Summary

С помощью человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток получены гепатоцито как клетки для обнаружения наркотиков

Published: May 19, 2018
doi:

Summary

Представленные здесь протокол описывает платформу для выявления мелких молекул для лечения заболеваний печени. Пошаговое описание представлены подробно как различать iPSCs в клетки с характеристиками гепатоцитов в 96-луночных пластин и использовать клетки для экрана для малых молекул с потенциальной терапевтической активностью.

Abstract

Способности различать человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) в гепатоцито как клетки (кг) обеспечивает новые возможности для изучения врожденных печеночный метаболизм. Однако чтобы обеспечить платформу, которая поддерживает определение малых молекул, которые потенциально могут быть использованы для лечения заболеваний печени, процедура требует культуры формат, который совместим с экранирующей тысячи соединений. Здесь мы описываем протокол, с помощью полностью определенной культуры условий, которые позволяют воспроизводимые дифференциация человеческого iPSCs гепатоцито как клетки в культуре ткани 96-луночных пластины. Мы также предоставляем пример использования платформы для экрана соединений для их способности снижать аполипопротеина B (АПОВ) производится из iPSC производные гепатоцитов, созданный из семейной гиперхолестеринемией пациента. Наличие платформы, который совместим с лекарственных препаратов должно позволить исследователи для выявления роман терапии для лечения заболеваний, которые влияют на печень.

Introduction

Успех в выявлении наркотиков, которые могут использоваться для целевой редкое заболевание опирается на развитие анализов, которые могут использоваться для проверки. Гипотеза или целевое экраны (обратный фармакологии) полезны, но требуют детального понимания молекулярные основы этой болезни. Фенотипические экраны (классической фармакологии) избежать необходимости детального понимания биохимические пути, но вместо этого полагаться на разработку моделей, которые точно отражают Патофизиология болезни. Несмотря на энтузиазм для целевых подходов анализ утвержденных FDA первого в класс наркотиков показывают, что Фенотипическая экраны были гораздо более успешным1. Общая цель этого метода заключается, чтобы создать платформу для высокой пропускной способности, скрининг, может использоваться для идентификации малых молекул для лечения метаболических заболеваний печени. Включая первичной гепатоцитов и клетки гепатомы печени прогениторных клеток2были описаны несколько моделей в пробирке . Однако большинство из этих моделей имеют ограничения, и существует потребность в новых моделей, которые можно точно охарактеризовать патофизиологии метаболизма печени недостатков в культуре. Недавно, человеческих плюрипотентных стволовых клеток в сочетании с Джин редактирования предложили возможность моделировать даже самые редкие из редких заболеваний в культуре без необходимости доступа пациентов непосредственно3. Хотя использование конкретного пациента iPSCs как инструмент для обнаружения малых молекул для лечения редких заболеваний печени является концептуально обоснованными, есть лишь несколько докладов, демонстрирующих возможности этот подход4. Однако мы недавно создали платформу, которая позволяет успешно идентифицировать наркотиков, которые можно многократно использовать для лечения недостатков в печени метаболизм5iPSC производные гепатоцитов.

Этот протокол объясняет процесс дифференциации человека iPSCs гепатоцито подобных клеток в 96-луночных пластин и их использование для экран Библиотека малых молекул. Он также описывает анализа конечной точки с помощью гиперхолестеринемии в качестве примера метаболических заболеваний печени. Этот подход должен быть полезным для изучения роли и применения малых молекул в контексте инфекционных заболеваний печени, метаболические заболевания печени, лекарственной токсичности и других расстройств печени.

Protocol

1. Культура человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток Покрытие рекомбинантного человеческого E-Кадгерины ФК синтез белка (E-cad ФК) или других матриц для hPSC культуры 6 Разбавляют E-cad ФК 15 мкг/мл физиологическим Phosphate-Buffered Дульбекко содержащие …

Representative Results

Поколение гепатоцитов – как клетки: Рисунок 1 описывает сроки изменения, которые происходят во время дифференциация человеческого iPSCs гепатоцито подобных клеток. Культура iPSCs на E-Cad-ФК обеспечивает примерно 2 мм диаметр колон?…

Discussion

Целевой основе лекарств, где выявлены небольшие молекулы которые влияют на активность определенного белка, был в центре внимания многих существующих скрининг усилия. Хотя этот подход предоставил многочисленные Фармацевтика, экраны, основанные на натяжном фенотип, классической фарма?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана национальных институтов здравоохранения (DK55743, DK087377, DK102716 и HG006398 к САР). Мы хотели бы поблагодарить д-ра Behshad Pournasr, д-р Джеймс Хеслоп и Цзин побежал за их вклад.

Materials

100 mm x 20 mm sterile tissue culture dishes  Corning 430167
100 mm x 20 mm sterile suspension culture dishes Corning 430591
96-wells tissue culture plate  Corning 3595
Anti-human Albumin Dako A 0001
Anti-human FOXA2(6C12) Novus Biological H00003170-M12
Anti-human HNF4 alpha Santa Cruz SC-6556
Anti-human Oct-3/4 antibody Santa Cruz SC-9081
Anti-human SOX17 R&D AF1924
Anti-human TRA-1-60 FITC conjugated Millipore FCMAB115F
Activin A Recombinant Human Protein  Invitrogen PHC9563
B-27 Supplement, minus insulin  Invitrogen 0050129SA
B-27 Supplement, serum free  Invitrogen 17504044
BMP4 Recombinant Human Protein  Invitrogen PHC9533
Cell Dissociation Reagent StemPro  Accutase  Invitrogen A1110501
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay  Promega 7572
DPBS+(calcium, magnesium) Invitrogen 14040-133
DPBS-(no calcium, no magnesium) Invitrogen 14190-144
DMEM/F-12, HEPES  Invitrogen 11330057
ELISA human APOB ELISA development kit Mabtech 3715-1H-20
Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2) Invitrogen PHG0023
Hepatocyte Culture Medium (HCM Bullet Kit)  Lonza CC-3198
Hepatocyte Growth Factor  (HGF) Invitrogen PHC0321
L-Glutamine  Invitrogen 25030081
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Invitrogen 11140076
Oncostatin M (OSM) Recombinant Human Protein  Invitrogen PHC5015
Penicillin-Streptomycin  Invitrogen 15140163
Feeder free pluripotent stem cell medium: mTesR1  STEMCELL technologies 5850
Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix  Invitrogen A1413301
RPMI 1640 Medium, HEPES  Invitrogen 22400105
StemAdhere Defined Matrix for hPSC (E-cad-Fc) Primorigen Biosciences S2071
TMB-ELISA Substrate Solution Thermo Scientific  34022
Anti-TRA-1-60 FITC conjugated Millipore FCMAB115F
Versene (EDTA) 0.02%  Lonza 17-711E
Y-27632 ROCK inhibitor STEMCELL Technologies 72302

References

  1. Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered?. Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).
  2. Zeilinger, K., Freyer, N., Damm, G., Seehofer, D., Knospel, F. Cell sources for in vitro human liver cell culture models. Exp Biol Med (Maywood. 241 (15), 1684-1698 (2016).
  3. Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
  4. Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).
  5. Cayo, M. A., et al. A Drug Screen using Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Reveals Cardiac Glycosides as a Potential Treatment for Hypercholesterolemia. Cell Stem Cell. 20 (4), 478-489 (2017).
  6. Nagaoka, M., et al. E-cadherin-coated plates maintain pluripotent ES cells without colony formation. PLoS One. 1, e15 (2006).
  7. Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
  8. International Stem Cell Initiative. Characterization of human embryonic stem cell lines by International Stem Cell Initiative. Nat Biotechnol. 25 (7), 803-816 (2007).
  9. Cayo, M. A., et al. JD induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes faithfully recapitulate the pathophysiology of familial hypercholesterolemia. Hepatology. 56 (6), 2163-2171 (2012).
  10. DeSilva, B., et al. Recommendations for the bioanalytical method validation of ligand-binding assays to support pharmacokinetic assessments of macromolecules. Pharm Res. 20 (11), 1885-1900 (2003).
  11. Rowland, T. J., et al. Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin. Stem Cells Dev. 19 (8), 1231-1240 (2010).
  12. Nagaoka, M., Si-Tayeb, K., Akaike, T., Duncan, S. A. Culture of human pluripotent stem cells using completely defined conditions on a recombinant E-cadherin substratum. BMC Dev Biol. 10, 60 (2010).
  13. Hay, D. C., et al. Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo. Stem Cells. 26 (4), 894-902 (2008).
  14. Mallanna, S. K., Cayo, M. A., Twaroski, K., Gundry, R. L., Duncan, S. A. Mapping the Cell-Surface N-Glycoproteome of Human Hepatocytes Reveals Markers for Selecting a Homogeneous Population of iPSC-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 7 (3), 543-556 (2016).
  15. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  16. Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J Biomol Screen. 16 (7), 775-785 (2011).
  17. Lorenz, C., et al. Human iPSC-Derived Neural Progenitors Are an Effective Drug Discovery Model for Neurological mtDNA Disorders. Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).
  18. Rashid, S. T., et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest. 120 (9), 3127-3136 (2010).
  19. Lu, W. Y., et al. Hepatic progenitor cells of biliary origin with liver repopulation capacity. Nat Cell Biol. 17 (8), 971-983 (2015).
  20. Ogawa, M., et al. Directed differentiation of cholangiocytes from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 33 (8), 853-861 (2015).
  21. Sampaziotis, F., et al. Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation. Nat Biotechnol. 33 (8), 845-852 (2015).
  22. Mallanna, S. K., Duncan, S. A. Differentiation of hepatocytes from pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 26 (Unit 1G 4), (2013).
  23. Song, Z., et al. Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells. Cell Res. 19 (11), 1233-1242 (2009).
  24. Cai, J., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells. Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).
  25. Si-Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).
  26. Pashos, E. E., et al. Diverse Population Cohorts of hiPSCs and Derived Hepatocyte-like Cells Reveal Functional Genetic Variation at Blood Lipid-Associated Loci. Cell Stem Cell. 20 (4), 558-570 (2017).
  27. Davidson, M. D., Ware, B. R., Khetani, S. R. Stem cell-derived liver cells for drug testing and disease modeling. Discov Med. 19 (106), 349-358 (2015).
  28. Choi, S. M., et al. Efficient drug screening and gene correction for treating liver disease using patient-specific stem cells. Hepatology. 57 (6), 2458-2468 (2013).
  29. Tafaleng, E. N., et al. Induced pluripotent stem cells model personalized variations in liver disease resulting from alpha1-antitrypsin deficiency. Hepatology. 62 (1), 147-157 (2015).
  30. Jing, R., Duncan, C. B., Duncan, S. A. A small-molecule screen reveals that HSP90beta promotes the conversion of induced pluripotent stem cell-derived endoderm to a hepatic fate and regulates HNF4A turnover. Development. 144 (10), 1764-1774 (2017).

Play Video

Cite This Article
Liu, J., Lamprecht, M. P., Duncan, S. A. Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (135), e57194, doi:10.3791/57194 (2018).

View Video