Summary
Ici, nous présentons une méthode rapide, facile et peu coûteux de fabriquer des moules de polydiméthylsiloxane personnalisé qui peuvent être utilisés pour la production de tissus conçus à base hydrogel avec des géométries complexes. En outre, nous décrivons les résultats d’évaluations histologiques et mécaniques effectuées sur des tissus cardiaques machinés produites à l’aide de cette technique.
Abstract
Comme le domaine de l’ingénierie tissulaire a continué d’évoluer, il y a eu un intérêt accru dans un large éventail de paramètres de tissus, y compris la forme du tissu. Manipulation forme le tissu sur le micromètre à l’échelle du centimètre peut diriger l’alignement de la cellule, modifier les propriétés mécaniques efficaces et pallier les lacunes liées à la diffusion des éléments nutritifs. En outre, le bateau dans lequel est disposé un tissu peut donner des contraintes mécaniques sur les tissus, résultant dans des champs de contraintes qui peuvent influencer davantage la structure de la cellule et la matrice. Les tissus façonnés avec des dimensions très reproductibles ont aussi utilitaire pour des dosages in vitro dans quel échantillon dimensions sont critiques, telles que l’analyse mécanique des tissus ensemble.
Ce manuscrit décrit un procédé de fabrication alternatives utilisant des moules maîtres négatifs préparées à partir d’acrylique gravé au laser : ces moules effectuer bien avec polydiméthylsiloxane (PDMS), permettent des dessins avec des dimensions sur l’échelle de centimètre et la fonctionnalité tailles plus petit que 25 µm et peuvent être rapidement conçu et fabriqué à moindre coût et connaissant un minimum. Le minimum de temps et les dépenses permettant gravé au laser moules rapidement itération sur jusqu'à ce qu’une conception optimale est déterminée et être facilement adaptées pour convenir à n’importe quel test d’intérêt, y compris celles au-delà du domaine de l’ingénierie tissulaire.
Introduction
Pendant les deux dernières décennies, lithographie douce a été largement utilisé comme une technique de fabrication pour soutenir la recherche scientifique, notamment dans les domaines de la microfluidique, recherche sur les matériaux et tissus techniques1,,2, 3. Moulage de réplique, dans laquelle un objet avec une forme désirée est créé un moule négatif de maître, vous propose une méthode commode et peu coûteux de produire positive que PDMS réplique qui peut être utilisée pour la coulée en forme hydrogels. Toutefois, les moules de maîtres négatifs requis sont généralement produites à l’aide de techniques de microfabrication qui sont coûteux, chronophages, limitées en taille, et exigent l’espace chambre propre et un équipement sophistiqué. Alors que l’impression 3D offre une alternative potentielle, son utilité est quelque peu limitée en raison des limites de résolution des imprimantes de bas-coût et les interactions chimiques entre les polymères imprimante 3D courants et PDMS qui peuvent inhiber la polymérisation.
Systèmes de coupe laser capable de découpe et de gravure de matériaux comme le plastique, bois, verre et métal sont récemment devenus radicalement moins cher et donc plus accessibles pour la fabrication d’outils de recherche. Coupeurs de laser de qualité commerciale sont capables de fabriquer des objets à l’échelle du centimètre avec les caractéristiques minimales inférieures à 25 µm et plus besoin d’un minimum de formation, d’expertise et temps d’utiliser. Alors que l’ablation par laser de PDMS a été précédemment utilisé dans la fabrication des dispositifs microfluidiques, à notre connaissance, aucun manuscrit n’a décrit un processus par lequel millimètres et un centimètre échelle moules peuvent être fabriqués de moules maîtres négatifs4 de découpées au laser .
Nous avons utilisé cette technique principalement pour manipuler la forme des tissus techniques afin d’améliorer la diffusion des éléments nutritifs, l’alignement cellulaire et propriétés mécaniques5,6,7. Toutefois, la polyvalence de cette technique permet pour une utilisation dans tous les domaines où les hydrogels moulés sont d’intérêt, comme drogue livraison et matériel scientifique recherche8. Accès à un coupeur de laser, PDMS moule répétitions peuvent être faites pour presque n’importe quelle géométrie sans porte-à-faux (qui inhiberaient le retrait sans un moule multi-part, qui déborde le cadre de ce manuscrit) et qui s’inscrit dans les dimensions du lit laser.
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Protocol
1. créer les dessins de moule Master Format vectoriel
- Assembler la géométrie souhaitée moule en format vectoriel à l’aide d’un programme de graphiques vectoriels (voir matériel, équipement et logiciel de tableau). Sélectionnez le fichier | Nouveau et créer une toile de dimensions appropriées avec le format de couleur RVB. Créer la géométrie souhaitée à l’aide des outils de forme dans le panneau de gauche : entrez les dimensions voulues en haut de la fenêtre (cliquez sur le bouton transform en haut si pas initialement visible) de définir précisément la taille de la forme.
Remarque : Les géométries de moule devraient permettre au moins une bordure de 6 mm entre le bord des caractéristiques plus externe et la ligne de coupe permettant l’ajustement du ménisque PDMS après la coulée du moule. Cela permettra le moule fini à ras du fond d’une boîte de Petri. En outre, moule géométries prenne des limites de l’examen associé au modèle de coupe de laser qui est utilisé, y compris la largeur de trait de scie et de la taille de l’élément minimal. Le laser utilisé pour l’ouvrage décrit ci-après (voir matériel, équipement et logiciel Table) en vedette une largeur de trait de scie de 0,2 mm et d’une taille minimale gravé de 25 µm (DPI maximum de 1 000). Dimensions du moule peuvent être choisies pour accueillir un récipient de culture souhaité, par exemple un plat de 10 cm ou 6 ou 24 puits plaques. - Ouvrez le sélecteur de couleur dans le coin supérieur gauche de la fenêtre et définir de nouvelles nuances de couleur compatibles avec les logiciels de coupe laser.
Remarque : Nous utilisons rouge (RVB 255, 0, 0) pour la coupe et bleu (RGB 0, 0, 255) pour la gravure. Nuancier supplémentaires peut être définies selon les exigences de conception (par exemple, si plus d’une gravure profondeur est souhaitée).- Assigner ces couleurs de swatch aux chemins de découpe en sélectionnant le chemin, puis la coupe swatch pour la couleur du chemin d’accès et [Aucun] pour la couleur de remplissage du sélecteur de couleurs.
- De même, attribuer couleurs swatch à chemins de gravure en sélectionnant l’objet, puis le chemin de la gravure pour la couleur de remplissage et [Aucun] pour la couleur du chemin d’accès du sélecteur de couleurs.
- Enregistrer les dessins comme formats de fichier or.pdf either.ai, selon le vecteur graphique programme et laser cutter compatibilité (Figure 1 a et Fichier supplémentaire).
2. laser coupe les moisissures du maître de l’acrylique
- Sélectionnez un matériau moule maître négatif.
NOTE : Quart de pouce épais acrylique est bien adapté à cette demande en raison de sa compatibilité avec la découpe au laser, coût relativement faible et l’épaisseur qui permet pour les fonctionnalités jusqu'à ~ 5,5 mm de hauteur. Toutefois, autres matières qui remplissent les conditions suivantes peuvent être utilisées aussi bien : (i) Non réactif avec PDMS polymérisation ; (ii) Non-poreux/fortement adhésif au PDMS durci ; (iii) coupe et etches proprement avec une coupe au laser ; (iv) maintient un vitreux état jusqu'à 60 ° C ; (v) d’une épaisseur compatible avec la hauteur de la fonctionnalité maximale souhaitée. - Préparer la coupe au laser pour la découpe selon les spécifications du fabricant. S’assurer qu’une ventilation suffisante est utilisée et que la hauteur du lit est calibrée correctement à l’épaisseur du matériau choisi moule maître négatif.
- Ouvrez le fichier de conception dans un programme graphique de vecteur sur l’ordinateur connecté à la coupe au laser, puis cliquez sur fichier | Impression. Veiller à ce que la coupe au laser est définie comme l’imprimante et que «Faire pas échelle» est sélectionné dans la mise à l’échelle déroulante du menu pour éviter des distorsions du dessin avant de cliquer sur le bouton imprimer au bas de la boîte de dialogue d’impression.
- Dans l’utilitaire d’impression laser cutter, cliquez sur le bouton paramètres dans le coin inférieur droit. Attribuer la puissance, vitesse et impulsions par pouce (PPP) paramètres pour chacune des couleurs choisis précédemment pour définir les paramètres de coupe/etch pour toutes les caractéristiques de conception.
NOTE : Ici, la coupe au laser équipé d’un 75 W laser (voir matériel, équipement et Table de logiciels), les paramètres utilisés de ce qui suit : 100 % de la puissance, la vitesse de 1 % et 1 000 PPP traverse proprement ¼" acrylique ; 100 % de la puissance, la vitesse de 8 % et 500 PPI etches jusqu'à une profondeur de 2,75 mm en acrylique ; et 5 % de 100 % de puissance, vitesse, PPI 500 gravures jusqu'à une profondeur de 3,50 mm en acrylique. Si inconnu pour une configuration de coupeur de laser ou de la matière, ces paramètres peuvent être déterminées empiriquement par tâtonnement avec une éprouvette. - Cliquez sur le gros bouton vert dans le logiciel de coupeur de laser au laser etch et couper les moules maîtres négatifs.
- Préparer les moules maîtres négatifs pour la coulée de PDMS en enlevant tous les débris résiduels découpe avec petites brosses et/ou d’air comprimé (Figure 1 b).
3. Préparez les moules PDMS cellulaire ou de Culture de tissus
- Préparer un mélange de coulée de PDMS selon son fabricant. Préparer 0,35 mL/cm2 de maître moule ; Cela variera selon les caractéristiques de moule et de la hauteur.
- Degas le PDMS disposés dans une chambre à vide reliée à une ligne de vide de laboratoire standard (< 500 mmHg) pendant 1 h ou jusqu'à ce que toutes les bulles ont été éliminés.
- Le bord extérieur du moule avec le vinyle ou le ruban adhésif de masquage (étiquette couleur ruban fonctionne bien) de bande telles que la bande s’étend > 3 mm au-dessus du visage gravé du maître moule négatif. Appuyez sur la bande fermement contre la paroi du moule pour éviter les fuites par la suite.
Remarque : Si le moule acrylique maître dispose de trous, il peut être nécessaire d’appliquer du ruban adhésif au fond du moule ainsi (Figure 1). - Napper le PDMS dégazé le visage gravé du maître moule négatif.
Remarque : La cible épaisseur PDMS dépendra de l’application, bien qu’épais PDMS moule à fond peut rendre difficile d’imagerie. Une épaisseur minimale de ~ 1,5 mm établit un bon équilibre entre les considérations d’imagerie et la facilité de déplacement de moule. - Placer le moule maître négatif PDMS-enduit dans une chambre à vide et dégazer à nouveau pendant 1 h ou jusqu'à ce que toutes les bulles ont été éliminés.
- Placer le le dégazé PDMS-enduit négatif maître moule dans un four à 60 ° C pendant au moins 6 h. Assurez-vous que la grille soit de niveau. Alternativement, permettre le PDMS guérir à 37 ° C durant la nuit, ou à température ambiante ~ 72 h.
- Si plusieurs moules ont été déposés sur le même moule maître négatif, utilisez un rasoir pour couper ces moules apart alors qu’ils sont toujours sur le moule de maître négatif. Ensuite, éplucher chaque moule PDMS hors du moule négatif de maître. Que les moules PDMS sont obtenus lentement et avec précaution pour éviter que moule fonction déchirement lors de la collecte.
- À l’aide d’une lame de rasoir, coupez la régions avec le ménisque du moulage, ce qui empêcherait le moule de menteuse matériau plat, ainsi que tout excès ou débris (Figure 1).
- Si nécessaire, préparer des moules pour la coulée de cellules/tissus par autoclavage.
4. Monter le collagène et la fibrine hydrogels tissus
Remarque : Utilisez une procédure appropriée aseptique pour maintenir la stérilité.
- Respecter les moules au fond du navire souhaité. Respecter les nouveaux moules au fond d’une plaque traitée sans culture tissulaire en appuyant fermement sur le moule contre le plastique non traité (en raison de l’hydrophobicité du PDMS).
Remarque : Toutefois, si la culture de tissus traités en polycarbonate est destiné à être utilisé, ou dans le cas des moules ré-utilisés, qui ont tendance à moins tenir fermement, une colle naturelle ou synthétique (par exemple la fibrine ou silicone mastic durci pendant la nuit) peut être utilisée pour assurer la fixation. - Préparer le fibrinogène, la thrombine et neutralisé collagène coulée des solutions telles que la concentration désirée de chacun se réalisera dans le tissu de la fonte. Conservez les collagène sur la glace jusqu'à la coulée.
NOTE : Fibrinogène et thrombine ne puissent pas se mélanger jusqu'à ce que juste avant la coulée. Si nécessaire, les solutions de fibrinogène et de thrombine peuvent également être réfrigérées pour rallonger le temps de polymérisation. Nous avons utilisé une concentration de fibrinogène final entre 0-8 mg/mL, une concentration de thrombine final entre 10 et 100 U/mL et une concentration finale de collagène entre 0,8 - 2,0 mg/mL (Figure 2). Pour les tissus cardiaques machinés, nous utilisons souvent des cardiomyocytes à 12 x 106 cellules/mL avec 1,6 mg/mL, fibrinogène 4 mg/mL et 20 thrombine U/mL (la thrombine est ajoutée immédiatement avant la coulée). Des concentrations optimales (même en dehors de ces plages suggérées) devraient être déterminées empiriquement. - Récolter les cellules à la suite de protocoles standard et remettre en suspension à une concentration appropriée atteindre la densité de la cellule initiale souhaitée dans le tissu de la fonte.
Remarque : Les cardiomyocytes dérivés de cellules souches humaines pluripotentes induites ont été récoltés comme décrit dans Lian et al. 9 maintenir les cellules récoltées sur la glace. Volume cellulaire doit être comptabilisé lors de la préparation de la suspension cellulaire. Nous avons utilisé des concentrations de cellules allant de 9 à 18 x 106 cellules/mL, même si les gammes optimales sont censés varier avec la population de cellules (Figure 2). - Combiner le fibrinogène, collagène neutralisé et suspension de cellules (Voir l’étape 4.2 pour obtenir un exemple) pour créer un mélange de coulée. Garder le mélange de coulée sur la glace.
Remarque : Les concentrations et les températures de fibrinogène et de thrombine déterminera cinétique de polymérisation ; afin d’éviter la polymérisation lors de la coulée, il peut être nécessaire préparer des lots séparés du mélange coulée selon le nombre et le volume des constructions qui seront jetés. - Traiter les surfaces du moule qui seront exposées au mélange coulée pour atténuer l’hydrophobicité PDMS (hydrophobie PDMS augmentera l’adsorption de protéines et compliquent la coulée).
- Réaliser des modification de surface hydrophile en traitant avec le plasma d’oxygène, comme avec un générateur portatif haute fréquence (par exemple, BD-20 a de Litton Engineering). Exposer toutes les surfaces du moule et entrer en contact avec le mélange de cellule/gel pour le traitement du plasma pour 3-5 s, environ 5 min avant le moulage.
- Vous pouvez également traiter avec un agent tensio-actif, comme Pluronique F-127 (1 % p/v)10. Effectuer le traitement de surface comme proche le temps d’incantation que possible, comme le changement de polarité se détériorera au fil du temps.
- Immédiatement avant la coulée, ajouter la thrombine au mélange de coulée et mélanger soigneusement en pipettant également monter et descendre sans introduire des bulles.
- Travailler rapidement, pipette le mélange de coulée dans les moules, à l’aide de soin de déposer le mélange dans tous les coins et les crevasses du moule. Éviter la pipette d’éjection au-delà de la première étape pour éviter la formation de bulles à l’intérieur des constructions.
- Répétez les étapes 4.6 et 4.7 comme nécessaire pour n’importe quel lots supplémentaires de mélange de coulée.
- Placer le récipient de culture de tissus dans un incubateur à 37 ° C pendant 45 min. Si l’incubateur n’est pas bien humidifié, déposer les milieux cellulaires autour des moules avant l’incubation pour prévenir la déshydratation de la construction.
Remarque : Le type de média portable dépendra de type cellulaire, mais pour les constructions de l’ingénierie tissulaire cardiaque nous utilisons RPMI 1640 + supplément B27. - Après 45 min, retourner les constructions à la hotte et le recouvrir avec les milieux cellulaires avant de retourner à l’incubateur.
- Changer le support de cellule toutes les 48 à 72 h selon les besoins pour la cellule et construire type.
Remarque : Le changement de support doit être planifié selon les instructions recommandées communiquées par le fournisseur afin d’assurer la santé cellulaire maximale. Faites attention lorsque vous changez les médias pour ne pas perturber les constructions. Nous n’avons pas connu de problèmes avec constructions flottantes, mais dans ce cas, elle peut être prévenue en ajoutant des hauts postes à la conception du moule qui s’étendent au-delà du niveau de médias. - Après utilisation, lavez les moules séquentiellement avec eau de Javel 10 %, éthanol à 70 % et de l’eau distillée. Puis l’air sec et autoclave pour réutiliser jusqu'à ~ 10 fois.
5. analyse Techniques : Tissu compactage
NOTE : Compactage résultant de remodelage de la matrice est un indicateur de la viabilité des tissus et du développement qui peut être facilement mesuré à travers l’optique microscopie et analyse d’images.
- Recueillir des images de microscopie optique des constructions dans les moules à des incréments de temps allant de 2 h à 96 h après la coulée.
Remarque : En raison du faible degré de grossissement requis, un microscope à dissection avec une monture de la caméra est bien adapté à cette application. - Tracer la zone de construction visible dans une suite de l’analyse d’image comme ImageJ (OpenSource, imagej.nih.gov/ij/).
- Analyser le taux et le degré final de compactage (Figure 2).
6. analyse Techniques : Essai de traction
Remarque : Les deux actif mécanique (forces ou souches générées par un tissu machiné en raison de l’activité des cellules) et passive mécanique (forces ou souches générées en réponse à des souches appliquées ou forces) est des caractéristiques fonctionnelles critiques d’un grand nombre d’ingénierie tissus et c’est particulièrement vrai pour les tissus cardiaques machinés. L’analyseur de micromécanique utilisé pour les analyses est décrite dans la Table des matières. Autres appareils d’essais mécaniques pourraient être appliquées de la même façon en supposant qu’ils permettent d’essai hydraté et sont en mesure de contrôle de la longueur et forcer les mesures sur les plages et les résolutions pertinentes pour le tissu. Pour tissus avec des coupes transversales sur l’ordre unique millimètres carrés et les raideurs de l’ordre de dizaines de kPa, une cellule de charge de 5 mN est un bon ajustement. Des matériaux plus gros et plus rigides exigerait une plus grande cellule de pesage. Avant l’essai, veiller à ce que le capteur de force et le contrôleur de longueur sont correctement calibrés.
- Tourner sur le contrôleur de la longueur, la force transducteur, générateur d’impulsions et régulateur de température.
- Remplissez la cuve d’essai mécanique avec une solution de Tyrode (1,8 mM chlorure de calcium, chlorure de magnésium de 1,0 mM, chlorure de potassium de 5,4 mM, 140 mM chlorure de sodium, phosphate de sodium de 0,33 mM, 10 mM HEPES et glucose 5 mM FD2O, pH ajusté à 7,4) pour ingénierie des tissus cardiaques. Ajuster le thermocouple telle qu’une température de bain de 37 ° C est atteinte.
- Charger un protocole d’essai mécanique de collecte de données de la contraction active.
NOTE : Nous avons évalué mécanique contractile active en utilisant un protocole d’étape de longueur dans quelle longueur d’étapes de 5 % de déformation augmente jusqu'à 30 % sont détenus pour 120 s pour évaluer l’impact de la souche sur la force de contraction (Figure 3 a). En outre, nous avons évalué les propriétés mécaniques passives via un protocole de tirer-à-break à un taux de déformation constante de 10 % de souche/min (Figure 3 b). Deux de ces protocoles peuvent servir de bons points de départ pour l’analyse mécanique active et passive. - Dans un cadre de dissection, soigneusement détacher la construction de l’ingénierie tissulaire du moule de PDMS, tel qu’il est flottant librement.
NOTE : Cellularized des constructions qui ont subi une compaction tissulaire seront probablement déjà détachées de la surface du moule intérieur, et dans ces cas, une manipulation minimale est requise.- Si le compactage n’a pas causé la construction à libérer, à utiliser des pinces pour séparer délicatement la construction sur les côtés et le fond du moule pour éviter d’endommager le tissu.
- Avec une pincette, doucement ramasser la construction et la transférer au bain essai mécanique.
- Visualisez la construction à travers un microscope à dissection, monter des extrémités de la construction aux crochets attaché au capteur de force et le bras de levier.
- Ajustez la position de bras de levier avec le micromanipulateur jusqu'à ce que la construction est positionnée sans déformation appliquée. Zéro le contrôleur de la longueur et la force de contrôleur.
- L’image de la construction par le biais de l’étendue de la dissection afin que les dimensions de la construction peuvent être mesurées par analyse d’image.
- Initier le protocole force active et sauver la collecte des données une fois que le protocole a été réalisée (Figure 3).
- Si des données mécaniques passives sont nécessaires aussi bien, ajuster à nouveau le bras de levier jusqu'à ce qu’il n’y a nulle contrainte appliquée. Zéro la longueur et forcer les contrôleurs et l’image de la construction une seconde avant le chargement et le lancement du protocole mécanique passive (Figure 3). Enregistrer les données recueillies.
7. analyse Technique : Histologie de la paraffine et immunohistochimie
Remarque : Nous avons eu le plus grand succès dans l’imagerie des sections de tissu machiné en utilisant des blocs de paraffine pour que la morphologie tissulaire est mieux préservée. Toutes les étapes du processus doivent être soigneusement considérés et adaptées au tissu machiné, y compris le traitement des échantillons sans pression ou dépression, empiriquement détermine les méthodes d’extraction approprié antigène et titrage des anticorps primaire concentration. Autres techniques, telles que l’utilisation de blocs congelés pour la préparation de diapositives, peuvent exiger le moins de temps et dépense tout en produisant des résultats suffisants selon l’application prévue.
- Dans un cadre de dissection, soigneusement détacher la construction de l’ingénierie tissulaire du PDMS moule avec une pincette glissé entre la construction et du PDMS à séparer doucement de la PDMS, tel qu’il est flottant librement. Transférer ces constructions dans un tube de microcentrifuge de fixation.
NOTE : Les constructions fragiles ou celles qui sera fixée en vertu de la condition de contrainte statique fournie par le moule lui-même peuvent être fixées dans le moule en changeant des solutions dans la culture bien et en enlevant la construction du moule après fixation. - Fixer immédiatement les tissus machinés en immergeant dans 4 % de paraformaldéhyde (PF) pendant 10 min à température ambiante. Estimer pas plus de 1 h par 1 mm d’épaisseur de tissu ; ne fixez pas trop.
- Rincer les tissus avec du sérum physiologique tamponné au phosphate (PBS).
- Garder le tissu humide, déposer une goutte de l’éosine dessus pour souiller rose pour les 10-30 s et puis rincer avec de l’éthanol à 70 %.
Remarque : La couleur rose permet de l’identifier dans le bloc de paraffine pour le sectionnement plus tard et va être emportée pendant déparaffinage. - Enroulez le tissu en papier lentille et place dans une cassette de l’histologie. Utiliser des coussinets en mousse dans la cassette au besoin pour maintenir le tissu plat.
- Submerger la cassette dans 70 % EtOH et conserver à 4 ° C jusqu’au moment pour le traitement de paraffine.
- Traiter le tissu de la déshydratation en augmentant les concentrations d’éthanol (2 x 30 min chacun de 70, 95 et 100 %). Puis se baigner échantillons dans trois bains de xylène séquentiel pour chaque 30 min.
- Submerger les échantillons dans trois bains de paraffine séquentiel pour chaque 30 min.
- Réchauffer les cassettes, soigneusement déplier et enlever les tissus colorés à l’éosine dans l’étude de la lentille et incorporer le tissu s’est infiltré dans la paraffine dans un bloc de paraffine. Veillez à jeter l’échantillon plat sur le fond du moule pour permettre la découpe plus facile.
- Les tissus à l’aide d’un microtome comme désiré (5-8 µm d’épaisseur) de l’article et les taches à l’aide de procédures standard optimisés pour l’ingénierie tissulaire (Figure 4).
NOTE : Une alternative aux sections de paraffine est d’utiliser des blocs congelés, bien que la morphologie de l’échantillon peut être compromise. Placer les constructions fixes dans 30 % de saccharose en PBS pendant 3 heures ou jusqu'à ce que le spécimen est équilibré (par exemple, du jour au lendemain). Échanger la solution avec 50/50 v/v 30 % de saccharose et de la température de coupe optimale (OCT) congélation moyen pour 1 h. Placer les constructions en blocs congelés avec OCT congélation moyen à l’aide d’un 70 % EtOH avec coulis de glace sèche rapide bloc congélation dans des plateaux en plastique. Section des blocs avec un cryostat à coupes épaisses de 10 à 50 µm.
8. l’analyse Technique : Alignement de cellule
Remarque : Manipuler la forme tissulaire et les champs de contraintes internes peut moduler l’alignement de cellule, une caractéristique déterminante de nombreux tissus natifs.
- Préparer les constructions de l’ingénierie tissulaire dans les moules PDMS avec géométries d’intérêt.
- À la fin de la période de culture, laver les constructions dans du PBS, difficulté à 4 % PF (voir étape 7.2) et récolter des constructions à préparer pour l’imagerie en coupes et histologie (voir Section 7) ou monter toute coloration.
NOTE : Support entier coloration suit des étapes similaires à histologie/immunohistochimie mais exige de plus longues périodes d’incubation et la profondeur de pénétration de colorants, les anticorps et les techniques d’imagerie (par exemple la profondeur de pénétration de la lumière dans les constructions) sera doivent être déterminées empiriquement pour la composition de la construction. - Orienter les coupes de tissus dans le plan horizontal (parallèle au plan du fond du moule) et tache d’un marqueur pour la cellule d’intérêt. Utilisez une étiquette d’actine f, tels que la phalloïdine, pour marquer les fibres de stress d’actine de la plupart des types de cellules. Vous pouvez également utiliser un marqueur spécifique de la cellule.
Remarque : Dans le cas des tissus cardiaques machinés, orientation dépendait de sarcomères colorées avec le α-actinine. - Évaluer l’axe principal de toutes les cellules ou les noyaux dans la région d’intérêt manuellement ou en utilisant une analyse outil (p. ex., ImageJ, MATLAB).
Remarque : Il peut être utile de classer les différentes régions de la même construction, selon la géométrie comme (« node » et « bundle » régions dans une géométrie de maille-comme, ou « core ») et « edge » dans une géométrie circulaire.
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Representative Results
L’optique de la coupe au laser provoque des zones gravées ont très légèrement diminué dimensions comme l’augmentation de la profondeur de gravure, et résultats dans moule à parois avec un biseau très subtil, dû à effiler du faisceau laser. Cela contribuera à faciliter l’élimination des moules PDMS cast, mais doivent être examiné attentivement si profondément gravé moules maîtres négatifs (> 6 mm) sont nécessaires (Figure 1).
Au fil du temps dans la culture, les constructions cellularized comprimera en raison de la matrice, une rénovation, bien que le rythme et l’étendue à laquelle cela se produit dépendra de la composition de l’échafaudage, charge de la cellule et des conditions de culture.
Remodelage de la matrice peut se produire par le biais de réorganisation et de dégradation de l’environnant matrice (ainsi que le dépôt de la nouvelle matrice), mais est généralement associée à une augmentation de la rigidité mécanique due à la diminution de section transversale. Avec les constructions de collagène uniquement composées de collagène de 1,6 mg/mL et 12 x 106 cardiomyocytes/mL, on voit des constructions compactes à 19,7 ± 2,8 % de leur largeur initiale pendant les quatre jours après la coulée (Figure 2) par l’intermédiaire de l’essai de compactage. Ce test donne une approximation 2D représentante un processus 3D, la facilité de collecte de données et de la nature non destructifs rendent un outil puissant pour l’étude du processus de développement de construction. Notez que dans les conditions de culture cellulaire, même en l’absence de cellules, mécanique de collagène peut changer au fil du temps en raison de deux auto-assemblage et réticulation11. Fibrine peut être rapidement dégradée par la fibrinolyse fois in vivo et in vitro si pas en présence d’un antifibrinolytiques, tels que l’aprotinine ou aminocaproïque acide12. Par conséquent, l’impact des éléments d’échafaudage sur le développement des tissus à long terme et pas seulement la formation de tissu, devrait considérer lors du choix d’une formulation de construct. Si taille tissu final est important pour une application spécifique, compactage doit également considérer dans la conception du moule et empiriquement déterminé basé sur la composition de type et de la matrice cellulaire. Notez que le compactage des tissus peut également induire des champs de contraintes dans les tissus, qui peuvent être manipulées dans des constructions cellularized à encourager l’alignement des cellules (Figure 4).
Une large gamme de concentrations de polymère d’échafaudage et cellule initiale des densités de semis ont été utilisées pour créer des tissus conçus dans la littérature, et ceci peut être attribué principalement à des exigences différentes pour différents types de cellules, lignées cellulaires et les applications. Basé sur notre propre travail avec cardiomyocytes dérivés de hiPSC, nous croyons qu’une concentration de collagène de 1,25 mg/mL et une densité de semis de ~ 15 millions de cellules/mL est un bon départ point13. Alternativement, fibrine est largement utilisé comme un matériel d’échafaudage de tissu cardiaque ainsi, typiquement de l’ordre de 3-4 mg/mL,14. Cellule de densité de semis peut-être être sélectionné basés sur un certain nombre de facteurs en fonction de l’application, mais la densité des cellules des tissus natifs fournit un bon point de référence. Aussi tenir compte que des solutions hautement concentré cellulaire peuvent devenir difficiles à travailler, surtout pour les petits volumes. Pour une population de cellule en particulier, la formulation de l’échafaudage peut être ajustée ; généralement par augmentation de la concentration de polymère lorsque les tissus sont trop fragiles ou briser après compactage et augmentation de la concentration de polymère lorsque les tissus sont trop raides ou ne parviennent pas à compacter15.
Avant d’effectuer les analyses mécaniques passives à tout moment point durant la culture, il peut être approprié pour l’exemple de la construction mécanique. Préconditionnement des hydrogels de polymère naturel et tissus machinés augmentera la reproductibilité du test résultat en raison de la viscoélasticité matériel et fournir une meilleure indication des propriétés qui la construction exposera dans une clinique demande. Nous employons 8 cycles de 10 % de déformation dans une forme d’onde triangulaire à un taux de 10 % de souche/min avant de commencer l’évaluation mécanique (Figure 3).
Tissus et cellules-type de morphologie spécifique peut être évaluée par le biais de l’histologie et l’immunohistochimie avec des méthodes traditionnelles. Cependant, nous avons trouvé que l’optimisation de presque toutes les étapes de la paraffine traitement, enrobage, de sectionnement, recherche d’antigène et de coloration ont été nécessaires pour le tissu cardiaque machiné par rapport à plaqué cellules ou sectionnés natif tissulaire (Figure 4).
Figure 1 : Aperçu du processus de conception et de préparation des moules PDMS de laser cut maîtres acryliques. (A) conception préparée en format de graphiques vectoriels de moule. (B) nettoyé maître négatif acrylique gravé au laser. PDMS (C) monter à la surface du moule maître ruban adhésif acrylique. (D) qui en résulte PDMS moule prêt pour la stérilisation avant la culture de tissus. En médaillon : vue de dessus, même à l’échelle. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Construire le tassement au fil du temps dans la culture. (A) des Images de constructions rectangulaires préparées en compactage en triple au fil du temps dans la culture. Superpositions de vert représentent des masques utilisés pour calculer l’aire de construction visibles pour l’analyse de l’image. (B) terrain de construction zone (une métrique bidimensionnelle de compactage construct) au fil du temps. Lignes horizontales représentent les valeurs moyennes et les barres d’erreur indiquent l’écart-type. Pour tous les groupes, n = 3 et * indique p < 0,05 telle qu’évaluée par analyse de la variance. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Traces de raw pour la caractérisation mécanique des tissus cardiaques machinés. Encarts affichent une trace de contraction contraction représentant unique (mêmes axes comme intrigue principale). (A) une réponse mécanique Active résultant de mesures rapides suivies de cales par tranches de 5 % de déformation. (B) réponse mécanique passif résultant d’un test de traction-à-break à un taux de 10 % de souche/min. Tous les échantillons ont été analysés dans un bain de solution Tyrode de 37 ° C. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Paraffine bloquer les images d’histologie des constructions d’ingénierie tissulaire cardiaque de différents modèles. Paraffine bloc histologie images pour des constructions de tissu cardiaque machiné de diverses conceptions colorées avec (A) l’hématoxyline et éosine, (B) diaminobenzidine (cardiaque troponine T, brun) et l’hématoxyline contre-colorant nucléaire (C ) picrosirius rouges tache pour le collagène avec vert rapide contre-colorant cytoplasmique et anticorps d’anti-α-actinine de souris (D) (vert) et 4', 6-diamidino-2-phénylindole contre-colorant de (DAPI) nucléaire (bleu). Alignement de la cellule se distingue à la suite de la compaction de construction design et tissus. Echelle a s’applique aussi bien aux B et C. Encart dans D montre des cardiomyocytes striés. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Des géométries de moule PDMS personnalisés qui sont compatibles avec la culture de tissu ont grande utilité dans le réglage des propriétés de l’important tissu machiné, tels que l’alignement de la cellule, le taux de diffusion et rigidité effective. En outre, ces moules sont très utiles pour la préparation des tissus pour des applications d’analyse où la géométrie est importante, tels que mécanique test16,17. Préparer ces dispositifs laser coupe moules maître négatif offre une méthode rapide, facile et peu coûteux d’utiliser ces outils, en particulier par rapport à l’heure et le coût associé à la microfabrication traditionnelle. Découpe au laser permet également une plus grande taille de moule maximale, limitée seulement par la taille du lit de la fraise. Nous avons utilisé avec succès ces moules polyvalents pour exécuter une grande variété d’études avec les tissus cardiaques machinés, y compris la cartographie optique de propagation du potentiel d’action, l’évaluation de la force de production et passive des propriétés mécaniques et l’implantation dans un modèle de rat de l’infarctus du myocarde13,18. Nous reconnaissons que, au-delà de la niche de recherche d’ingénierie régénératif cardiovasculaire, les demandes pour l’ingénierie tissulaire champs, administration de médicaments et recherche sur les matériaux sont vastes.
Bien qu’il existe quelques étapes difficiles techniquement dans la fabrication des moules eux-mêmes, il y a un certain nombre d’étapes critiques liées à la création des tissus fonctionnels. Si des constructions échouent à compacter la matrice environnante après 24h, tout d’abord confirmer la viabilité cellulaire par la souillure de la viabilité des tissus techniques. Si la viabilité cellulaire est élevée, envisager de modifier la composition de construction pour la prochaine série de tissus. Alors que les résultats varient grandement selon la population cellulaire, nous avons observé la compaction accrue associée à des densités de semis plus élevées et des concentrations plus faibles de collagène. Enfin, il peut également être utile compléter la population cellulaire ensemencée avec un type de cellule bien adapté pour le remodelage de la matrice, comme les fibroblastes, afin d’encourager le compactage.
Une des limites de ces moules est le potentiel de PDMS adsorption des petites molécules hydrophobes. Alors que pour nos applications, cela n’a pas été problématique, il peut être préoccupante dans les essais très sensibles à la perte de ces molécules. Dans ces cas, adsorption de protéine PDMS peut être atténuée par un traitement avec un agent anti-encrassement tels que polyhydrophilic ou polyzwitterionic matériaux19. Par ailleurs, un moule PDMS stérilisé pourrait être établi comme un maître négatif (partir d’un moule positif gravé au laser) pour un moule de culture, d’être jeté dans une autre, non adsorbant matériel, tels que l’agarose.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient financement du NIH R00 HL115123 et Brown University School of Engineering. Ils sont également reconnaissants à l’atelier de création de Brown et Chris Bull pour la formation et de soutiennent avec la coupe au laser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Item | |||
| Bovine fibrinogen | Sigma | F8630-5G | Constructs |
| Bovine thrombin | Sigma | T6634-250UN | Constructs |
| Bovine aprotinin | Sigma | 10820-25MG | Constructs |
| Rat tail collagen I, 4 mg/mL | Advanced Biomatrix | 5153-100MG | Constructs |
| Sodim chloride | Fisher | BP358-10 | Constructs |
| PBS | Life Technologies | 14190-250 | Constructs |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Constructs |
| Sylgard 184 silicone elastomer | Corning | 4019862 | PDMS Molds |
| Lab tape | Fisher | 15-901-5R | PDMS Molds |
| Acrylic, 1/4" thick | McMaster-Carr | 8560K356 | PDMS Molds |
| HEPES Buffer, 1 M | Sigma | H3537-100ML | Constructs |
| RPMI 1640 medium, powder | Fisher | 31800-089 | Constructs |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher | AC423520250 | Constructs |
| Magnesium chloride hexahydrate | Fisher | M33 500 | Constructs |
| Potassium chloride | Sigma | P9541-500G | Constructs |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9390-500G | Constructs |
| Glucose | Sigma | G5767-25G | Constructs |
| OCT | VWR | 25608-930 | Histology |
| Frozen block molds | VWR | 25608-916 | Histology |
| Hematoxylin | Fisher | 3530 1 | Histology |
| Eosin Y | Fisher | AC152880250 | Histology |
| Fast green FCF | Fisher | AC410530250 | Histology |
| Software | |||
| Illustrator | Adobe Systems | Vector Graphics | |
| Inkscape | (Open Source) | Vector Graphics | |
| UCP (Universal Control Panel) | Universal Laser Systems | Laser Cutter Interface | |
| Equipment | |||
| PLS6.75 Laser Cutter | Universal Laser Systems | Laser Cutter | |
| Micromechanical Analyzer | Aurora Scientific | 1530A with 5 mN load cell | Mechanical Analysis |
References
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