Summary
Dette manuskriptet beskriver protokollen for resultatet av dette Complementation affinitet rensing (BiCAP). Denne romanen metoden forenkler bestemt isolasjon og nedstrøms proteomic karakteristikk av noen to samspill proteiner, mens unntatt FN-kompleksbundet personlige proteiner som komplekser dannet med konkurrerende bindende partnere.
Abstract
Montering av protein komplekser er en sentral mekanisme underliggende regulering av mange celle signalnettverk trasé. Av biomedisinsk forskning er å tyde hvordan disse dynamiske protein komplekser handle for å integrere signaler fra flere kilder for å lede en bestemt biologiske respons, og hvordan dette blir deregulert i mange sykdom-innstillinger. Til tross for betydningen av denne viktige biokjemiske mekanismen er det mangel på eksprementelle teknikker som kan gjøre den spesifikke og følsom deconvolution av disse multi molekylær signalnettverk komplekser.
Her er dette brist adressert gjennom kombinasjonen av et protein complementation analysen med en conformation-spesifikke nanobody, som vi har kalt resultatet av dette Complementation affinitet rensing (BiCAP). Denne teknikken forenkler bestemt isolasjon og nedstrøms proteomic karakteristikk av noen par samspill proteiner, av FNs-kompleksbundet personlige proteiner og komplekser dannet med konkurrerende bindende partnere.
BiCAP teknikken er tilpasses en rekke nedstrøms eksperimentelle analyser, og høye grad av spesifisitet by av denne teknikken tillater mer nyansert undersøkelser i mekanikken i protein kompleks sammenstilling enn er mulig med standard affinitet rensing teknikker.
Introduction
Protein komplekse samlingen er en viktig prosess opprettholde spatiotemporal spesifisitet av mange signal veier1,2. Mens kritiske natur denne regelverk rolle er anerkjent, er det mangel på eksperimentell teknikker tilgjengelig granske disse kompleksene. De fleste interactomics studier fokusere på samspill med personlige proteiner eller sekvensiell anriking av komplekse enkeltkomponenter. Her presenterer vi en teknikk for isolering av et bestemt protein dimer mens unntatt de personlige moieties av komponenten proteiner samt komplekser dannet med konkurrerende bindende partnere3. Vi har kalt denne teknikken resultatet av dette Complementation affinitet rensing (BiCAP), som er en kombinasjon av en tidligere eksisterende protein fragment complementation analysen, resultatet av dette fluorescens Complementation (BiFC), med romanen bruk av en konformasjon-spesifikke rekombinant nanobody mot GFP og dets derivater (se tabell av materialer).
En typisk protein-fragment complementation analysen er avhengig av uttrykket "agn" og "byttedyr" proteiner smeltet sammen for å dele fragmenter av journalister som luciferase4, β-galactosidase5eller grønne fluorescerende protein (GFP)6 ( Figur 1A). Gjennom samhandling av agn og bytte proteiner, er delt reporter domenene oppmuntret å refold til en funksjonell struktur, slik at samspillet av agnet og byttedyr proteiner visualisert eller kvantifisert. BiCAP var tilpasset fra en versjon av denne teknikken som gjorde bruk av fragmenter av GFP varianten Venus. Fluorescerende protein complementation analyser er en populær metode for å visualisere protein-protein interaksjoner i en levende celle, men inntil nå har vært begrenset til denne funksjon7. BiCAP representerer en betydelig fordel i denne forbindelse, som denne teknikken ikke bare tillater for visualisering, men også isolasjon og avhør av resulterende protein-protein samhandlingen.
Figur 1: strukturelle rektor bak BiCAP teknikken. (A) en skjematisk beskriver viktigste bak resultatet av dette fluorescens complementation viser 'agn' og 'prey' proteiner merket med N-terminal V1 eller C-terminalen V2 fragmenter av full lengde Venus protein. (B) strukturell analyse av samhandling grensesnittet (cyan) mellom GFP nanobody (grønn) og saman Venus, viser plasseringen av V1 (grå) og V2 (oransje) fragmenter (PDB tiltredelse 3OGO). Dette tallet er publiseres fromCroucher et al.3 Reprinted med tillatelse fra AAAS. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
BiCAP teknikken gjør bruk av to ikke-fluorescerende fragmenter av Venus (kalt V1 og V2) som forbinder med en lav grad av affinitet med mindre en samhandling skjer mellom samarbeidspartnerne fusion. I dette tilfellet refold to delt domenene i funksjonelle β fat strukturen av fluorophore (figur 1B)6. Den viktigste nyskapningen av BiCAP kommer fra innføringen av rekombinant GFP nanobody, som gjenkjenner en tredimensjonal epitope på β-fat GFP (og varianter som Venus) som finnes kun på riktig saman og kastet fluorophore ( Figur 1B)8. Avgjørende, det GFP nanobody ikke kan bindes til en av personlige Venus fragmenter. Dette forenkler isolering av protein dimers etter to proteinene har dannet et kompleks av egen vilje, fører til mer representativt resultater enn de fra metoder som gjør bruk av kjemisk indusert, tvungen interaksjoner9.
BiCAP er en kraftfull teknikk som spesielt fokuserer på flere protein kompleksene, som potensielt kan kombineres med en rekke nedstrøms programmer å forbedre detaljnivå av vår forståelse av hvilken rolle disse kompleksene spille i signaltransduksjon . Det omfatter også viktige funksjonen tillater visualisering av protein interaksjoner i situ. Hittil har BiCAP vist som en effektiv metode for å analysere interactome receptor tyrosine kinase (RTK) dimers3, men tilpasningsevne denne metoden betyr at den kan bli vedtatt i nesten alle protein samhandling sammenheng.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. plasmider kloning
Merk: For å generere plasmider vektorer med V1 og V2 kodene del av N-terminus eller C-terminus av genet av interesse,-BiFC destinasjon vektorer har blitt satt med Addgene [N-terminal kode: pDEST-V1-ORF (#73635), pDEST-V2-ORF (#73636). C-terminalen kode: pDEST-ORF-V1 (#73637), pDEST-ORF-V2 (#73638)]. Gene/s rundt må være i bestemte rekombinasjon kloning kompatibel oppføring vektorer (dvs. pDONR223 eller pENTR221), uten stopp kodon, fortsette med kloning. Mange kompatibel kloner er allerede tilgjengelig i ulike plasmider samlinger, inkludert pattedyr genomet samlingen (https://genecollections.nci.nih.gov/MGC/).
- Utføre en rekombinasjon reaksjon for å sette inn genet av interesse mellom attR områder i den aktuelle BiFC destinasjon vektoren:
- I en 0,2 mL tube, legge 150 ng posten vektor, 150 ng BiFC destinasjon vektor og 8 µL TE buffer (pH 8.0).
- Legge til 2 µL recombinase enzym blanding (se Tabell for materiale). Bland godt og sentrifuge kort.
- Inkuber reaksjonen 1t ved romtemperatur eller 16 ° C over natten.
- Stoppe reaksjonen ved å legge 1 µL proteinasen-K løsning og rugende ved 37 ° C i 10 min.
- Transformere varme-sjokk-kompetent celler (se Tabell for materiale) med LR reaksjon produktet:
Merk: Grunnleggende belastning kan tenkes brukes på dette punktet, så lenge den ikke inneholder Ccdb Motgiften, som ville hindre bestemte utvalg av plasmider med innsatsen.- Tine kompetent celler på is og overføre 50 µL av celler i en 14 mL rund bunn polypropylen rør.
- Legg 1 µL av reaksjon produktet til cellene og bland forsiktig. Inkuber etter 20 min på is.
- Varme sjokk i 42 ° C vannbad for 45 s. umiddelbart tilbake til is i 2 minutter.
- Legg 1 mL av LB media og ruge med skjelvende ved 37 ° C i 1 time.
- Plate transformasjon på en 10 cm agar plate inneholder Ampicillin (100 µg/mL) og Inkuber på 37 ° C over natten.
- Rensing av BiFC plasmider.
- For å rense plasmider fra en individuell koloni, legge til 100 mL LB media en stor konisk kolbe og legge Ampicillin (100 µg/mL). Til skjermen flere kolonier, legge til 5 mL av LB media 14 mL rund bunn polypropylen rør og legge Ampicillin (100 µg/mL).
- Bruker en steril inokuleringen sløyfe, plukke en enkelt koloni fra agar plate. Plasser inoculation loopen i LB media og bland kort.
- Dekk toppen av koniske kolbe med aluminiumsfolie og ruge over natten på 37 ° C med skjelvende.
- Produsere transfection klasse plasmider DNA ved hjelp av en standard maxiprep eller midiprep plasmider DNA rensing kit (se Tabell for materiale)10. Vurdere kvaliteten på DNA av absorbansen spectra.
Merk: DNA bør ha en A260/A280 forhold > 1,8 og en A260/A230 forhold > 2.0. På dette punktet, er det anbefalt å skjermen flere individuelle kolonier sjekke for effektiv uttrykk for innsettings- og kode.
2. celle kultur og hva
Merk: For hva av BiFC vektorer er det viktig å oppnå en høy effektivitet, og relativt homogene transfection. Vektorer vil trolig være kompatibel med alle standard transfection reagens og transfection betingelsene skal være optimalisert tilsvarende. For å utføre massespektrometri, kultur vi vanligvis celler i 10 cm retter, selv om dette kan også proporsjonalt skaleres ned til mindre retter eller plater for eksperimenter som krever mindre materialer.
- Frø 1.0 × 106 HEK293T celler i en 10 cm parabol med 10 mL av DMEM media, med 10% FBS og Penicillin/Streptomycin (1: 100).
- Fortynne 2,5 µg av hver BiFC vektor i 500 µL transfection bufferen (se Tabell for materiale) i en 1,5 mL microcentrifuge tube.
- Legge til 10 µL av transfection reagensen (se Tabell for materiale).
- Virvle blandingen for 10 s, så kort sentrifuge. Inkuber i 10 min ved romtemperatur.
- Legg DNA transfection blandingen av platen, dropwise. Inkuber cellene for tilstrekkelig lang tid for BiFC fusion proteiner til å samhandle og Venus folding og fluorophore modning, vanligvis ~ 8-24 h.
Merk: Topp magnetisering for Venus er 515 nm og sine topp utslipp er 528 nm, selv om dette er lett vises ved hjelp av standard fluorescerende mikroskop satt opp til å visualisere GFP fluorescens.
3. eksempel forberedelse
-
Høsting lysates
- Før lysate samling, forberede celle lyseringsbuffer [50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% (v/v) ikke-ioniske vaskemiddel (se Tabell for materiale)]. Butikken på 4 ° C.
- Umiddelbart før høsting, supplere 10 mL av cellen lyseringsbuffer med protease hemmer og fosfatase hemmer (se Tabell for materiale). Holde supplert celle lyseringsbuffer på is.
- Vask celler to ganger i iskalde PBS. Sug opp PBS og tilsett 1 mL av iskalde supplert celle lyseringsbuffer. Plass rett på is, sikre bufferen er spredt over hele overflateområdet.
- Ruge på is ca 5 min, så bruk en celle skraper (se Tabell for materiale) å skrape cellene og overføre til en pre kjølt 1,5 mL microcentrifuge tube.
- Fjerne mobilnettet rusk ved sentrifugering de innsamlede lysate på 18 000 × g i 5 min på 4 ° C og overføre ryddet nedbryting i frisk microcentrifuge rør.
Merk: på dette punktet i lysate kan brukes umiddelbart, eller lagret på-80 ° C. Det anbefales også å holde en aliquot olje lysate slik at effektiviteten av transfection og affinitet rensing kan valideres.
-
Affinitet rensing
Merk: BiCAP isolasjon trinnet utføres med GFP nanobody konjugert til agarose perler (se Tabell for materiale).- Forberede agarose perler ved å vaske et riktig volum (20 µL per prøve) + 10 µL overflødig i 1 mL PBS. Sentrifuge perler på 300 x g og fjerne nedbryting.
- Legge til 20 µL hver lysate prøve.
- Inkuber prøvene for 2t 4 ° c med gjennomgående rotasjon.
Merk: på dette punktet eksemplene kan være forberedt på SDS side og vestlige blotting, eller analyse ved massespektrometri.
-
Utarbeidelse av BiCAP eluant for vestlige blotting.
- Sentrifuge perler på 300 x g og vask tre ganger i cellen lyseringsbuffer.
- Resuspend vasket perlene i 50 µL riktig utvannet eksempel bufferen (se Tabell for materiale) og varme prøvene ved 95 ° C i 2-3 minutter.
Merk: Utvalg forberedt på denne måten kan lagres på 20 ° C i flere måneder. - Utføre SDS side og vestlige blotting11 for både V1 tag og V2 koder (se tabell av materialer), som samt eventuelle andre proteiner av interesse.
-
Utarbeidelse av BiCAP eluant for massespektrometri.
Merk: For analyse av etiketten-fri kvantitative (LFQ)-massespektrometri anbefales å forberede eksemplene i minst quadruplicate for å sikre robust statistisk styrke.- Sentrifuge perler på 300 x g og vask seks ganger i cellen lyseringsbuffer uten vaskemiddel. Dette er nødvendig for å fjerne både overflødig protein og smuss som vil forstyrre massespektrometri analyse. Videre til neste trinn umiddelbart, eller lagre perler ved-80 ° C.
- Trypsinize perler i 60 µL Buffer 1 [2 M urea, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 µg/mL trypsin]. Tillate perler å fordøye i 30 min ved 27 ° C i en thermomixer rister på 800 RPM.
- Kort sentrifuge perler, så samler nedbryting og overføre til microcentrifuge rør (se Tabell for materiale).
- Vaske perlene i 25 µL Buffer 2 [2 M urea, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM dithiothreitol], for å redusere bundet proteiner.
- Basseng perler og nedbryting i en microcentrifuge tube. La fordøyelsen skje over natten i romtemperatur.
- Alkylate prøvene ved å legge til 20 µL av iodoacetamide (5 mg/mL i ultrapure vann) hvert utvalg og ruge i mørket 30 min.
- Hemme fordøyelsen ved å behandle hvert utvalg med 1 µL trifluoroacetic syre (TFA). Dette trinnet vil også surheten eksemplene i forberedelse til scenen tipping.
- Konstruere C18 scenen tips for stabling 6 lag 1 mm solid fase utvinning C18 (Octadecyl) membran disker (se Tabell for materiale) i et 200 µL brønnene tips. Klargjøre et enkelt tips for hvert utvalg.
- Våt scenen tips med metanol, og equilibrate med 50 µL 0,1% (v/v) trifluoroacetic syre (TFA), 80% (v/v) acetonitrile.
- Vask tips med 50 µL 0,1% (v/v) TFA.
- Last sur peptidene på scenen tips og deretter elute bruker 0,1% (v/v) TFA, 80% (v/v) acetonitrile i to trinn.
- Fordampe eksemplene bruker en vakuum konsentrator.
- Eventuelt lagre tørket peptider på-80 ° C.
4. massespektrometri.
- Resuspend prøver i 15 µL av 5% maursyre, 2% acetonitrile (i ultrapure vann).
- Nøye laste 6 µL på en LC plate og sted i en nanoLC HPLC systemet (se Tabellen for materiale).
- Pack en 20 cm, 75 µM indre diameter kolonne med 1,9 µm C18 stasjonære fase partikler (se Tabell for materiale). Laste 5 µL peptid på hver kolonne.
- Elute peptider bruker en lineær gradient acetonitrile på 250 nL/min over 140 min og innføre av nanoelectrospray i en lineær felle Quadropole (LTQ) hybrid masse spectrometer kombinert nanoLC HPLC systemet.
- Samle sammen MS data for de topp 10 mest tallrike ionene per søk over 140-minutters tid gradering. Tilfeldig rekkefølgen av datainnsamling og utveksling med BSA kjøre mellom hver prøve å minimere verdslige skjevhet.
5. analyse
- Behandle MS-rådata som bruker standardinnstillingen i MaxQuant programvareversjon 1.2.7.4 og analysere MaxQuant tilkobling med modifisert versjon av Perseus statistisk analyse arbeidsflyten i R programvare miljø3.
Merk: Statistisk analyse arbeidsflyten fra dette punktet summeres i figur 2. Kort, LFQ innhold av proteiner identifisert ved hjelp av MaxQuant er forvandlet og filtrert etterfulgt av datanormalisering og fradrag. Samspill proteiner av dimer identifiseres sammenliknet med en Venus kontroll, utelate uspesifikke bakgrunn bindemidler, med Student t-test og Benjamini-Hochberg korreksjon for flere sammenligninger. Datakvaliteten er bekreftet av sammenligninger av individuelle histogrammer, multippel regresjon og hierarkisk klynger.
Figur 2: omrisset av statistisk analyse arbeidsflyten. Sekvensdiagram for statistisk analyse rørledning brukes til å analysere LFQ intensiteten av proteiner identifisert fra rå massespektrometri data behandles ved hjelp av MaxQuant. Grønne bokser: filtrering, boksene: transformasjon/normalisere/skalering, brun boksene: data kvalitetskontroll, gule bokser: semi kvantitative utelukkelse/komparativ analyse, grå bokser: statistisk analyse. Dette tallet er publiseres fromCroucher et al.3 Reprinted med tillatelse fra AAAS. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved å bruke rekombinasjon måte å generere V1 og V2 merket gener rundt med BiFC pDEST plasmider, co transfection av to plasmider inneholder et samspill par proteiner vil medføre generering av en Venus fluorescerende signal etter ca 8-24 timer. I fravær av et positivt signal er det mulig at protein samspillet ikke kan ha oppstått på grunn av valg av cellen linje, en lav transfection effektivitet eller at retningen BiFC koder er ikke optimal. Feilsøking for hver av disse scenariene er omtalt nedenfor.
Vi har tidligere observert en positiv samhandling for en rekke forskjellige protein typer ~ 16 timer etter den co transfection HEK-293T celler. Dette inkluderer dimerisation av RTK ERBB2 på plasma membran (figur 3A)3 og binding av Ubiquitin til E3 ligase UBR5, forekommer hovedsakelig i kjernen (figur 3A)12. Muligheten for å visualisere den spesifikke sub mobilnettet lokaliseringen av disse protein-protein interaksjoner, i motsetning til hele celle fluorescens av full lengde Venus protein (figur 3A), er den primære funksjonen av den eksisterende BiFC-teknikken. Men den viktigste innovasjonen av BiCAP teknikken er spesielt rense og karakterisere disse samspill proteiner.
Figur 3: BiCAP lar visualisering og isolering av samspill proteiner. (A) AC Confocal fluorescens mikroskopi analyse av fluorescerende produsert av full lengde Venus protein, samspillet mellom ERBB2-V1 og ERBB2-V2 og samspillet mellom V1-UBR5 og V2-Ubiquitin etter hva inn HEK-293T celler. Skala barer, 10 µm. (B) HEK-293T celler ble transfekterte med en kontroll plasmider med full lengde Venus, ERBB2-V1, ERBB2-V2 eller både ERBB2-V1 og ERBB2-V2, etterfulgt av immunoprecipitation med GFP nanobody og vestlige blotting med angitt antistoffer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Dette bestemte rensing by av BiCAP protokollen kan være lett observert etter transfection av en kontroll plasmider med full lengde Venus protein, personlige plasmider inneholder representant V1 og V2 merket proteiner eller co transfection av disse to plasmider (figur 3B). Etter hva av disse plasmider i HEK-293T celler, og en 16 h inkubering viser utarbeidelse av råolje lysates for vestlige blotting med V1 og V2 tag antistoffer at hver merket protein er til stede i riktig prøven. Imidlertid oppdaget følgende affinitet rensing med GFP nanobody, bare full-lengde Venus kontroll protein og samspill V1 og V2 merket proteiner i co transfection prøven kan være (figur 3B).
Denne selektiv rensing av samspill proteiner kan bli etterfulgt av en rekke nedstrøms teknikker. I vår siste publikasjon3 benyttet vi BiCAP arbeidsflyten utfører massespektrometri interactome analyse av RTK ERBB2 som en homodimer eller en heterodimer med EGFR og ERBB3 (Figur 4). Ved å følge våre data analyse rørledning (figur 2) og visualisere dataene med Cytoscape13 identifisert vi forskjellige undergrupper av proteiner som enten interaksjon med alle tre ERBB2 dimers, eller var spesifikke for et par dimers, eller en person dimer. Nærmere analyse av fotgjengere samhandling tillatt oss å identifisere romanen mønstre adapter protein bindingen regulere dimer-spesifikke signal signaltransduksjon hendelser, som ikke ville ha vært mulig å bruke standard co-immunoprecipitation tilnærminger.
Figur 4: analyse av interactome mangfoldet av ERBB2 inneholder dimers. Den reseptor agn brukes for BiCAP vises i oransje, kjernegruppen av 10 proteiner felles for interactome av alle tre reseptor dimers vises i blått. Samspill proteiner felles for to reseptor dimers vises i grønt og en reseptor i grått. Dette tallet er publiseres fromCroucher et al.3 Reprinted med tillatelse fra AAAS. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
BiCAP er en kraftfull metode for å isolere bestemte protein dimers mens utenom de enkelte komponentene og deres konkurrerende bindende partnere3. BiCAP er basert på tilpasning av en fluorescens protein complementation analysen kalt BiFC6. Eksisterende metoder, inkludert BiFC og nærhet ligation analyser, har vært mye brukt til å visualisere og kvantifisere protein interaksjoner i lever celler7, men gi ikke en effektiv måte å isolere og karakterisere dimers dannet fra disse interaksjoner.
Protein complementation basert affinitet rensing teknikker har også fortsatt å utvikle seg. Schopp et al. nylig beskrevet et system for protein dimer nærhet merking bruk BioID14. Kombinerer delt fragmenter av biotin ligase BirA to samspill proteiner, rettet de anriking av Ago2 inneholder protein komplekser involvert i demping miRNA-mediert genet. Split-BioID utfyller BiCAP i muliggjør selektiv anriking av proteiner i nærheten utvalg av BioID, der BiCAP beriker direkte komplekse interaktører.
Den BiCAP teknikken avhenger det effektiv transfection av BiFC vektorer. Mens vi rutinemessig bruker HEK293T celler som en robust og lett-å-transfect celle linje, kan bruk av denne cellen linjen utelukke identifikasjon av potensielt celle-spesifikke samhandling partnere. Vi anbefaler derfor at valg av cellen linje nøye vurderes for hvert eksperiment, særlig for studier med bestemt sykdom fokus. I tillegg bør optimalisering av hva også utføres for hver eksperimentelle oppsett. Verdiene i protokollen er justert med vårt arbeid på ERBB2 og ble kalibrert for å omtrentlige nivåer av endogen ERBB2 innenfor brystet kreftcelle linjer. Det er fornuftig, når begynner etterforskningen av en bestemt protein-protein interaksjon, utføre flere forsøk med varierende mengder både konstruksjoner for å oppnå uttrykk nivåer som er i samsvar med de som finnes i en fysiologisk eller patho-fysiologiske innstilling.
Et annet viktig element i denne protokollen er å avgjøre riktig tid for prøvene skal høstes følgende transfection. Mens dannelsen av protein komplekser er vanligvis en forbigående prosess, med de enkelte komponentene kombinere og demontere over tid, har refolded Venus fragmenter en veldig treg dissosiasjon som ikke gjenspeiler det til samarbeidspartnerne fusion. I praksis betyr dette at en rimelig strenge tidsramme etter hva er nødvendig å gi et realistisk resultat og hindre akkumulering av høyt over uttrykt protein aggregat. Vanligvis når BiFC fluorescens er under standard wide-field fluorescerende mikroskop (f.eks ~ 16 timer for ErbB2 dimers), celler kan tilberedes for høsting lysates eller bildebehandling, selv om dette kanskje må justeres for hver bestemt agn og byttedyr protein.
Våre siste publikasjon vist nytten av BiCAP for å isolere RTK dimers3. Eksperimentell installasjonen hadde fordelen av en kjent retning for protein samhandling, tillater direkte justeringen V1 og V2 koder på intracellulær, C-terminalen slutten av hver reseptor. Lukk justeringen av disse kodene er nødvendig for deres å sammenleggbar og når undersøke proteiner interaksjoner uten en kjent orientering er det avgjørende å generere alle varianter av N-Terminus og C-terminalen tag fusjoner for å identifisere en kombinasjon som vil resultere i et positivt BiFC signal. Selv med inkludering av denne optimalisering trinn er det fortsatt muligheten for en falsk negativt om justering av en bestemt protein interaksjon helt utelukker noen interaksjon mellom kodene.
Derimot bør omsorg også tas å forhindre forekomsten av en falsk positiv vekselvirkningen. På lengre tidspunkt (> 36 h), vi har tidligere observert fremveksten av ikke-spesifikke bakgrunnen fluorescens med noen protein samhandling par. Der det er mulig skal også ikke-samspill kontroller inkluderes å sikre spesifisiteten av observerte protein samspillet og informere et passende tidsrom for analyse etter hva.
BiCAP er et svært tilpasningsdyktig teknikk som gjelder for nesten alle par samspill proteiner. Å demonstrere nytten av denne teknikken vi har presentert interactome data som er generert gjennom bruk av massespektrometri. Renset komplekser bør imidlertid være forenlig med en ønsket nedstrøms analysen. For eksempel, mens BiCAP protokollen lar rensing av samspill proteiner, kan det også ha genomisk programmer gjennom nedstrøms bruken av CHIP-seq sammen med Proteomikk. Bruk av BiCAP i denne innstillingen vil gi økende detaljnivåer for DNA bindende motiver av bestemte transkripsjonsfaktorer, som er også sterkt regulert gjennom komplekse dimerisation mønstre.
BiCAP representerer derfor en robust tilpasning av protein fragment complementation analyser, som gjør avhør av biokjemiske og genomisk nettverk med kraftig økt oppløsning. I fremtiden, vil tilpasning og utvidelse av BiCAP teknikken øke vår forståelse av kompleksiteten og plastisitet av protein signalnettverk nettverk og deres finstemt rolle i regulering av utviklingsmessige, fysiologiske og sykdom prosesser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre
Acknowledgments
D.R.C er medlem Cancer Institute NSW D.N.S var tidligere medlem Cancer Institute NSW. Undersøkelsen presenteres i dette manuskriptet ble finansiert av Cancer Institute NSW (13/FRL/1-02 og 09/CDF/2-39), NHMRC (Project Grant GNT1052963), Science Foundation Irland (11/SIRG/B2157), NSW Office of Science og medisinsk forskning, gjest familie Fellesskap og Mostyn Family Foundation. J.F.H. og R.S. var mottakere av en australsk Postgraduate Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LR Clonase II Plus enzyme | Thermo Fisher Scientific | 12538120 | Recombinase enzyme required for Gateway cloning (Step 1) into pDEST BiFC destination vectors |
| Proteinase K, recombinant, PCR grade | Thermo Fisher Scientific | EO0491 | |
| 14 mL round-bottomed polypropylene tube | Corning | 352059 | |
| Ampicillin | Roche Diagnostics Australia | 10835242001 | Stock solution prepared at 100 μg/mL in distilled water. |
| Miniprep kit | Promega Corporation | A1330 | |
| Maxiprep kit | Life Technologies Australia | K2100-07 | |
| DMEM | Gibco | 11995-073 | |
| FBS | Life Technologies Australia | 10099-141 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies Australia | 15070-063 | |
| jetPRIME transfection buffer | Polyplus | 114-15 | |
| jetPRIME transfection reagent | Polyplus | 114-15 | |
| PhosSTOP (Phosphatase inhibitor) | Sigma-Aldrich | 4906837001 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Cell Scraper | Sarstedt | 83.1832 | |
| GFP-Trap_A | Chromotek Gmbh | gta-100 | GFP nanobody coupled to agarose beads |
| N-terminal GFP monoclonal antibody | Covance | MMS-118P | Will detect the V1 tag within the BiFC vectors |
| C-terminal GFP monoclonal antibody | Roche | 11814460001 | Will detect the V2 tag within the BiFC vectors |
| Sample buffer | Invitrogen | NP0008 | Supplemented with 1 mL β-mercaptoethanol. |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega Corporation | V5117h | |
| LoBind microcentrifuge tubes | Point of Care Diagnostics | 0030 108 116 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149-5G | Prepared at 5 mg/mL in ultrapure water |
| Trifluoroacetic Acid - Sequanal Grade | Thermo Fisher | 10628494 | |
| 3M Empore solid phase extraction C18 disks (octadecyl) - 4.7 cm | Thermo Fisher | 14-386-2 | To prepare stage tips, cut 1 mm disks using an appropriately sized hole punch. Alternatively, pre-prepared stage tips can also be purchased, see below. |
| C18 Stage Tips, 10 µL bed | Thermo Fisher | 87782 | |
| Formic acid OPTIMA for LC/MS grade 50mL | Thermo Fisher | FSBA117-50 | |
| 1.9 μm C18 ReproSil particles | Dr. Maisch GmbH | r119.aq. | Stationary phase particles |
| Acetonitrile OPTIMA LC/MS grade | Thermo Fisher | FSBA955-4 | |
| Easy-nLC HPLC | Thermo Fisher | ||
| LTQ Orbitrap Velos Pro | Thermo Fisher | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Non-ionic detergent (100%) |
| DH5α cells | Thermo Fisher | Heat-shock-competent cells |
References
- Kolch, W., Pitt, A. Functional proteomics to dissect tyrosine kinase signalling pathways in cancer. Nat Rev Cancer. 10 (9), 618-629 (2010).
- Pawson, T., Kofler, M. Kinome signaling through regulated protein-protein interactions in normal and cancer cells. Curr Opin Cell Biol. 21 (2), 147-153 (2009).
- Croucher, D. R., et al. Bimolecular complementation affinity purification (BiCAP) reveals dimer-specific protein interactions for ERBB2 dimers. Sci Signal. 9 (436), ra69 (2016).
- Cassonnet, P., et al. Benchmarking a luciferase complementation assay for detecting protein complexes. Nat Methods. 8 (12), 990-992 (2011).
- Rossi, F., Charlton, C. A., Blau, H. M. Monitoring protein-protein interactions in intact eukaryotic cells by beta-galactosidase complementation. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (16), 8405-8410 (1997).
- Magliery, T. J., et al. Detecting protein-protein interactions with a green fluorescent protein fragment reassembly trap: scope and mechanism. J Am Chem Soc. 127 (1), 146-157 (2005).
- Hu, C. D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nat Biotechnol. 21 (5), 539-545 (2003).
- Kubala, M. H., Kovtun, O., Alexandrov, K., Collins, B. M. Structural and thermodynamic analysis of the GFP:GFP-nanobody complex. Protein Sci. 19 (12), 2389-2401 (2010).
- Fegan, A., White, B., Carlson, J. C., Wagner, C. R. Chemically controlled protein assembly: techniques and applications. Chem Rev. 110 (6), 3315-3336 (2010).
- JoVE Science Education Database. Basic methods in cellular and molecular biology. plasmid purification. J Vis Exp. , (2017).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. J Vis Exp. (44), (2010).
- Shearer, R. F., et al. The E3 ubiquitin ligase UBR5 regulates centriolar satellite stability and primary cilia formation via ubiquitylation of CSPP-L. Mol Biol Cell. , (2018).
- Shannon, P., et al. Cytoscape: A software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Res. 13 (11), 2498-2504 (2003).
- Schopp, I. M., et al. Split-BioID a conditional proteomics approach to monitor the composition of spatiotemporally defined protein complexes. Nat Commun. 8, 15690 (2017).
