Summary
Her presenterer vi en rask, lettvinte og rimelig metode for fabrikasjon egendefinerte polydimethylsiloxane former som kan brukes for å produsere hydrogel-basert utvikling vev med komplekse geometri. I tillegg beskriver vi resultatene fra mekaniske og histologiske vurderinger på utvikling hjerte vev produsert ved hjelp av denne teknikken.
Abstract
Som feltet for tissue engineering har fortsatt å modne, har det vært økt interesse for et bredt spekter av vev, inkludert vev form. Manipulere vev figuren på mikrometer centimeter skala kan direkte cellejustering, endre effektiv mekaniske egenskaper, og ta begrensninger knyttet til nærings diffusjon. I tillegg kan fartøyet der en vev er forberedt formidle mekanisk begrensninger på tissue, resulterer inne stress felt som kan videre påvirke både celle og matrix struktur. Formet vev med svært reproduserbar dimensjoner har også verktøy for i vitro analyser i som eksempel er kritisk, som hele vev mekanisk analyse.
Dette manuskriptet beskriver en alternativ fabrikasjon metode bruker negative master muggsopp forberedt fra laser etset akryl: disse formene skikkelig med polydimethylsiloxane (PDMS), tillate med dimensjoner centimeter skala og funksjonen størrelser mindre enn 25 µm, og kan raskt designet og fabrikkert koste og med minimal kompetanse. Minimal tid og kravene cost tillate laser etset former å være raskt iterated på til en optimal utforming bestemmes og enkelt tilpasses til å passe alle analysen av interesse, inkludert de utenfor feltet for tissue engineering.
Introduction
De siste to tiårene, har myk litografi vært brukt mye som en fabrikasjon teknikk for å støtte forskning, spesielt innen microfluidics, materiale og vev engineering1,2, 3. Kopi molding, som et objekt med en ønsket form er opprettet fra en negativ master mold, tilbyr en praktisk og rimelig metode for å produsere positive PDMS replikerer som kan brukes til støping formet hydrogels. Imidlertid kreves negativ master formene er vanligvis produsert med microfabrication teknikker som er dyrt, tidkrevende, begrenset størrelse, og krever rent rom og avansert utstyr. Mens 3D-utskrift tilbyr et potensielt alternativ, er det noe begrenset på grunn av oppløsningen grensene rimeligere og kjemiske samspillet mellom vanlige 3D-skriver polymerer og PDMS som kan hemme herding.
Laser kutter systemer i stand til både å kutte og etsing materialer som plast, tre, glass og metall har nylig blitt drastisk billigere og derfor mer tilgjengelig for fabrikasjon forskningsverktøy. Kommersiell karakter laser kniver er i stand til å fabrikere objekter på centimeter skala med minimum funksjoner mindre enn 25 µm og videre krever minimal opplæring, kompetanse og tid til å bruke. Mens laser ablasjon av PDMS har tidligere blitt brukt i produksjon av microfluidics enheter, vet har ingen manuskriptet beskrevet en prosess som millimeter og centimeter skala muggsopp kan fremstille fra laser cut negative master muggsopp4 .
Vi har brukt denne teknikken primært for å manipulere formen på utvikling vev for å forbedre nærings diffusjon, mobilnettet justering og mekaniske egenskaper5,6,7. Imidlertid tillater allsidighet av denne teknikken bruk i alle felt der støpte hydrogels er av interesse, som stoffet levering og materielle vitenskap forskning8. Tilgang til en laser cutter, PDMS mold gjentak gjøres nesten alle geometri uten overheng (det ville hemme uten en flerdelt mold, som er utenfor omfanget av dette manuskriptet) og som passer innenfor størrelsen på laser sengen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Opprett vektor Format Master Mold design
- Montere ønsket mold geometrien i vektor-format ved hjelp av en vektor grafikkprogram (se materialer, utstyr og programvare). Velg fil | Nye og opprette et lerret av aktuelle dimensjoner med RGB-fargeformat. Opprette ønsket geometri bruker formverktøyene i panelet til venstre: Angi ønskede dimensjoner på toppen av vinduet (Klikk knappen transform øverst hvis ikke vises umiddelbart) å definere nøyaktig figur størrelser.
Merk: Mold geometrier bør tillate for minst en 6 mm kantlinje mellom kanten av ytterste funksjonene og kutte linje å tillate trimmingen av den PDMS meniscus etter mold avstøpning. Dette vil tillate ferdig mold å legge flush med bunnen av en kultur parabol. Videre bør mold geometrier ta i betraktning begrensningene laser cutter modellen som skal brukes, inkludert kerf bredden og minste mønsterstørrelsen. Laseren som brukes for arbeidet som er beskrevet her (se materialer, utstyr og programvare) kjennetegnet 0.2 mm kerf bredde og en minimum etset mønsterstørrelsen for 25 µm (maksimal PPT 1000). Mold dimensjonene kan velges for en ønsket kultur fartøy, for eksempel en 10 cm rett eller 6 - eller 24-godt plater. - Åpne fargevelgeren i øvre venstre hjørne av vinduet, og Definer nye fargeprøver kompatibel med laser kutter programvare.
Merk: Vi bruker rød (RGB 255, 0, 0) for skjæring og blå (RGB 0, 0, 255) for etsning. Flere fargeprøver kan defineres avhengig av behov for design (for eksempel om flere etsing dybde er ønskelig).- Tilordne disse fargeprøve fargene til klipping baner ved å merke banen og deretter velge kuttet fargeprøven for banen fargen og [Ingen] for fyllfargen fargevelgeren.
- Tilsvarende tilordne fargeprøve farger til etsing baner ved å merke objektet og deretter velge etsing banen for fyllfargen og [Ingen] for banen farge fra fargevelgeren.
- Lagre design som either.ai or.pdf filformater, avhengig av vektor grafikk program og laser cutter kompatibilitet (figur 1A og Supplerende fil).
2. laser Cut akryl Master formene
- Velg en negativ master mold materiale.
Merk: Kvart tomme tykk akryl er godt egnet til dette programmet på grunn av kompatibilitet med laser cutting, relativt lav kostnad, og tykkelse som tillater funksjoner til ~ 5,5 mm inne høyde. Men andre materialer som oppfyller følgende krav kan brukes også: (i) ikke-reaktive med PDMS herding; (ii) ikke-porøse/sterkt lim til herdet PDMS; (iii) kutt og etches rent med en laser-kutter; (iv) opprettholder en glassaktig staten opp til 60 ° C; (v) av tykkelse kompatibel med ønsket maksimal funksjon høyden. - Forberede den laser cutter kutte i henhold til produsentens spesifikasjoner. Kontroller at tilstrekkelig ventilasjon brukes og at sengen høyden er riktig kalibrert til valgte negative master mold materialets tykkelse.
- Åpne filen design i et grafikkprogram vektorer på datamaskinen koblet til den laser cutter og klikk fil | Skriv ut. Sikre at laser kutteren er definert som skriveren og at "Gjør ikke skala" er valgt i skalering rullegardinmenyen å unngå forvrengning av før du klikker Skriv ut-knappen nederst i utskriftsdialogruten.
- I laser cutter utskrift verktøyet, klikker du på Innstillinger -knappen nederst i høyre hjørne. Tilordne kraft, hastighet og pulser per tomme (PPT) for hver av de tidligere valgte fargene til å angi kutt/etse parametere alle utformingsfunksjoner.
Merk: Her laser kutteren utstyrt med en 75 W laser (se materialer, utstyr og programvare), brukes innstillingene for følgende: 100% strøm, 1% hastighet og 1000 PPT skjærer rent gjennom ¼" akryl; 100% strøm, 8% hastighet og 500 ppt etches til en dybde på 2,75 mm i akryl; og 100% strøm, 5% hastighet, 500 ppt etches til en dybde på 3,50 mm i akryl. Hvis ukjent for laser cutter konfigurasjon eller materiale, kan disse parameterne bestemmes empirisk gjennom prøving og feiling med en test. - Klikk den store grønne knappen i laser kutter programvare å laser etch og kutte negative master formene.
- Klargjør negative master formene for PDMS avstøpning ved å fjerne eventuelle gjenværende kutte rusk med små børster og/eller trykkluft (figur 1B).
3. klargjør PDMS formene for cellen eller vev kultur
- Klargjør en PDMS avstøpning blandingen i henhold til produsentens spesifikasjoner. Forberede 0,35 mL/cm2 av master mold; Dette vil variere avhengig av mold funksjoner og høyde.
- Degas forberedt PDMS i et vakuum kammer koblet til en standard lab vakuum linje (< 500 mmHg) i 1 time, eller til alle bobler har blitt eliminert.
- Tape ytterkanten av mold med vinyl eller maskeringstape (fargeetiketten tape fungerer godt) slik at båndet strekker > 3 mm over etset ansiktet av negative master mold. Trykke båndet hardt mot siden av mold å hindre lekkasjer senere.
Merk: Hvis akryl master mold funksjoner gjennom hull, kan det være nødvendig å bruke tape til bunnen av mold også (figur 1 c). - Hell den degassed PDMS over etset ansiktet av negative master mold.
Merk: Målet PDMS tykkelse avhenger på programmet, men tykke PDMS mold bunner kan gjøre imaging utfordrende. Minimum tykkelse på ~ 1,5 mm slår en god balanse mellom tenkelig hensyn og brukervennlighet mold fjerning. - Plasserer PDMS-belagt negative master mold i et vakuum kammer og degas igjen i 1 time, eller til alle bobler har blitt eliminert.
- Plass degassed PDMS-belagt negative master mold i en 60 ° C ovnen til kur for minst 6 h. Kontroller at ovnen sokkelen er nivå. Eventuelt tillate PDMS å kurere på 37 ° C over natten, eller ved omgivelsestemperatur for ~ 72 h.
- Hvis flere former ble kastet på samme negative master mold, bruk et barberblad til å kutte disse formene hverandre mens de er fortsatt på negative master mold. Deretter skallet hver PDMS mold av negative master mold. Sikre at PDMS former er samlet sakte og forsiktig å hindre mold funksjonen rive under innsamling.
- Bruker et barberblad, klippe av regioner med menisk fra oppleggskanten, som ville hindre mold fra liggende flatt, samt alle overflødige materiale eller rusk (figur 1 d).
- Eventuelt forberede former for cellen/vev støping av autoklavering.
4. Legg kollagen og Fibrin Hydrogel vev
Merk: Bruk en riktig aseptiske prosedyre for å opprettholde sterilitet.
- Overholde formene til bunnen av ønsket fartøyet. Overholde nye former til bunnen av en vev kultur behandlet plate av fast trykke mold mot ubehandlet plast (på grunn av hydrophobicity av PDMS).
Merk: Men hvis vev-kultur behandlet polykarbonat som skal brukes, eller ved gjenbrukes formene, som pleier å følge mindre fast, en naturlig eller syntetisk lim (for eksempel fibrin eller silikon fugemasse kurert over natten) kan brukes til å sikre vedlegg. - Forberede fibrinogen og trombin men kollagen avstøpning løsninger slik at ønsket konsentrasjonen av hver vil bli oppnådd i felles vev. Holde kollagen på is til støping.
Merk: Fibrinogen og trombin skal ikke tillates å blande inntil umiddelbart før avstøpning. Om nødvendig kan også fibrinogen og trombin løsninger bli kjølt for å øke polymerisasjon. Vi har brukt en siste fibrinogen konsentrasjon mellom 0-8 mg/mL, en siste trombin konsentrasjon mellom 10-100 U/mL, og en siste kollagen konsentrasjon mellom 0,8 - 2,0 mg/mL (figur 2). For utvikling hjerte vev, vi ofte bruker cardiomyocytes på 12 x 106 celler/mL 1.6 mg/mL, 4 mg/mL fibrinogen og 20 U/mL trombin (trombin legges umiddelbart før avstøpning). Optimal konsentrasjoner (selv utenfor disse foreslåtte områder) bør fastsettes empirisk. - Høste celler etter standardprotokoller og resuspend i en konsentrasjon som er hensiktsmessige for å oppnå ønsket første celle tettheten i felles vev.
Merk: Human indusert pluripotent Stamcelle-avledet cardiomyocytes ble høstet som beskrevet i Lian et al. 9 holde høstet cellene på is. Celle volum skal regnskapsføres når forbereder celle suspensjon. Vi har brukt celle konsentrasjonene varierer fra 9-18 x 106 celler/mL, men optimal områder forventes å variere med celle befolkningen (figur 2). - Kombinere fibrinogen, men kollagen, og cellen suspensjon (se trinn 4.2 for et eksempel) for å opprette en avstøpning blanding. Holde avstøpning blandingen på is.
Merk: Fibrinogen trombin temperaturer og konsentrasjoner avgjør polymerisasjon kinetics; for å hindre polymerisasjon under støping, kan det være nødvendig å forberede separate grupper av støping mix hvor mange og volumet av konstruksjoner som vil bli kastet. - Overflatebehandling av mold som vil bli utsatt til støping mix å redusere PDMS hydrophobicity (PDMS hydrophobicity vil øke protein adsorpsjon og gjør støping vanskelig).
- Oppnå hydrofile overflaten endring ved å behandle med oksygen plasma, som med en håndholdt høyfrekvent generator (f.eksBD-20A fra Litton Engineering). Avsløre alle overflater av mold som kontakt cellen/gel blandingen til plasma behandling for 3-5 s, ca 5 min før avstøpning.
- Du kan også behandle med avspenningmiddel, som Pluronic F-127 (1% w/v)10. Utføre overflatebehandling som nær avstøpning som mulig, som endringen i polariteten vil svekkes over tid.
- Umiddelbart før støping, legge trombin avstøpning blandingen og bland grundig ved pipettering opp og ned uten introdusere bobler.
- Arbeider raskt, Pipetter avstøpning blandingen i formene, bruke vare innskudd blandingen i alle hjørner og sprekker av mold. Unngå pipette utstøting utover første stopp å hindre boble dannes inne i konstruksjoner.
- Gjenta 4.6 og 4.7 som nødvendig for noen flere batcher avstøpning mix.
- Plass vev kultur fartøyet i en 37 ° C inkubator for 45 min. Hvis inkubatoren ikke er godt fuktet, sette inn cellen media rundt formene før inkubasjon å hindre konstruere dehydrering.
Merk: Cellen medietypen avhenger på celle type, men utviklet hjerte vev konstruerer vi bruke RPMI 1640 + B27 supplement. - Etter 45 minutter, tilbake sammensetningene til panseret og dekk med cellen media før retur til inkubator.
- Endre cellen media hver 48-72 h som trengs til cellen og konstruere type.
Merk: Media endring skal planlegges i henhold til anbefalte instruksjonene gitt av leverandøren for å sikre maksimal cell helse. Vær forsiktig når du endrer media for å unngå å forstyrre konstruksjoner. Vi har ikke opplevd problemer med konstruksjoner flytende, men hvis dette skjer, det kan forebygges ved å legge til høye innlegg mold design som går utover media nivået. - Bruk vaskes formene sekvensielt med 10% blekemiddel, 70% etanol, og destillert vann. Deretter luften tørr og autoklav for gjenbruk opptil ~ 10 ganger.
5. analyse teknikker: Vev komprimering
Merk: Komprimering som følge av matrix remodeling er en indikator på vev levedyktighet og utvikling som kan måles lett gjennom optisk mikroskopi og bildet analyse.
- Samle optisk mikroskopi bilder av konstruksjoner i formene på tidsintervaller mellom 2 h til 96 timer etter avstøpning.
Merk: På grunn av lav graden av forstørrelse kreves, disseksjon mikroskop med en kameraet montere er godt egnet til dette programmet. - Spore synlig konstruere området i et bilde analyse suite som ImageJ (åpen kildekode, imagej.nih.gov/ij/).
- Analysere rate og avsluttende grad av komprimering (figur 2).
6. analyseteknikker: Strekk Testing
Merk: Begge aktive mekanikk (styrker eller stammer generert av en konstruert vev på grunn av celle aktivitet) og passiv mekanikk (styrker eller stammer generert anvendt stammer eller styrker) er kritisk funksjonelle egenskaper av mange utvikling vev, og dette gjelder særlig for konstruert hjerte vev. Den micromechanical analyzer brukes for analysene er beskrevet i Tabellen for materiale. Andre mekaniske testing apparatene kan brukes på samme måte antar de tillater hydrert testing og er i stand til lengdekontroll og tvinge målinger over områder og oppløsninger relevante for vevet. For vev med cross-sectional områder på enkelt kvadratmillimeter og stiffnesses på titalls kPa er en 5 mN Last celle en god passform. Større og stivere materialer ville kreve en større belastning celle. Før testing, sørge for at både kraft svinger og lengde kontrolleren er kalibrert riktig.
- Slå på kontrolleren lengde, svinger, puls generator, og temperaturen kontrolleren.
- Fylle mekanisk testing bunnen med Tyrodes løsning (1,8 mM veisalt, 1.0 mM magnesiumklorid, 5.4 mM kalium klorid, 140 mM natriumklorid, 0,33 mM natrium fosfat, 10 mM HEPES og 5 mM glukose i ddH2O, pH justert 7,4) for konstruert hjerte vev. Justere thermocouple slik at en badevann 37 ° c er oppnådd.
- Laste inn en mekanisk testing protokoll for aktiv sammentrekning datainnsamlingen.
Merk: Vi har vurdert aktive kontraktile mekanikk benytter en lengde trinn protokoll som lengde trinnene i 5% stamme trinn opp til 30% holdes for 120 å evaluere virkningen av belastning på sammentrekning force (figur 3A). I tillegg har vi vurdert passiv mekaniske egenskaper gjennom en pull-til-break protokoll med en konstant press rate på 10% belastning/min (figur 3B). Begge disse protokollene kan tjene som gode utgangspunkt for aktive og passive mekanisk analyse. - Under en disseksjon omfang, koble nøye konstruert vev Konstruer fra PDMS mold, slik at det flyter fritt.
Merk: Cellularized konstruksjoner som har gjennomgått vev komprimering vil sannsynligvis allerede være løsrevet fra interiør mold overflater, og i slike tilfeller minimal manipulasjon er nødvendig.- Hvis komprimering ikke forårsaket Konstruer løslate, bruk tang til å forsiktig skille Konstruer fra sidene og bunnen av mold å unngå å skade vevet.
- Ved hjelp av pinsett, forsiktig plukke opp Konstruer og overføre den til mekanisk testing badekaret.
- Viser Konstruer gjennom disseksjon mikroskop, montere hver ende av Konstruer til krokene festet til force svinger og spaken armen.
- Juster spaken armen posisjon med micromanipulator til Konstruer plasseres uten anvendt belastning. Null lengde kontrolleren og tvinge kontrolleren.
- Bilde Konstruer gjennom disseksjon scope slik at dimensjonene av Konstruer kan måles via bildeanalyser.
- Starte aktive kraft protokollen og lagre de innsamlede dataene når protokollen er fullført (Figur 3).
- Hvis passiv mekanisk data kreves også, justere spaken armen igjen før det er null anvendt belastning. Null lengden og tvinge kontrollere og bilde konstruere et sekund tid før lasting og starte passiv mekanikk protokollen (Figur 3). Lagre de innsamlede dataene.
7. analyser teknikk: Parafin histologi og Immunohistochemistry
Merk: Vi har hatt stor suksess i imaging utviklet vev seksjoner med parafinblokkene slik at vev morfologi er best bevart. Alle trinnene i prosessen må være nøye vurdert og skreddersydd til utviklet vev, inkludert prosessering prøver uten vakuum eller press, empirisk bestemme riktig antigen uttaksmetodene dine og titrating primære antistoffer konsentrasjon. Andre teknikker, for eksempel bruke frosne blokker for å forberede lysbilder, krever mindre tid og utgifter mens gir tilstrekkelig resultater avhengig av det aktuelle programmet.
- Under en disseksjon omfang, koble nøye konstruert vev Konstruer fra PDMS formen ved hjelp av pinsett gled mellom konstruksjon og PDMS forsiktig skille det fra PDMS, slik at det flyter fritt. Overføre disse konstruksjoner til et microcentrifuge rør for fiksering.
Merk: Skjøre konstruksjoner eller de fikses under den statisk belastning av mold selv kan løses i mold ved endring løsninger i kultur godt og fjerne Konstruer fra formen etter fiksering. - Umiddelbart fastsette utviklet vev av submerging i 4% paraformaldehyde (PF) i 10 min ved romtemperatur. Beregne mer enn 1 t per 1 mm av vev tykkelse; ikke fikse over.
- Skyll vev med fosfat bufret saltvann (PBS).
- Holde vevet våt, plass en dråpe eosin på den å flekk det rosa for 10-30-s, og skyll med 70% etanol.
Merk: Den rosa fargen bidrar til å identifisere den i parafin blokken snitting senere og vil bli vasket bort under deparaffinization. - Pakk vevet i linsen papir og sted i en histology kassett. Bruk skum pads i kassetten behov for å holde vevet flat.
- Senk kassetten i 70% EtOH og butikk på 4 ° C til du er klar for parafin behandling.
- Behandle vev av dehydrating det i økende konsentrasjoner av etanol (2 x 30 min hver 70, 95 og 100%). Deretter bade prøver i tre sekvensiell xylen bad i 30 min.
- Senk eksemplene i tre sekvensiell parafin bad i 30 min.
- Varme opp kassettene, nøye brette og fjerne eosin-farget vev fra objektivet papiret, og bygge inn i parafin-infiltrated vevet i en parafin blokk. Pass på å legge prøven flatt på bunnen av mold å aktivere enklere snitting.
- Delen vev bruker en mikrotom som ønsket (5-8 µm tykk) og flekker med standard prosedyrer optimalisert for konstruert vev (Figur 4).
Merk: Et alternativ til parafinsnitt er å bruke frosne blokker, selv om morfologi av prøven kan være kompromittert. Plass de faste konstruksjoner i 30% sukrose i PBS i 3 h eller til prøven er equilibrated (f.eksover natten). Utveksle løsningen med 50/50 v/v 30% sukrose og optimal kutte temperatur (OCT) frysing medium for 1 h. plassere sammensetningene frosne blokkene OCT frysing mediet bruker en 70% EtOH med tørris slurry for rask hindre frost i plast skuffer. Delen blokker med en kryostat til 10-50 µm tykke snitt.
8. analyse teknikk: Cellejustering
Merk: Manipulere vev form og indre stress felt kan modulerer cellejustering, et definerende trekk ved mange innfødte vev.
- Forberede utviklet vev konstruksjoner i PDMS formene med geometrier av interesse.
- På slutten av perioden kultur, vaske sammensetningene i PBS, fikse i 4% PF (se trinn 7.2) og høste konstruksjoner forberede bildebehandling ved snitting og histology (se punkt 7) eller hele montere flekker.
Merk: Hele mount flekker følger lignende skritt til histology/immunohistochemistry men krever lengre inkubasjon perioder, og gjennomtrenging dyp fargestoffer, antistoffer og enhver tenkelig teknikker (som lys gjennomtrenging dyp i sammensetningene) vil må bestemmes empirisk for konstruere sammensetningen. - Orientere avsnittene vev i horisontalplanet (parallell flyet av mold nederst) og flekker for en markør for cellen rundt. Bruke en f-utgangen etikett, for eksempel phalloidin, å merke begrepsordbok stress fibrene mest celletyper. Alternativt bruke en bestemt celle-markør.
Merk: Når det gjelder utvikling hjerte vev, retning ble bestemt av sarcomeres med α-actinin. - Vurdere hovedakse av alle celler eller kjerner i regionen rundt manuelt eller bruke en analyse verktøy (f.eksImageJ, MATLAB).
Merk: Det kan være nyttig å kategorisere ulike regioner i samme konstruere, avhengig av geometri som ("node" og "bunt" områder i en mesh-lignende geometri, eller "core") og "edge" i en sirkulær geometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Optikk laser kutteren vil føre etset områder har svært litt redusert dimensjoner som etsing dybde øker, og resultater i mold vegger med en meget subtil skråkant, skyldes å slissen på laserstrålen. Dette vil bidra til å lette fjerning av kastet PDMS formene, men bør nøye vurderes hvis veldig dypt etset negative master muggsopp (> 6 mm) er nødvendig (figur 1).
Over tid i kultur, cellularized konstruksjoner komprimerer på grunn av matrix remodeling, skjønt den hastigheten og omfanget som dette skjer vil avhenge av stillaset sammensetningen, celle belastning, og dyrking forhold.
Matrix ombygging kan skje gjennom både omorganisering og nedbrytning av det omkringliggende matrix (samt deponering av nye matrise), men er vanligvis forbundet med en økning i mekanisk stivhet på grunn av nedgangen i tverrsnitt. Med kollagen konstruksjoner kun består av 1.6 mg/mL kollagen og 12 x 106 cardiomyocytes/mL, ser vi konstruerer kompakt være 19.7 ± 2,8% av deres første bredde over fire dager etter støping (figur 2) via komprimering analysen. Mens denne analysen gir en representant 2D tilnærming til en 3D prosess, enkel datainnsamling og ikke-destruktive natur gjør det et kraftig verktøy for å studere utviklingsprosessen Konstruer. Merk at under celle kultur forhold, selv i fravær av celler, kollagen mekanikk kan endres over tid på grunn av både selvtillit forsamlingen og cross-linking11. Fibrin raskt kan reduseres av fibrinolyse både i vivo og i vitro hvis ikke i nærvær av en antifibrinolytic, for eksempel aprotinin eller aminocaproic syre12. Virkningen av stillaset komponenter på lang sikt vev utvikling og ikke bare vev formasjonen, derfor bør vurderes når du velger en konstruksjon formulering. Hvis siste vev er viktig for et bestemt program, komprimering også må vurderes i mold design og empirisk bestemmes basert på celle hvilke og matrix sammensetningen. Merk at vev-komprimering kan også føre til stress felt i vev, som kan manipuleres i cellularized konstruksjoner å oppmuntre cellejustering (Figur 4).
Et bredt spekter av stillas polymer konsentrasjoner og første celle seeding tettheter har brukt til å opprette utviklet vev i litteraturen, og dette skyldes primært til ulike krav til ulike celletyper, linjer og programmer. Basert på vårt eget arbeid med hiPSC-avledet cardiomyocytes, mener vi at en kollagen konsentrasjon av 1,25 mg/mL og en seeding tetthet av ~ 15 millioner celler/mL er en god start punkt13. Alternativt er fibrin mye brukt som hjerte vev stillaset materiale, vanligvis mellom 3-4 mg/mL14. Cellen seeding tetthet kan velges basert på flere faktorer avhengig av programmet, men cellen tettheter av innfødte vev gir et godt referansepunkt. Også vurdere at svært konsentrert celle løsninger kan bli utfordrende å jobbe med, spesielt for små volumer. Stillaset utformingen kan stilles inn for en gitt celle befolkningen, Generelt øker av polymer konsentrasjonen når vev er for skjøre eller bryte komprimering og øke polymer konsentrasjonen når vev er for stiv eller unnlater å kompakt15.
Før du utfører passiv mekanisk analyse helst punkt under kultur, kan det være hensiktsmessig å mekanisk precondition konstruere prøven. Preconditioning av naturlige polymer hydrogels og utviklet vev vil øke reproduserbarhet testing resultatet på grunn av materiale viscoelasticity og gir en bedre indikasjon på egenskapene som Konstruer har i en klinisk program. Vi bruker 8 sykluser av 10% belastning i en trekantet bølgeform med en hastighet på 10% belastning/min før du starter mekanisk vurdering (Figur 3).
Vev og celle-type bestemt morfologi kan vurderes gjennom histologi og immunohistochemistry med tradisjonelle metoder. Vi har imidlertid funnet at optimalisering av nesten alle trinnene i den parafin behandling, innebygging, skjæring, antigen henting og flekker er nødvendig for utvikling hjerte vev sammenlignet belagt celler eller delt innfødt vev (figur 4).
Figur 1 : Oversikt over prosessen for utforming og klargjøre PDMS former fra laser cut akryl mestere. (A) Mold design i vektorgrafikkformat. (B) rengjøres laser etset akryl negative master. (C) PDMS kastet på overflaten av tapet akryl master mold. (D) resulterende PDMS mold klar for sterilisering før vev kultur. Innfelt: ovenfra, samme skala. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Konstruere komprimering over tid i kultur. (A) bilder av rektangulære konstruksjoner i tre eksemplarer komprimering over tid i kultur. Grønne overlegg representerer masker brukt til å beregne synlig konstruere område for bildeanalyser. (B) Plot konstruere området (en todimensjonal beregning av konstruere komprimering) over tid. Vannrette linjene representerer mener verdiene og feilfelt viser standardavviket. For alle grupper, n = 3 og * angir p < 0,05 som vurdert av VARIANSANALYSE. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Rå spor for mekanisk karakteristikk av konstruert hjerte vev. Insets vise én representant twitch sammentrekning spor (samme akser som hovedhandlingen). (A) aktiv mekanisk respons fra rask skritt etterfulgt av holder 5% stamme trinn på. (B) Passive mekanisk svar fra en pull-til-break test med en hastighet på 10% belastning/min. Alle prøvene var analysert i en 37 ° C bad Tyrodes løsning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Parafin blokkere histology bilder for konstruert hjerte vev konstruksjoner av ulike design. Parafin blokker histology bilder for konstruert hjerte vev konstruksjoner av ulike design beiset med (A) hematoxylin og eosin, (B) diaminobenzidine (anti-hjerte troponin T, brun), og hematoxylin kjernefysiske counterstain, (C ) picrosirius røde flekker for kollagen med rask grønne cytoplasmatiske counterstain, og (D) musen anti-α-actinin antistoff (grønn) og 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) kjernefysiske counterstain (blå). Cellejustering forskjellig som følge av konstruere design og vev komprimeringsprosessen. Skala bar i A gjelder for B og C samt. Innfelt i D viser striated cardiomyocytes. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tilpassede PDMS mold geometrier som er kompatible med vev kultur har stor nytte i tuning viktig utvikling vev egenskaper, for eksempel cellejustering, diffusjon rate og effektiv stivhet. I tillegg, er disse formene svært nyttig for forbereder vev analyse programmer der geometri er viktig, for eksempel mekaniske testing16,17. Forberede disse enhetene fra laser kuttet negative master muggsopp tilbyr en rask, lettvinte og rimelig metode for å utnytte disse verktøyene, spesielt i forhold til tid og kostnader forbundet med tradisjonelle microfabrication. Laserskjæring tillater også maksimum mold større, begrenset bare av Sengestørrelsen av kutter. Vi har brukt disse allsidige former til å utføre en rekke studier med konstruert hjerte vev, inkludert optisk tilordning av handlingen potensial forplantning, vurdering av kraft produksjon og passiv mekaniske egenskaper og implantasjon i en rotte modell av hjerteinfarkt13,18. Vi erkjenner at utover den forskning nisje av hjerte regenerativ engineering, programmene for feltene tissue engineering, narkotika-leveranser og materiale er enorme.
Mens det er noen teknisk utfordrende trinn i fabrikasjon av formene selv, er det en rekke viktige trinn involvert i å skape funksjonelle vev. Hvis konstruksjoner ikke komprimere omkringliggende matrix etter 24 h, først bekrefte celle levedyktigheten gjennom levedyktighet farging av konstruert vev. Hvis cellen levedyktighet er høy, kan du vurdere å endre konstruere sammensetningen for neste sett av vev. Mens resultatene vil variere avhengig av befolkningen celle, har vi observert økt komprimering forbundet med høyere seeding tettheter og lavere kollagen konsentrasjoner. Til slutt, det kan også være nyttig å supplere befolkningen seeded cellen med en celle type velegnet for matrise remodeling, som fibroblaster, å oppmuntre komprimering.
En begrensning av disse formene er potensialet for PDMS til adsorberes små hydrofobe molekyler. Mens for våre programmer dette ikke har vært problematisk, kan det være av interesse i analyser svært følsomme for tapet av disse molekylene. I disse tilfellene kan det gjøres PDMS protein adsorpsjon gjennom behandling med en antifouling agent som polyhydrophilic eller polyzwitterionic materiale19. Eventuelt kan sterilisert PDMS mold tilberedes som en negativ master (fra en laser etset positiv mold) for en kultur mold å bli kastet i en annen, ikke-adsorbent materiale, for eksempel agarose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne bekrefter finansiering fra NIH R00 HL115123 og Brown University School of Engineering. De er også Brown Design Workshop og Chris Bull for opplæring og støtte med laser kutteren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Item | |||
| Bovine fibrinogen | Sigma | F8630-5G | Constructs |
| Bovine thrombin | Sigma | T6634-250UN | Constructs |
| Bovine aprotinin | Sigma | 10820-25MG | Constructs |
| Rat tail collagen I, 4 mg/mL | Advanced Biomatrix | 5153-100MG | Constructs |
| Sodim chloride | Fisher | BP358-10 | Constructs |
| PBS | Life Technologies | 14190-250 | Constructs |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Constructs |
| Sylgard 184 silicone elastomer | Corning | 4019862 | PDMS Molds |
| Lab tape | Fisher | 15-901-5R | PDMS Molds |
| Acrylic, 1/4" thick | McMaster-Carr | 8560K356 | PDMS Molds |
| HEPES Buffer, 1 M | Sigma | H3537-100ML | Constructs |
| RPMI 1640 medium, powder | Fisher | 31800-089 | Constructs |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher | AC423520250 | Constructs |
| Magnesium chloride hexahydrate | Fisher | M33 500 | Constructs |
| Potassium chloride | Sigma | P9541-500G | Constructs |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9390-500G | Constructs |
| Glucose | Sigma | G5767-25G | Constructs |
| OCT | VWR | 25608-930 | Histology |
| Frozen block molds | VWR | 25608-916 | Histology |
| Hematoxylin | Fisher | 3530 1 | Histology |
| Eosin Y | Fisher | AC152880250 | Histology |
| Fast green FCF | Fisher | AC410530250 | Histology |
| Software | |||
| Illustrator | Adobe Systems | Vector Graphics | |
| Inkscape | (Open Source) | Vector Graphics | |
| UCP (Universal Control Panel) | Universal Laser Systems | Laser Cutter Interface | |
| Equipment | |||
| PLS6.75 Laser Cutter | Universal Laser Systems | Laser Cutter | |
| Micromechanical Analyzer | Aurora Scientific | 1530A with 5 mN load cell | Mechanical Analysis |
References
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protoc. 5, 491 (2010).
- Rogers, J. A., Nuzzo, R. G. Recent progress in soft lithography. Mater. Today. 8, 50-56 (2005).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft Lithography in Biology and Biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
- Isiksacan, Z., Guler, M. T., Aydogdu, B., Bilican, I., Elbuken, C. Rapid fabrication of microfluidic PDMS devices from reusable PDMS molds using laser ablation. J. Micromechanics Microengineering. 26, 035008 (2016).
- Lee, K. Y., Mooney, D. J. Hydrogels for Tissue Engineering. Chem. Rev. 101, 1869-1880 (2001).
- Kloxin, A., Kloxin, C., Bowman, C., Anseth, K. Mechanical properties of cellularly responsive hydrogels and their experimental determination. Adv. Mater. Deerfield Beach Fla. 22, 3484-3494 (2010).
- Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31, 6941-6951 (2010).
- Jaiswal, M. K., et al. Vacancy-Driven Gelation Using Defect-Rich Nanoassemblies of 2D Transition Metal Dichalcogenides and Polymeric Binder for Biomedical Applications. Adv. Mater. 29, (2017).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nat. Protoc. 8, 162-175 (2013).
- Boxshall, K., et al. Simple surface treatments to modify protein adsorption and cell attachment properties within a poly(dimethylsiloxane) micro-bioreactor. Surf. Interface Anal. 38, 198-201 (2006).
- Pins, G. D., Christiansen, D. L., Patel, R., Silver, F. H. Self-assembly of collagen fibers. Influence of fibrillar alignment and decorin on mechanical properties. Biophys. J. 73, 2164-2172 (1997).
- Pipan, C. M., et al. Effects of antifibrinolytic agents on the life span of fibrin sealant. J. Surg. Res. 53, 402-407 (1992).
- Roberts, M. A., et al. Stromal Cells in Dense Collagen Promote Cardiomyocyte and Microvascular Patterning in Engineered Human Heart Tissue. Tissue Eng. Part A. 22, 633-644 (2016).
- Ye, K. Y., Sullivan, K. E., Black, L. D. Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering. JoVE. , (2011).
- Zimmermann, W. H., et al. Tissue Engineering of a Differentiated Cardiac Muscle Construct. Circ. Res. 90, 223-230 (2002).
- McCain, M. L., Agarwal, A., Nesmith, H. W., Nesmith, A. P., Parker, K. K. Micromolded Gelatin Hydrogels for Extended Culture of Engineered Cardiac Tissues. Biomaterials. 35, 5462-5471 (2014).
- Hu, J. J., Chen, G. W., Liu, Y. C., Hsu, S. S. Influence of Specimen Geometry on the Estimation of the Planar Biaxial Mechanical Properties of Cruciform Specimens. Exp. Mech. 54, 615-631 (2014).
- Munarin, F., Kaiser, N. J., Kim, T. Y., Choi, B. R., Coulombe, K. L. K. Laser-Etched Designs for Molding Hydrogel-Based Engineered Tissues. Tissue Eng. Part C Methods. 23, 311-321 (2017).
- Zhang, H., Chiao, M. Anti-fouling Coatings of Poly(dimethylsiloxane) Devices for Biological and Biomedical Applications. J. Med. Biol. Eng. 35, 143-155 (2015).
