שימוש האדם המושרה תאים דמויי Hepatocyte נגזר תאי גזע Pluripotent לגילוי סמים
Summary
פרוטוקול המובאת כאן מתאר פלטפורמה לזיהוי מולקולות קטנות לטיפול של מחלת כבד. תיאור שלב אחר שלב מוצגת המפרט איך להבדיל iPSCs לתוך תאים בעלי מאפיינים hepatocyte ב 96-ובכן צלחות, כדי להשתמש בתאים על המסך עבור מולקולות קטנות עם פוטנציאל פעילות טיפולית.
Abstract
היכולת להבחין בתאי גזע pluripotent המושרה אנושי (iPSCs) לתוך תאים, כמו hepatocyte (HLCs) מספק הזדמנויות חדשות ללמוד שגיאות מולדות בחילוף החומרים הכבד. עם זאת, כדי לספק פלטפורמה שתומכת הזיהוי של מולקולות קטנות פוטנציאלי יכול לשמש לטיפול במחלות כבד, ההליך דורש תבנית התרבות תואמת הקרנת אלפי תרכובות. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול להשתמש בתנאים מוגדרים לגמרי תרבות, אשר מאפשרים את הבידול לשחזור של האדם iPSCs לתאים hepatocyte כמו צלחות תרביות רקמה 96-ובכן. אנו מספקים גם דוגמה לשימוש את הפלטפורמה כדי תרכובות מסך בשל יכולתן להוריד אפוליפופרוטאין B (APOB) המופק נגזר iPSC hepatocytes שנוצר מן המטופל היפרכולסטרולמיה משפחתית. הזמינות של פלטפורמה מתאימה ל גילוי תרופות צריך לאפשר לחוקרים לזהות את הריפוי מחלות המשפיעות על הכבד.
Introduction
הצלחה בזיהוי סמים יכול לשמש למטרה מחלה נדירה מסתמך על התפתחות מבחני שיכול לשמש להקרנה. ההשערה או מסכי קליעה (פרמקולוגיה הפוכה) שימושיות, אך דורשות הבנה מפורטת של הבסיס המולקולרי של המחלה. מסכי פנוטיפי (פרמקולוגיה קלאסית) למנוע את הצורך הבנה מפורטת של משעולים הביוכימי, אך במקום להסתמך על פיתוח מודלים במדויק במראה הפתופיזיולוגיה של המחלה. למרות ההתלהבות עבור גישות קליעה, ניתוחים של ה-FDA אישר הראשון ב- class סמים חושפים כי המסכים פנוטיפי היה הרבה יותר מוצלח1. המטרה הכוללת של שיטה זו היא ליצור פלטפורמה עבור תפוקה גבוהה הקרנת זה יכול לשמש כדי לזהות מולקולות קטנות לטיפול של מחלת כבד מטבולית. מספר מודלים במבחנה תוארו כולל hepatocytes העיקרי, הפטומה היא תאים תאים בכבד קדמון2. אולם, רוב המודלים האלה יש מגבלות, יש צורך עבור דגמים חדשים אשר ניתן לסכם במדויק הפתופיזיולוגיה של חילוף החומרים בכבד ליקויים בתרבות. לאחרונה, תאי גזע pluripotent האדם בשילוב עם ג’ין עריכה הציעו הזדמנות לדגמן אפילו הנדירים של מחלות נדירות בתרבות ללא הצורך לחולים גישה ישירות3. בעת השימוש iPSCs החולה הספציפי כפי כלי כדי לגלות מולקולות קטנות לטיפול של מחלות כבד נדירה סביר מבחינה מושגית, יש רק כמה דוחות הממחיש את הכדאיות של גישה זו4. עם זאת, לאחרונה הקמנו פלטפורמה שהיו הנגזרות iPSC hepatocytes בהצלחה לזהות תרופות שניתן יהיה לשנות את ייעודו לטיפול של ליקויים מטבוליזם בכבד5.
פרוטוקול זה מסביר את התהליך של הבחנה אנושית iPSCs לתאים hepatocyte כמו צלחות 96-ובכן ושימוש בהם למסך ספריה של מולקולות קטנות. הוא גם מתאר את הניתוח קצה היפרכולסטרולמיה כדוגמא של מחלת כבד מטבולית. גישה זו צריך להיות שימושי ללמוד את התפקידים ואת היישום של מולקולות קטנות בהקשר של מחלת כבד זיהומיות, מחלות כבד מטבולית, רעילות התרופה ובהפרעות כבד אחרות.
Protocol
Representative Results
Discussion
היעד המבוסס על גילוי תרופות, שבה מולקולות קטנות מזוהים המשפיעים על הפעילות של חלבון ספציפי, הייתה המוקד של מאמצים רבים ההקרנה הקיים. אף-על-פי גישה זו סיפקה תרופות רבות, מסכי בהתבסס על היפוך של פנוטיפ, פרמקולוגיה קלאסית, היה מוצלח יותר בזיהוי הראשון ב- class שאמורות להיות אפקטיבי קלינית<sup class="xr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים (DK55743, DK087377, DK102716 ו- HG006398 כדי S.A.D). ברצוננו להודות ד ר Behshad Pournasr, ד ר ג’יימס Heslop, רן ג’ינג על תרומתם.
Materials
| 100 mm x 20 mm sterile tissue culture dishes | Corning | 430167 | |
| 100 mm x 20 mm sterile suspension culture dishes | Corning | 430591 | |
| 96-wells tissue culture plate | Corning | 3595 | |
| Anti-human Albumin | Dako | A 0001 | |
| Anti-human FOXA2(6C12) | Novus Biological | H00003170-M12 | |
| Anti-human HNF4 alpha | Santa Cruz | SC-6556 | |
| Anti-human Oct-3/4 antibody | Santa Cruz | SC-9081 | |
| Anti-human SOX17 | R&D | AF1924 | |
| Anti-human TRA-1-60 FITC conjugated | Millipore | FCMAB115F | |
| Activin A Recombinant Human Protein | Invitrogen | PHC9563 | |
| B-27 Supplement, minus insulin | Invitrogen | 0050129SA | |
| B-27 Supplement, serum free | Invitrogen | 17504044 | |
| BMP4 Recombinant Human Protein | Invitrogen | PHC9533 | |
| Cell Dissociation Reagent StemPro Accutase | Invitrogen | A1110501 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | 7572 | |
| DPBS+(calcium, magnesium) | Invitrogen | 14040-133 | |
| DPBS-(no calcium, no magnesium) | Invitrogen | 14190-144 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Invitrogen | 11330057 | |
| ELISA human APOB ELISA development kit | Mabtech | 3715-1H-20 | |
| Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2) | Invitrogen | PHG0023 | |
| Hepatocyte Culture Medium (HCM Bullet Kit) | Lonza | CC-3198 | |
| Hepatocyte Growth Factor (HGF) | Invitrogen | PHC0321 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Invitrogen | 11140076 | |
| Oncostatin M (OSM) Recombinant Human Protein | Invitrogen | PHC5015 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140163 | |
| Feeder free pluripotent stem cell medium: mTesR1 | STEMCELL technologies | 5850 | |
| Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Invitrogen | A1413301 | |
| RPMI 1640 Medium, HEPES | Invitrogen | 22400105 | |
| StemAdhere Defined Matrix for hPSC (E-cad-Fc) | Primorigen Biosciences | S2071 | |
| TMB-ELISA Substrate Solution | Thermo Scientific | 34022 | |
| Anti-TRA-1-60 FITC conjugated | Millipore | FCMAB115F | |
| Versene (EDTA) 0.02% | Lonza | 17-711E | |
| Y-27632 ROCK inhibitor | STEMCELL Technologies | 72302 |
References
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered?. Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).
- Zeilinger, K., Freyer, N., Damm, G., Seehofer, D., Knospel, F. Cell sources for in vitro human liver cell culture models. Exp Biol Med (Maywood. 241 (15), 1684-1698 (2016).
- Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).
- Cayo, M. A., et al. A Drug Screen using Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Reveals Cardiac Glycosides as a Potential Treatment for Hypercholesterolemia. Cell Stem Cell. 20 (4), 478-489 (2017).
- Nagaoka, M., et al. E-cadherin-coated plates maintain pluripotent ES cells without colony formation. PLoS One. 1, e15 (2006).
- Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
- International Stem Cell Initiative. Characterization of human embryonic stem cell lines by International Stem Cell Initiative. Nat Biotechnol. 25 (7), 803-816 (2007).
- Cayo, M. A., et al. JD induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes faithfully recapitulate the pathophysiology of familial hypercholesterolemia. Hepatology. 56 (6), 2163-2171 (2012).
- DeSilva, B., et al. Recommendations for the bioanalytical method validation of ligand-binding assays to support pharmacokinetic assessments of macromolecules. Pharm Res. 20 (11), 1885-1900 (2003).
- Rowland, T. J., et al. Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin. Stem Cells Dev. 19 (8), 1231-1240 (2010).
- Nagaoka, M., Si-Tayeb, K., Akaike, T., Duncan, S. A. Culture of human pluripotent stem cells using completely defined conditions on a recombinant E-cadherin substratum. BMC Dev Biol. 10, 60 (2010).
- Hay, D. C., et al. Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo. Stem Cells. 26 (4), 894-902 (2008).
- Mallanna, S. K., Cayo, M. A., Twaroski, K., Gundry, R. L., Duncan, S. A. Mapping the Cell-Surface N-Glycoproteome of Human Hepatocytes Reveals Markers for Selecting a Homogeneous Population of iPSC-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 7 (3), 543-556 (2016).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
- Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J Biomol Screen. 16 (7), 775-785 (2011).
- Lorenz, C., et al. Human iPSC-Derived Neural Progenitors Are an Effective Drug Discovery Model for Neurological mtDNA Disorders. Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).
- Rashid, S. T., et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest. 120 (9), 3127-3136 (2010).
- Lu, W. Y., et al. Hepatic progenitor cells of biliary origin with liver repopulation capacity. Nat Cell Biol. 17 (8), 971-983 (2015).
- Ogawa, M., et al. Directed differentiation of cholangiocytes from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 33 (8), 853-861 (2015).
- Sampaziotis, F., et al. Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation. Nat Biotechnol. 33 (8), 845-852 (2015).
- Mallanna, S. K., Duncan, S. A. Differentiation of hepatocytes from pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 26 (Unit 1G 4), (2013).
- Song, Z., et al. Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells. Cell Res. 19 (11), 1233-1242 (2009).
- Cai, J., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells. Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).
- Si-Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).
- Pashos, E. E., et al. Diverse Population Cohorts of hiPSCs and Derived Hepatocyte-like Cells Reveal Functional Genetic Variation at Blood Lipid-Associated Loci. Cell Stem Cell. 20 (4), 558-570 (2017).
- Davidson, M. D., Ware, B. R., Khetani, S. R. Stem cell-derived liver cells for drug testing and disease modeling. Discov Med. 19 (106), 349-358 (2015).
- Choi, S. M., et al. Efficient drug screening and gene correction for treating liver disease using patient-specific stem cells. Hepatology. 57 (6), 2458-2468 (2013).
- Tafaleng, E. N., et al. Induced pluripotent stem cells model personalized variations in liver disease resulting from alpha1-antitrypsin deficiency. Hepatology. 62 (1), 147-157 (2015).
- Jing, R., Duncan, C. B., Duncan, S. A. A small-molecule screen reveals that HSP90beta promotes the conversion of induced pluripotent stem cell-derived endoderm to a hepatic fate and regulates HNF4A turnover. Development. 144 (10), 1764-1774 (2017).
