Utilizzando umani indotti dell'epatocita-come di derivati da cellule staminali pluripotenti per scoperta della droga

Summary

Il protocollo presentato qui descrive una piattaforma per identificare piccole molecole per il trattamento dell’affezione epatica. Una descrizione dettagliata è presentata dettagliare come differenziarsi iPSCs in cellule con le caratteristiche dell’epatocita in piastre da 96 pozzetti e per utilizzare le celle per schermo per piccole molecole con potenziale attività terapeutica.

Abstract

La possibilità di differenziare le cellule staminali umane pluripotenti indotte (iPSCs) in epatociti-come le cellule (HLCs) offre nuove opportunità per studiare gli errori innati di metabolismo epatico. Tuttavia, per fornire una piattaforma che supporta l’identificazione di piccole molecole che potenzialmente può essere utilizzato per trattare la malattia del fegato, la procedura richiede un formato di impostazioni cultura che è compatibile con migliaia di composti di screening. Qui, descriviamo un protocollo utilizzando condizioni di cultura completamente definita, che consentono la differenziazione riproducibile delle iPSCs umane dell’epatocita-come le cellule in piastre a 96 pozzetti tessuto coltura. Forniamo anche un esempio di utilizzo della piattaforma ai composti di schermo per la loro capacità di abbassare l’apolipoproteina B (APOB) prodotta dagli epatociti iPSC-derivato generati da un paziente di ipercolesterolemia familiare. La disponibilità di una piattaforma che è compatibile con la scoperta della droga dovrebbe consentire ai ricercatori di identificare approcci terapeutici per le malattie che colpiscono il fegato.

Introduction

Successo nell’identificazione di farmaci che possono essere utilizzati per indirizzare una malattia rara si basa sullo sviluppo di analisi che può essere utilizzato per lo screening. Ipotesi o schermi basati su destinazione (inversa farmacologia) sono utili, ma richiedono una dettagliata comprensione delle basi molecolari della malattia. Fenotipici schermi (farmacologia classica) evitano la necessità di una comprensione dettagliata delle vie biochimiche, ma invece si basano sullo sviluppo di modelli che rispecchiano esattamente la patofisiologia della malattia. Nonostante l’entusiasmo per gli approcci basati su target, analisi delle droghe first-in-class approvato dalla FDA rivelano che schermi fenotipici sono state molto più successo¹. L’obiettivo generale di questo metodo è di stabilire una piattaforma per high throughput screening che può essere utilizzato per identificare piccole molecole per il trattamento della malattia epatica metabolica. Diversi modelli in vitro sono stati descritti compreso epatociti primari, cellule del tumore epatico e di cellule progenitrici del fegato². Tuttavia, la maggior parte di questi modelli hanno dei limiti, e c’è bisogno di nuovi modelli che possono ricapitolare con precisione la patofisiologia delle carenze metaboliche del fegato nella cultura. Recentemente, le cellule staminali pluripotenti umane combinate con gene editing hanno offerto l’opportunità di modellare anche il più raro di malattie rare in cultura senza la necessità di accesso pazienti direttamente³. Mentre l’uso di paziente-specific iPSCs come uno strumento per scoprire piccole molecole per il trattamento delle malattie del fegato è concettualmente ragionevole, ci sono soltanto alcuni rapporti che dimostrano la fattibilità di questo approccio⁴. Tuttavia, recentemente abbiamo stabilito una piattaforma che utilizzato epatociti iPSC-derivati per identificare con successo farmaci che possono essere riproposto per il trattamento delle carenze nel metabolismo del fegato⁵.

Questo protocollo viene illustrato il processo di differenziazione umana iPSCs dell’epatocita-come le cellule in piastre da 96 pozzetti e il loro utilizzo per lo screening di una libreria di piccole molecole. Viene inoltre descritto l’analisi dell’endpoint utilizzando ipercolesterolemia come un esempio di malattia epatica metabolica. Questo approccio dovrebbe essere utile per studiare il ruolo e l’applicazione di piccole molecole nel contesto della malattia infettiva del fegato, malattia epatica metabolica, tossicità dei farmaci e altri disturbi del fegato.

Protocol

1. la cultura dell’essere umano ha indotto le cellule staminali pluripotenti indotte Rivestimento di altre matrici adatti a coltura hPSC o ricombinante umano proteina di fusione di E-caderina Fc (E-cad-Fc) 6 Diluire E-cad-Fc a 15 μg/mL con soluzione fisiologica Phosphate-Buffered di Dulbecco contenente calcio e magnesio (DPBS (+)). Cappotto piatti di coltura del tessuto di sospensione 100 mm con 5 mL di diluito E-cad-Fc e incubare a 37 ° c per almen…

Representative Results

Generazione degli epatociti – come cellule: Figura 1 descrive l’intervallo di tempo dei cambiamenti che si verificano durante la differenziazione delle iPSCs umane dell’epatocita-come le cellule. La cultura di iPSCs su E-Cad-Fc fornisce circa 2mm colonie di diametro che esprimono il marcatore di pluripotent OCT4 (Figura 1A-B). La morfologia delle cellule cresciut…

Discussion

Obiettivo basata scoperta di nuovi farmaci, dove vengono identificate piccole molecole che influenzano l’attività di una proteina specifica, è stato al centro di molti sforzi di selezione esistente. Anche se questo approccio ha fornito numerosi prodotti farmaceutici, schermi basati sull’inversione di un fenotipo, la farmacologia classica, hanno avuto più successo nell’individuazione di composti di first-in-class che sono stati clinicamente efficace¹. Uno svantaggio di scoperta della droga fenot…

Materials

100 mm x 20 mm sterile tissue culture dishes	Corning	430167
100 mm x 20 mm sterile suspension culture dishes	Corning	430591
96-wells tissue culture plate	Corning	3595
Anti-human Albumin	Dako	A 0001
Anti-human FOXA2(6C12)	Novus Biological	H00003170-M12
Anti-human HNF4 alpha	Santa Cruz	SC-6556
Anti-human Oct-3/4 antibody	Santa Cruz	SC-9081
Anti-human SOX17	R&D	AF1924
Anti-human TRA-1-60 FITC conjugated	Millipore	FCMAB115F
Activin A Recombinant Human Protein	Invitrogen	PHC9563
B-27 Supplement, minus insulin	Invitrogen	0050129SA
B-27 Supplement, serum free	Invitrogen	17504044
BMP4 Recombinant Human Protein	Invitrogen	PHC9533
Cell Dissociation Reagent StemPro  Accutase	Invitrogen	A1110501
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay	Promega	7572
DPBS+(calcium, magnesium)	Invitrogen	14040-133
DPBS-(no calcium, no magnesium)	Invitrogen	14190-144
DMEM/F-12, HEPES	Invitrogen	11330057
ELISA human APOB ELISA development kit	Mabtech	3715-1H-20
Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2)	Invitrogen	PHG0023
Hepatocyte Culture Medium (HCM Bullet Kit)	Lonza	CC-3198
Hepatocyte Growth Factor  (HGF)	Invitrogen	PHC0321
L-Glutamine	Invitrogen	25030081
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Invitrogen	11140076
Oncostatin M (OSM) Recombinant Human Protein	Invitrogen	PHC5015
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140163
Feeder free pluripotent stem cell medium: mTesR1	STEMCELL technologies	5850
Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix	Invitrogen	A1413301
RPMI 1640 Medium, HEPES	Invitrogen	22400105
StemAdhere Defined Matrix for hPSC (E-cad-Fc)	Primorigen Biosciences	S2071
TMB-ELISA Substrate Solution	Thermo Scientific	34022
Anti-TRA-1-60 FITC conjugated	Millipore	FCMAB115F
Versene (EDTA) 0.02%	Lonza	17-711E
Y-27632 ROCK inhibitor	STEMCELL Technologies	72302