCAP-Technik werden in Zukunft unser Verständnis für die Komplexität und die Plastizität der Signalisierung proteinnetzwerke und ihre fein abgestimmten Rolle bei der Regulierung der Entwicklungs-, physiologische und Krankheitsprozesse erhöhen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben
Acknowledgments
D.R.C ist Krebs Institut NSW Fellow und D.N.S war zuvor Mitglied Cancer Institute New South Wales. Die Forschungsergebnisse präsentiert in dieser Handschrift wurden von Cancer Institute New South Wales (13/FRL/1-02 und 09/CDF/2-39), NHMRC (Project Grant GNT1052963), Science Foundation Ireland (11/SIRG/B2157), New South Wales Office of Science und medizinische Forschung, Gastfamilie finanziert. Gemeinschaft und Mostyn Family Foundation. Empfänger eines australischen Postgraduate Awards waren J.F.H. und R.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LR Clonase II Plus enzyme | Thermo Fisher Scientific | 12538120 | Recombinase enzyme required for Gateway cloning (Step 1) into pDEST BiFC destination vectors |
| Proteinase K, recombinant, PCR grade | Thermo Fisher Scientific | EO0491 | |
| 14 mL round-bottomed polypropylene tube | Corning | 352059 | |
| Ampicillin | Roche Diagnostics Australia | 10835242001 | Stock solution prepared at 100 μg/mL in distilled water. |
| Miniprep kit | Promega Corporation | A1330 | |
| Maxiprep kit | Life Technologies Australia | K2100-07 | |
| DMEM | Gibco | 11995-073 | |
| FBS | Life Technologies Australia | 10099-141 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies Australia | 15070-063 | |
| jetPRIME transfection buffer | Polyplus | 114-15 | |
| jetPRIME transfection reagent | Polyplus | 114-15 | |
| PhosSTOP (Phosphatase inhibitor) | Sigma-Aldrich | 4906837001 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Cell Scraper | Sarstedt | 83.1832 | |
| GFP-Trap_A | Chromotek Gmbh | gta-100 | GFP nanobody coupled to agarose beads |
| N-terminal GFP monoclonal antibody | Covance | MMS-118P | Will detect the V1 tag within the BiFC vectors |
| C-terminal GFP monoclonal antibody | Roche | 11814460001 | Will detect the V2 tag within the BiFC vectors |
| Sample buffer | Invitrogen | NP0008 | Supplemented with 1 mL β-mercaptoethanol. |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega Corporation | V5117h | |
| LoBind microcentrifuge tubes | Point of Care Diagnostics | 0030 108 116 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149-5G | Prepared at 5 mg/mL in ultrapure water |
| Trifluoroacetic Acid - Sequanal Grade | Thermo Fisher | 10628494 | |
| 3M Empore solid phase extraction C18 disks (octadecyl) - 4.7 cm | Thermo Fisher | 14-386-2 | To prepare stage tips, cut 1 mm disks using an appropriately sized hole punch. Alternatively, pre-prepared stage tips can also be purchased, see below. |
| C18 Stage Tips, 10 µL bed | Thermo Fisher | 87782 | |
| Formic acid OPTIMA for LC/MS grade 50mL | Thermo Fisher | FSBA117-50 | |
| 1.9 μm C18 ReproSil particles | Dr. Maisch GmbH | r119.aq. | Stationary phase particles |
| Acetonitrile OPTIMA LC/MS grade | Thermo Fisher | FSBA955-4 | |
| Easy-nLC HPLC | Thermo Fisher | ||
| LTQ Orbitrap Velos Pro | Thermo Fisher | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Non-ionic detergent (100%) |
| DH5α cells | Thermo Fisher | Heat-shock-competent cells |
References
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- Pawson, T., Kofler, M. Kinome signaling through regulated protein-protein interactions in normal and cancer cells. Curr Opin Cell Biol. 21 (2), 147-153 (2009).
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