Summary

Usar humanos induzida pluripotentes células-tronco derivadas hepatócitos células para descoberta de drogas

Published: May 19, 2018
doi:

Summary

O protocolo aqui apresentado descreve uma plataforma para a identificação de moléculas pequenas para o tratamento de doença hepática. Apresenta-se uma descrição passo a passo detalhando como diferenciar iPSCs em células com características de hepatócitos em placas de 96 poços, para usar as células para a tela para pequenas moléculas com potencial atividade terapêutica.

Abstract

A capacidade de diferenciar as células-tronco humanas pluripotentes induzidas (iPSCs) em hepatócitos células (HLCs) oferece novas oportunidades para estudar erros inatos do metabolismo hepático. No entanto, para fornecer uma plataforma que ofereça suporte a identificação de pequenas moléculas que potencialmente pode ser usado para tratar a doença do fígado, o procedimento requer um formato de cultura que é compatível com milhares de compostos de triagem. Aqui, descrevemos um protocolo utilizando as condições de cultura completamente definidos, que permitem a diferenciação pode ser reproduzida de iPSCs humana de hepatócitos células em placas de cultura de tecidos de 96 poços. Nós também fornecemos um exemplo de uso da plataforma para compostos de tela para a sua capacidade para reduzir a apolipoproteína B (APOB) produzido a partir de hepatócitos iPSC-derivados gerados a partir de um paciente de hipercolesterolemia familiar. A disponibilidade de uma plataforma que é compatível com a descoberta de medicamentos deve permitir que os investigadores a identificar novas terapêuticas para doenças que afetam o fígado.

Introduction

Sucesso na identificação de drogas que podem ser usadas para uma doença rara de destino baseia-se no desenvolvimento de ensaios que podem ser usados para a seleção. Hipótese ou telas no destino (farmacologia inversa) são úteis, mas exigem um conhecimento detalhado da base molecular da doença. Telas fenotípicas (farmacologia clássica) evitam a necessidade de uma compreensão detalhada das vias bioquímicas, mas em vez disso, contam com o desenvolvimento de modelos que espelham com precisão a fisiopatologia da doença. Apesar do entusiasmo para abordagens baseadas em alvo, análises do FDA aprovado primeiro na sua classe de drogas revelam que telas fenotípicas foram muito mais bem sucedido1. O objectivo geral deste método é estabelecer uma plataforma para alto throughput screening que pode ser usado para identificar moléculas pequenas para o tratamento da doença hepática metabólica. Vários modelos de em vitro têm sido descritos incluindo primários hepatócitos, células de hepatoma e de células progenitoras fígado2. No entanto, a maioria destes modelos têm limitações, e há uma necessidade de novos modelos com precisão pode recapitular a fisiopatologia das deficiências hepáticas metabólicas na cultura. Recentemente, as células-tronco pluripotentes humanas combinadas com a edição de gene ter oferecido uma oportunidade para modelar até os mais raros de doenças raras em cultura sem a necessidade de acesso pacientes diretamente3. Enquanto o uso de iPSCs paciente específico como uma ferramenta para descobrir pequenas moléculas para o tratamento de doenças raras do fígado é conceitualmente razoável, existem apenas alguns relatórios demonstrando a viabilidade desta abordagem4. No entanto, nós temos estabelecido recentemente uma plataforma que costumava iPSC-derivado de hepatócitos com sucesso identificar drogas que podem ser realocadas para o tratamento das deficiências no metabolismo do fígado5.

Este protocolo explica o processo de diferenciação humana iPSCs para hepatócitos células em placas de 96 poços e usá-los para selecionar uma biblioteca de pequenas moléculas. Ele também descreve a análise de ponto de extremidade usando hipercolesterolemia como um exemplo de doença hepática metabólica. Esta abordagem deve ser útil para estudar o papel e a aplicação de pequenas moléculas no contexto de doenças infecciosas do fígado, doença hepática metabólica, toxicidade de drogas e outros distúrbios hepáticos.

Protocol

1. cultura de humanos induzida por células-tronco pluripotentes Revestimento recombinante humano E-caderina Fc proteína da fusão (E-cad-Fc) ou outras matrizes apropriados para cultura hPSC 6 Dilua E-cad-Fc a 15 μg/mL com Phosphate-Buffered salina de Dulbecco contendo cálcio e magnésio (DPBS (+)). Casaco pratos de cultura de tecidos de suspensão de 100 mm com 5 mL de diluídos E-cad-Fc e incubar a 37 ˚ c pelo menos 1 h. substrato de remover e s…

Representative Results

Geração de hepatócito – como células: A Figura 1 descreve a cronograma das mudanças que ocorrem durante a diferenciação das iPSCs humano para hepatócitos células. A cultura de iPSCs em E-Cad-Fc fornece aproximadamente 2mm colônias de diâmetro que expressam o marcador pluripotentes OCT4 (figura 1A-B). A morfologia das células cultivadas em uma matriz d…

Discussion

Alvo baseado descoberta de drogas, onde as moléculas pequenas são identificadas que influenciam a atividade de uma proteína específica, tem sido o foco de muitos esforços de rastreio existentes. Embora essa abordagem forneceu inúmeros produtos farmacêuticos, telas com base em reverter um fenótipo, farmacologia clássica, têm sido mais bem sucedidos na identificação de compostos de primeira classe que foram clinicamente eficaz1. Uma desvantagem para descoberta de drogas fenotípica é qu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (DK55743, DK087377, DK102716 e HG006398 de S.A.D.). Gostaríamos de agradecer o Dr. Behshad Pournasr, Dr. James Heslop e Jing Ran pelas suas contribuições.

Materials

100 mm x 20 mm sterile tissue culture dishes  Corning 430167
100 mm x 20 mm sterile suspension culture dishes Corning 430591
96-wells tissue culture plate  Corning 3595
Anti-human Albumin Dako A 0001
Anti-human FOXA2(6C12) Novus Biological H00003170-M12
Anti-human HNF4 alpha Santa Cruz SC-6556
Anti-human Oct-3/4 antibody Santa Cruz SC-9081
Anti-human SOX17 R&D AF1924
Anti-human TRA-1-60 FITC conjugated Millipore FCMAB115F
Activin A Recombinant Human Protein  Invitrogen PHC9563
B-27 Supplement, minus insulin  Invitrogen 0050129SA
B-27 Supplement, serum free  Invitrogen 17504044
BMP4 Recombinant Human Protein  Invitrogen PHC9533
Cell Dissociation Reagent StemPro  Accutase  Invitrogen A1110501
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay  Promega 7572
DPBS+(calcium, magnesium) Invitrogen 14040-133
DPBS-(no calcium, no magnesium) Invitrogen 14190-144
DMEM/F-12, HEPES  Invitrogen 11330057
ELISA human APOB ELISA development kit Mabtech 3715-1H-20
Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2) Invitrogen PHG0023
Hepatocyte Culture Medium (HCM Bullet Kit)  Lonza CC-3198
Hepatocyte Growth Factor  (HGF) Invitrogen PHC0321
L-Glutamine  Invitrogen 25030081
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Invitrogen 11140076
Oncostatin M (OSM) Recombinant Human Protein  Invitrogen PHC5015
Penicillin-Streptomycin  Invitrogen 15140163
Feeder free pluripotent stem cell medium: mTesR1  STEMCELL technologies 5850
Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix  Invitrogen A1413301
RPMI 1640 Medium, HEPES  Invitrogen 22400105
StemAdhere Defined Matrix for hPSC (E-cad-Fc) Primorigen Biosciences S2071
TMB-ELISA Substrate Solution Thermo Scientific  34022
Anti-TRA-1-60 FITC conjugated Millipore FCMAB115F
Versene (EDTA) 0.02%  Lonza 17-711E
Y-27632 ROCK inhibitor STEMCELL Technologies 72302

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Cite This Article
Liu, J., Lamprecht, M. P., Duncan, S. A. Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (135), e57194, doi:10.3791/57194 (2018).

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