Summary
Detta manuskript beskriver protokollet för Bimolecular komplettering affinitet rening (BiCAP). Denna nya metod underlättar specifika isolering och nedströms proteomiska karakterisering av några två samverkande proteiner, medan exklusive FN-komplex enskilda proteiner samt komplex bildas med konkurrerande bindande partner.
Abstract
Montering av proteinkomplex är en central mekanism som ligger bakom regleringen av många cell signalering vägar. Ett stort fokus på biomedicinsk forskning dechiffrera hur dessa dynamiska proteinkomplex agera för att integrera signaler från flera källor för att rikta en specifik biologisk reaktion, och hur detta blir avregleras i många sjukdomar inställningar. Trots betydelsen av denna viktiga biokemiska mekanism finns det en brist på experimentella metoder som kan underlätta den specifika och känsliga deconvolution av dessa multi molekylär signalering komplex.
Här åtgärdas denna brist genom kombinationen av en protein komplettering analysen med en konformation-specifika nanobody, som vi har kallat Bimolecular komplettering affinitet rening (BiCAP). Denna nya teknik underlättar specifika isolering och nedströms proteomiska karakterisering av alla par av samverkande proteiner, med uteslutande av FN-komplex enskilda proteiner och komplex som bildas med konkurrerande bindande partner.
Den BiCAP tekniken är anpassningsbar till ett brett utbud av nedströms experimentella analyser, och den höga graden av specificitet som ges genom denna teknik tillåter mer nyanserad utredningar av mekaniken i protein komplex sammansättning än för närvarande använder standard affinitet rening tekniker.
Introduction
Protein komplex sammansättning är en viktig process för att upprätthålla många signalering vägar1,2spatiotemporal specificitet. Medan kritiska arten av denna reglerande roll är allmänt erkänd, finns det en brist på experimentella tekniker tillgängliga att granska dessa komplex. De flesta interactomics studier fokuserar på interaktioner med enskilda proteiner eller sekventiella anrikningen av enskilda komplexa komponenter. Här presenterar vi en teknik för isolering av ett specifikt protein dimer medan exklusive de enskilda delarna av den komponenten proteiner samt komplex bildade med konkurrerande bindande partner3. Vi har kallat denna teknik Bimolecular komplettering affinitet rening (BiCAP), eftersom det är en kombination av en tidigare existerande protein fragment komplettering analys, Bimolecular fluorescens komplettering (BiFC), med ny användning av en exteriör-specifika rekombinant nanobody mot GFP och dess derivat (se tabellen för material).
En typisk protein-fragment komplettering analysen bygger på uttrycket av ”bete” och ”offer” proteiner smält för att dela upp fragment av reportrar som luciferas4, β-galaktosidas5eller grönt fluorescerande protein (GFP)6 ( Figur 1A). Genom samverkan mellan bete och byte proteinerna uppmuntras split reporter domäner refold till en funktionell struktur, vilket gör att samspelet mellan betet och bytesdjur proteiner som ska visualiseras eller kvantifieras. BiCAP var anpassad från en version av denna teknik som gjord använda av fragment av GFP varianten Venus. Fluorescerande protein komplettering analyser är en populär metod för att visualisera protein-protein interaktioner i en levande cell, men hittills har begränsats till detta en funktion7. BiCAP utgör ett betydande framsteg i detta avseende, eftersom denna teknik inte bara möjliggör visualisering, men också isolering och förhör av den resulterande protein-protein interaktionen.
Figur 1: den strukturella viktigaste bakom tekniken som BiCAP. (A) en schematisk disposition huvudmannen bakom bimolecular fluorescens komplettering visar 'bete' och 'offer' proteinerna taggade med N-terminala V1 eller C-terminal V2 fragment av proteinet fullängds Venus. (B) strukturell analys av interaktion gränssnittet (cyan) mellan GFP nanobody (grön) och rekombinerat Venus, visar positionen för V1 (grå) och V2 (orange) fragment (PDB anslutning 3OGO). Denna siffra är ompublicerade fromCroucher et al.3 Reprinted med tillstånd från AAAS. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Den BiCAP teknik gör användningen av två icke-fluorescerande fragment av Venus (heter V1 och V2) som associeras med en låg grad av samhörighet såvida inte en interaktion sker mellan deras fusion partners. I detta fall refold de två delade domänerna i funktionella β-fat strukturen av fluorophore (figur 1B)6. Den viktigaste nyheten i BiCAP kommer från införandet av den rekombinanta GFP-nanobody, som erkänner en tredimensionell epitop på β-fat av god Jordbrukarsed (och varianter såsom Venus) som finns endast på korrekt rekombinerat och vikta fluorophore ( Figur 1B)8. Avgörande, binder den GFP nanobody inte till antingen enskilda Venus fragment. Detta underlättar isolering av protein dimerer först efter de två proteinerna har bildat ett komplex av egen vilja, vilket leder till mer representativt resultat än sådana som förvärvats från metoder som gör användningen av kemiskt inducerad, Tvingad interaktioner9.
BiCAP är en kraftfull teknik som specifikt fokuserar på flera proteinkomplex, som potentiellt kan kombineras med ett antal efterföljande program för att förbättra precisionen av vår förståelse av dessa komplex roll i Signaltransduktion . Det omfattar också den viktiga funktionen att låta visualisering av protein interaktioner i situ. Hittills har BiCAP har visats som en effektiv metod för att analysera interactome receptor tyrosine kinase (RTK) dimerer3, men anpassningsförmåga i denna metod innebär att den kan antas i nästan alla sammanhang med protein i interaktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. plasmid kloning
Obs: För att generera plasmid vektorer med V1 eller V2 Taggar smält till N-terminalen eller C-terminus av genen av intresse, BiFC destination vektorer har deponerats med Addgene [N-terminala tag: pDEST-V1-ORF (#73635), pDEST-V2-ORF (#73636). C-terminal tag: pDEST-ORF-V1 (#73637), pDEST-ORF-V2 (#73638)]. Den genen/s av intresse kommer att behöva vara i specifika rekombination kloning kompatibel posten vektorer (dvs pDONR223 eller pENTR221), utan stop kodon, att gå vidare med kloning. Många kompatibla kloner finns redan tillgängliga inom olika plasmid samlingar, inklusive däggdjur genomet insamling (https://genecollections.nci.nih.gov/MGC/).
- Utföra en rekombination reaktion om du vill infoga gen av intresse mellan attR platser av lämpliga BiFC destination vektor:
- I en 0,2 mL tub, lägga till 150 ng post vektor, 150 ng BiFC destination vektor och 8 µL TE buffert (pH 8,0).
- Lägg till 2 µL recombinase enzym mix (se Tabell för material). Blanda väl och centrifugera kort.
- Inkubera reaktionen för 1 h i rumstemperatur eller vid 16 ° C över natten.
- Stoppa reaktionen genom att lägga till 1 µL proteinas-K lösning och inkubation vid 37 ° C i 10 min.
- Omvandla värme-chock-kompetenta celler (se Tabell för material) med LR reaktionsprodukten:
Obs: Någon grundläggande stam kan tänkas användas vid denna punkt, så länge det inte innehåller den Ccdb antitoxin, som skulle förhindra specifika urval av plasmider som innehåller skäret.- Tina behöriga celler på is och överför 50 µL av celler till en 14 mL-rundbottnad polypropylen rör.
- Tillsätt 1 µL reaktionsprodukt i cellerna och blanda försiktigt. Inkubera i 20 min på is.
- Värme chock i 42 ° C vattenbad för 45 s. omedelbart återvändande till is i 2 min.
- Tillsätt 1 mL LB media och Inkubera under skakning vid 37 ° C i 1 h.
- Tavla omvandlingen på 10 cm agar plåt innehållande Ampicillin (100 µg/mL) och inkubera vid 37 ° C under natten.
- Rening av BiFC plasmid.
- För att rena plasmid från en enskild koloni, tillsätt 100 mL LB media till en stor kolv och Ampicillin (100 µg/mL). Skärm flera kolonier, tillsätt 5 mL LB media till 14 mL rundkolv polypropylene rören och Ampicillin (100 µg/mL).
- Med hjälp av en steril inympning loop, plocka en enda koloni från en agarplatta. Placera ramantennen på inympningen i LB media och blanda kort.
- Täck toppen av kolven med aluminiumfolie och inkubera över natten vid 37 ° C under skakning.
- Producera transfection grade plasmid DNA med en standard maxiprep eller midiprep plasmid DNA rening kit (se Tabell för material)10. Bedöma kvaliteten på DNA av absorbansen spectra.
Obs: DNA bör ha ett A260/A280-förhållande > 1.8 och ett A260/A230-förhållande > 2.0. Vid denna punkt, rekommenderas det att skärmen flera enskilda kolonier att kontrollera för effektiv uttryck samt tagg.
2. cell kultur och Transfection
Obs: För transfection BiFC vektorer är det viktigt att uppnå en hög effektivitet och relativt homogen transfection. Vektorerna kommer sannolikt att vara kompatibel med någon standard transfection reagens och transfection villkoren bör optimeras med detta. För att utföra masspektrometri, kultur vi vanligtvis celler inom 10 cm rätter, även om detta kan också vara proportionellt skalas till mindre rätter eller plattor för experiment som kräver mindre material.
- Utsäde 1,0 × 106 HEK293T celler i en 10 cm skålen med 10 mL DMEM media, kompletteras med 10% FBS och Penicillin/Streptomycin (1: 100).
- Späd 2,5 µg varje BiFC vektor till 500 µL av transfection buffert (se Tabell för material) i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör.
- Tillsätt 10 µL transfection reagens (se Tabell för material).
- Vortex blandning för 10 s, sedan kort centrifug. Inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Lägga till DNA transfection blandningen till plattan, droppvis. Inkubera cellerna för en tillräckligt lång tid för BiFC fusionsproteinerna att interagera och Venus vikning och fluorophore mognad, allmänt ~ 8-24 h.
Obs: Peak magnetiseringen för Venus är 515 nm och dess topp utsläpp är 528 nm, även om detta är lätt ses med standard fluorescerande Mikroskop ställa in att visualisera GFP fluorescens.
3. provberedning
-
Skörd lysates
- Före lysate samlingen, förbereda Cell lyseringsbuffert [50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% (v/v) icke-joniskt rengöringsmedel (se Tabell för material)]. Förvaras vid 4 ° C.
- Omedelbart före skörd, komplettera 10 mL lyseringsbuffert Cell med proteashämmare och fosfatas-hämmare (se Tabell för material). Hålla kompletterade Cell lyseringsbuffert på is.
- Tvätta cellerna två gånger i iskall PBS. Aspirera PBS och tillsätt 1 mL iskallt kompletterade Cell lyseringsbuffert. Placera skålen på isen, att säkerställa bufferten är spridda över hela ytan.
- Inkubera på is under cirka 5 minuter, sedan använda en cell-skrapa (se Tabell för material) för att skrapa cellerna och överföra till ett pre kylda 1,5 mL mikrocentrifug rör.
- Ta bort cellulära skräp genom centrifugering den insamlade lysate på 18.000 × g i 5 minuter vid 4 ° C och överföring avmarkerad supernatanten i färska mikrocentrifugrör.
Obs: på denna punkt den lysate kan användas omedelbart eller förvaras vid-80 ° C. Det rekommenderas också att hålla en alikvot av råolja lysate så att effektiviteten i transfection och affinitet rening kan valideras.
-
Affinitet rening
Obs: Det BiCAP isolering steget utförs med hjälp av GFP nanobody konjugerat till agaros pärlor (se Tabell för material).- Förbereda agaros pärlorna genom att tvätta en lämplig volym (20 µL per prov) + 10 µL överskott i 1 mL PBS. Centrifugera pärlorna på 300 x g och avlägsna supernatanten.
- Tillsätt 20 µL till varje lysate prov.
- Inkubera proverna för 2 h vid 4 ° C med end-to-end rotation.
Obs: vid denna punkt proverna kan förberedas för SDS-PAGE och western blotting eller analys av masspektrometri.
-
Beredning av BiCAP eluant för western blotting.
- Centrifugera pärlorna på 300 x g och tvätta tre gånger i Cell lyseringsbuffert.
- Återsuspendera tvättade pärlorna i 50 µL av lämpligt utspädda provet buffert (se Tabell av material) och värma proverna vid 95 ° C i 2-3 min.
Obs: Prover beredd på detta sätt kan förvaras vid-20 ° C under flera månader. - Utföra SDS-PAGE och western blotting11 för både V1 tagg och V2 Taggar (se tabell material), som väl som alla andra proteiner av intresse.
-
Beredning av BiCAP eluant för masspektrometri.
Obs: För analys av etikett-fri kvantitativa (LFQ) masspektrometri rekommenderas att bereda proverna i minst quadruplicate för att säkerställa robust statistisk power.- Centrifugera pärlorna på 300 x g och tvätta sex gånger i Cell lyseringsbuffert utan rengöringsmedel. Detta är nödvändigt att ta bort både det överflödigt proteinet och också tvättmedel som kommer att störa masspektrometri analys. Omedelbart gå vidare till nästa steg, eller förvara pärlorna vid-80 ° C.
- Trypsinize pärlor i 60 µL buffert 1 [2 M urea, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 µg/mL trypsin]. Låt pärlorna att smälta för 30 min vid 27 ° C i en thermomixer skakar vid 800 RPM.
- Kort Centrifugera pärlor och sedan samla in supernatanten och överföring till mikrocentrifugrör (se Tabell för material).
- Tvätta pärlorna i 25 µL buffert 2 [2 M urea, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM Ditiotreitol], för att minska de bundna proteinerna.
- Samla pärlor och supernatanten i en mikrocentrifug rör. Låt matsmältningen uppstå över natten i rumstemperatur.
- Alkylatbensin proverna genom att lägga 20 µL av iodoacetamide (5 mg/mL i ultrarent vatten) till varje prov och inkubera i mörkret i 30 min.
- Hämma matsmältningen genom att behandla varje prov med 1 µL trifluorättiksyra (TFA). Detta steg kommer också syrsätt proverna i förberedelse för scenen tippning.
- Konstruera C18 scenen tips av stapling 6 lager av 1 mm fasta fasen extraktion C18 (oktadecyl) membran diskar (se Tabell för material) till en 200 µL mikropipett spets. Förbereda ett enda tips för varje prov.
- Våt scenen tips med metanol, och låt jämvikta med 50 µL 0,1% (v/v) trifluorättiksyra (TFA), 80% (v/v) acetonitril.
- Tvätta tips med 50 µL 0,1% (v/v) TFA.
- Ladda de försurade peptiderna på scenen tips och sedan eluera med 0,1% (v/v) TFA, 80% (v/v) acetonitril i två steg.
- Avdunsta proverna med en vakuum koncentrator.
- Om det behövs, förvara torkade peptider vid-80 ° C.
4. masspektrometri.
- Återsuspendera prover i 15 µL 5% myrsyra, 2% acetonitril (i ultrarent vatten).
- Noggrant läsa in 6 µL på en LC plattan och plats i ett nanoLC HPLC system (se Tabell för material).
- Packa en 20 cm, 75 µM innerdiameter kolumn med 1,9 µm C18 stationära fasen partiklar (se Tabell för material). Ladda 5 µL peptid på varje kolumn.
- Eluera peptider med hjälp av en linjär övertoning acetonitril 250 nL/min över 140 min och införa av nanoelectrospray i en linjär fällan Quadropole (LTQ) hybrid masspektrometer kopplad till nanoLC HPLC systemet.
- Samla in tandem MS data för de topp 10 mest förekommande jonerna per skanning över 140 minuters tid toning. Randomize ordningen för datainsamling och utbyte med BSA kör mellan varje prov att minimera temporal bias.
5. analys
- Bearbeta raw MS-data använder standardinställningen inom MaxQuant programvaruversion 1.2.7.4 och analysera MaxQuant utgång med modifierad version av arbetsflödet Perseus statistisk analys i R programvara miljö3.
Obs: Statistisk analys arbetsflödet från denna punkt sammanfattas i figur 2. LFQ intensiteter av proteiner som identifieras med hjälp av MaxQuant är kort, omvandlas och filtreras följt av normalisering och imputering. Samverkande proteiner av dimer par identifieras genom jämförelse med en Venus kontroll, att utesluta ospecifik bakgrund pärmar, med Student's t-test och Benjamini-Hochberg korrigering för multipla jämförelser. Datakvalitet bekräftas av jämförelser av enskilda histogrammen, multipel regression och hierarkisk klustring.
Figur 2: Skissera av statistisk analys arbetsflödet. Flödesdiagram för statistisk analys pipeline används för att analysera proteiner identifierats från raw masspektrometri data bearbetas med MaxQuant LFQ stödnivåerna. Gröna rutor: filtrering, Blå rutor: omvandling/normalisera/skalning, bruna lådor: data kvalitetskontroll, gula rutor: semikvantitativt utslagning/jämförande analys, grå lådor: statistisk analys. Denna siffra är ompublicerade fromCroucher et al.3 Reprinted med tillstånd från AAAS. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter användning av rekombination kloning för att generera V1 och V2 taggade gener av intresse med BiFC pDEST plasmidsna, samtidig transfection av två plasmider som innehåller en samverkande par proteiner kommer att resultera i generation av en Venus fluorescerande signal efter 8-24 timmar. I avsaknad av en positiv signal som det är möjligt att protein interaktionen inte kan uppstå på grund av valet av cellinje, en låg transfection effektivitet eller som taggarna BiFC orientering inte är optimal. Felsökning för var och en av dessa scenarier diskuteras nedan.
Vi har tidigare observerat en positiv interaktion för ett antal olika protein typer ~ 16 timmar efter den samtidig transfection HEK-293T celler. Detta inkluderar dimerisation av den RTK ERBB2 på plasmamembranet (figur 3A)3 och bindningen av Ubiquitin till E3 ligase UBR5, inträffar huvudsakligen inom den nucleus (figur 3A)12. Förmågan att visualisera den specifika sub cellulär lokaliseringen av dessa protein-protein interaktioner, i motsats till hela-cell fluorescensen av proteinet fullängds Venus (figur 3A), är den primära funktionen för befintliga BiFC tekniken. Men den viktigaste innovationen av tekniken med BiCAP är möjligheten att specifikt rena och karakterisera dessa samverkande proteiner.
Figur 3: BiCAP möjliggör visualisering och isolering av samverkande proteiner. (A) Confocal fluorescence mikroskopi analys av fluorescerande signalen produceras av proteinet fullängds Venus, samspelet mellan ERBB2-V1 och ERBB2-V2 och samspelet mellan V1-UBR5 och V2-Ubiquitin efter transfection i HEK-293T celler. Skala barer, 10 µm. (B) HEK-293T celler var transfekterade med en kontrollplasmid innehållande fullängds Venus, ERBB2-V1, ERBB2-V2 eller både ERBB2-V1 och ERBB2-V2, följt av immunoprecipitation med den GFP nanobody och Western blotting med indikerad antikroppar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Denna specifika rening genom protokollet BiCAP lätt kan observeras efter transfection av en kontrollplasmid som innehåller proteinet fullängds Venus, enskilda plasmider som innehåller företrädare V1 eller V2 taggade protein eller samtidig transfection av dessa två plasmider (figur 3B). Efter transfection av dessa plasmider i HEK-293T celler, och en 16 h inkubation visar utarbetandet av rå lysates för western blotting med V1 och V2 tagg antikroppar att varje märkta proteinet är närvarande inom lämpliga provet. Dock upptäckt följande affinitet rening med den GFP nanobody, endast fullängds Venus kontroll proteinet och samverkande V1 och V2 märkta proteiner inom samtidig transfection provet kan vara (figur 3B).
Denna Selektiv rening av samverkande proteiner kan följas av ett antal nedströms tekniker. I vår senaste publikation3 utnyttjade vi BiCAP arbetsflödet för att utföra masspektrometri interactome analys av den RTK ERBB2 som antingen en homodimer eller en heterodimer med EGFR och ERBB3 (figur 4). Genom att följa vår data analys pipeline (figur 2) och visualisera data med hjälp av Cytoscape13 identifierat vi distinkta undergrupper av proteiner som interagerat med alla tre ERBB2 dimerer antingen var specifika för ett par dimerer, eller en enskild dimer. Närmare analys av dessa interaktion profiler tillät oss att identifiera nya mönster av adapter proteinbindning reglera dimer-specifik signaltransduktion händelser, vilket inte har varit möjligt med standard co-immunoprecipitation metoder.
Figur 4: analys av interactome mångfald ERBB2-innehållande dimerer. De receptor beten som används för BiCAP visas i orange, kärngruppen av 10 proteiner gemensamma för interactome av alla tre receptor dimerer visas i blått. Samverkande proteiner gemensamma för två receptor dimerer visas i grönt, och till en receptor i grått. Denna siffra är ompublicerade fromCroucher et al.3 Reprinted med tillstånd från AAAS. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
BiCAP är en kraftfull metod för att isolera specifika protein dimerer medan exklusive de enskilda komponenterna och deras konkurrerande bindande partner3. BiCAP bygger på anpassning av en fluorescens protein komplettering analysen kallas BiFC6. Befintliga metoder, inklusive BiFC och närhet ligering analyser, har använts i stor utsträckning att visualisera och kvantifiera proteininteraktioner i levande celler7, men lämnade inte ett effektivt sätt att isolera och karakterisera de dimerer bildas från dessa interaktioner.
Protein komplettering baserat affinitet rening tekniker har också fortsatt att utvecklas. Schopp et al. beskrev nyligen ett system för protein dimer närhet märkning använder BioID14. Genom att smälta split fragment av den biotin ligase BirA till två samverkande proteiner, riktade de anrikningen av Ago2 som innehåller proteinkomplex som är inblandade i miRNA-medierad nedtystning. Split-BioID kompletterar BiCAP möjliggör selektiv anrikning av proteiner inom den närhet utbud av BioID, där BiCAP berikar direkt komplexa interactmedlemmar.
Framgången av den BiCAP tekniken beror på den effektiva transfection BiFC vektorer. Medan vi använder rutinmässigt HEK293T celler som en robust och lätt-till-transfect cellinje, användningen av denna cellinje kan utgöra hinder för identifiering av potentiellt cell-specifik interaktion partners. Vi rekommenderar därför att valet av cellinje övervägas noggrant för varje experiment, särskilt för studier med viss sjukdom fokus. Utöver detta, bör optimering av transfection villkor också utföras för varje experiment. De värden som anges i protokollet är i linje med vårt arbete på ERBB2 och var kalibrerad för att approximera nivåerna av endogena ERBB2 inom breast cancer cellinjer. Det är klokt, när börjar undersökningen ett specifikt protein-protein interaktioner, att utföra flera prövningar med varierande mängder båda konstruktioner för att uppnå uttryck nivåer som är förenliga med de närvarande i en fysiologisk eller patolo-fysiologiska inställning.
En annan kritisk faktor i detta protokoll är att fastställa den korrekta tiden för prover vara skördade följande transfection. Även bildandet av proteinkomplex är vanligtvis en övergående process, med de enskilda komponenterna att kombinera och demontering över tid, har refolded Venus fragment en mycket långsam dissociation som inte kan återspegla deras fusion partners. I praktiken innebär detta att en någorlunda strikt tidsram efter transfection är nödvändigt att ge ett realistiskt resultat och förhindra ansamling av alltför mycket uttryckt. protein aggregat. Generellt, när BiFC fluorescens är observerbara i standard wide-fältet fluorescerande Mikroskop (t.ex. ~ 16 timmar för ErbB2 dimerer), celler kan förberedas för skörd lysates eller imaging, även om detta kan behöva justeras för varje specifik bete och offer protein.
Vår senaste publikation visat nyttan av BiCAP för att isolera RTK dimerer3. Detta experiment hade fördelen att en känd orientering för protein interaktion, så att direkta anpassningen av taggarna V1 och V2 i intracellulära, C-terminal slutet av varje receptor. Nära anpassningen av dessa taggar är nödvändigt för deras åter vikning, och när du undersöker proteiner interaktioner utan en känd orientering är det viktigt att generera alla varianter av N-terminal och C-terminal tagg fusioner för att identifiera en kombination som kommer att resultera i en positiv BiFC signal. Även med införandet av denna optimering steg finns det fortfarande möjligheten att ett falskt negativt om anpassningen av ett specifikt protein interaktion helt utesluter någon interaktion mellan taggarna.
Däremot bör också vara försiktig att förhindra uppkomsten av en falsk positiv interaktion. Vid längre tidpunkter (> 36 h), vi har tidigare observerat uppkomsten av icke-specifika bakgrund fluorescens med några protein interaktion par. Där så är möjligt, icke-interagera kontroller bör också ingå att säkerställa specificitet observerade protein interaktionen och informera en lämplig tidsram för analys efter transfection.
BiCAP är en mycket anpassningsbar teknik som gäller för nästan alla par av samverkande proteiner. För att påvisa nyttan av denna teknik som vi har presenterat interactome data som genereras med hjälp av masspektrometri. De rena komplex bör dock kompatibel med någon önskad nedströms analysmetod. Till exempel medan BiCAP protokollet tillåter rening av samverkande proteiner, kan det också ha genomisk program via nedströmsanvändningen av CHIP-seq tillsammans med proteomik. Tillämpningen av BiCAP i denna inställning skulle ge ökande nivåer av detalj för DNA bindande motiv av specifika transkriptionsfaktorer, vilket är också starkt reglerad genom komplexa dimerisation mönster.
BiCAP utgör därför ett robust anpassning av protein fragment komplettering analyser, vilket gör att förhör av biokemiska och genomisk nätverk med kraftigt ökad upplösning. I framtiden, kommer att anpassning och utbyggnad av BiCAP tekniken öka vår förståelse för den komplexitet och plasticitet av protein signalering nätverk och deras finstämt roll i regleringen av utvecklingsmässiga, fysiologiska och sjukdomsprocesser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja
Acknowledgments
D.R.C är en Cancer Institute NSW Fellow och D.N.S var tidigare en Cancer Institute NSW Karl. Forskningsresultaten presenteras i detta manuskript finansierades av Cancer Institute NSW (13/FRL/1-02 och 09/CDF/2-39), NHMRC (Project Grant GNT1052963), Science Foundation Ireland (11/SIRG/B2157), NSW Office of Science och medicinsk forskning, värdfamilj Gemenskap och Mostyn Family Foundation. J.F.H. och R.S. var mottagare av en australiensisk forskarutbildning Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LR Clonase II Plus enzyme | Thermo Fisher Scientific | 12538120 | Recombinase enzyme required for Gateway cloning (Step 1) into pDEST BiFC destination vectors |
| Proteinase K, recombinant, PCR grade | Thermo Fisher Scientific | EO0491 | |
| 14 mL round-bottomed polypropylene tube | Corning | 352059 | |
| Ampicillin | Roche Diagnostics Australia | 10835242001 | Stock solution prepared at 100 μg/mL in distilled water. |
| Miniprep kit | Promega Corporation | A1330 | |
| Maxiprep kit | Life Technologies Australia | K2100-07 | |
| DMEM | Gibco | 11995-073 | |
| FBS | Life Technologies Australia | 10099-141 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies Australia | 15070-063 | |
| jetPRIME transfection buffer | Polyplus | 114-15 | |
| jetPRIME transfection reagent | Polyplus | 114-15 | |
| PhosSTOP (Phosphatase inhibitor) | Sigma-Aldrich | 4906837001 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Cell Scraper | Sarstedt | 83.1832 | |
| GFP-Trap_A | Chromotek Gmbh | gta-100 | GFP nanobody coupled to agarose beads |
| N-terminal GFP monoclonal antibody | Covance | MMS-118P | Will detect the V1 tag within the BiFC vectors |
| C-terminal GFP monoclonal antibody | Roche | 11814460001 | Will detect the V2 tag within the BiFC vectors |
| Sample buffer | Invitrogen | NP0008 | Supplemented with 1 mL β-mercaptoethanol. |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega Corporation | V5117h | |
| LoBind microcentrifuge tubes | Point of Care Diagnostics | 0030 108 116 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149-5G | Prepared at 5 mg/mL in ultrapure water |
| Trifluoroacetic Acid - Sequanal Grade | Thermo Fisher | 10628494 | |
| 3M Empore solid phase extraction C18 disks (octadecyl) - 4.7 cm | Thermo Fisher | 14-386-2 | To prepare stage tips, cut 1 mm disks using an appropriately sized hole punch. Alternatively, pre-prepared stage tips can also be purchased, see below. |
| C18 Stage Tips, 10 µL bed | Thermo Fisher | 87782 | |
| Formic acid OPTIMA for LC/MS grade 50mL | Thermo Fisher | FSBA117-50 | |
| 1.9 μm C18 ReproSil particles | Dr. Maisch GmbH | r119.aq. | Stationary phase particles |
| Acetonitrile OPTIMA LC/MS grade | Thermo Fisher | FSBA955-4 | |
| Easy-nLC HPLC | Thermo Fisher | ||
| LTQ Orbitrap Velos Pro | Thermo Fisher | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Non-ionic detergent (100%) |
| DH5α cells | Thermo Fisher | Heat-shock-competent cells |
References
- Kolch, W., Pitt, A. Functional proteomics to dissect tyrosine kinase signalling pathways in cancer. Nat Rev Cancer. 10 (9), 618-629 (2010).
- Pawson, T., Kofler, M. Kinome signaling through regulated protein-protein interactions in normal and cancer cells. Curr Opin Cell Biol. 21 (2), 147-153 (2009).
- Croucher, D. R., et al. Bimolecular complementation affinity purification (BiCAP) reveals dimer-specific protein interactions for ERBB2 dimers. Sci Signal. 9 (436), ra69 (2016).
- Cassonnet, P., et al. Benchmarking a luciferase complementation assay for detecting protein complexes. Nat Methods. 8 (12), 990-992 (2011).
- Rossi, F., Charlton, C. A., Blau, H. M. Monitoring protein-protein interactions in intact eukaryotic cells by beta-galactosidase complementation. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (16), 8405-8410 (1997).
- Magliery, T. J., et al. Detecting protein-protein interactions with a green fluorescent protein fragment reassembly trap: scope and mechanism. J Am Chem Soc. 127 (1), 146-157 (2005).
- Hu, C. D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nat Biotechnol. 21 (5), 539-545 (2003).
- Kubala, M. H., Kovtun, O., Alexandrov, K., Collins, B. M. Structural and thermodynamic analysis of the GFP:GFP-nanobody complex. Protein Sci. 19 (12), 2389-2401 (2010).
- Fegan, A., White, B., Carlson, J. C., Wagner, C. R. Chemically controlled protein assembly: techniques and applications. Chem Rev. 110 (6), 3315-3336 (2010).
- JoVE Science Education Database. Basic methods in cellular and molecular biology. plasmid purification. J Vis Exp. , (2017).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. J Vis Exp. (44), (2010).
- Shearer, R. F., et al. The E3 ubiquitin ligase UBR5 regulates centriolar satellite stability and primary cilia formation via ubiquitylation of CSPP-L. Mol Biol Cell. , (2018).
- Shannon, P., et al. Cytoscape: A software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Res. 13 (11), 2498-2504 (2003).
- Schopp, I. M., et al. Split-BioID a conditional proteomics approach to monitor the composition of spatiotemporally defined protein complexes. Nat Commun. 8, 15690 (2017).
