Summary
Hier präsentieren wir Ihnen eine schnelle, einfache und kostengünstige Methode zur Herstellung von benutzerdefinierten Polydimethylsiloxan-Formen, die für die Herstellung von Hydrogel-basierte Technische Gewebe mit komplexen Geometrien verwendet werden können. Wir beschreiben außerdem Ergebnisse aus mechanischen und histologischen Bewertungen auf veränderter kardialen Gewebe hergestellt, mit dieser Technik durchgeführt.
Abstract
Wie das Gebiet des Tissue Engineering weiterhin Reifen hat, gab es verstärktes Interesse an eine Vielzahl von Parametern, Gewebe, einschließlich Gewebe Form. Gewebe-Shape auf das Mikrometer Zentimeter maßstabsgetreu zu manipulieren kann direkte Ausrichtung der Zellen, effektive mechanische Eigenschaften zu ändern, und Beschränkungen in Bezug auf Nährstoff Verbreitung. Darüber hinaus kann das Gefäß, in dem ein Papiertaschentuch bereit ist, vermitteln mechanische Einschränkungen auf das Gewebe, wodurch Spannungsfelder, die weiter die Zelle und die Matrix-Struktur beeinflussen können. Geformtes Gewebe mit hoch reproduzierbare Abmessungen haben auch Dienstprogramm für in-vitro- Assays in welche, die Probe Maße kritisch, wie ganze Gewebe mechanische Analyse sind.
Dieses Manuskript beschreibt eine alternative Herstellungsverfahren unter Verwendung negative Meister-Schimmel aus Acryl Laser geätzten vorbereitet: diese Formen gut mit Polydimethylsiloxan (PDMS) durchführen, ermöglichen Designs mit den Maßen auf den Zentimeter Umfang und Funktion Größen kleiner als 25 µm und kann sein schnell konstruiert und gefertigt zu einem niedrigen Preis und mit minimaler Kompetenz. Die minimale Zeit und Kosten Anforderungen ermöglichen Laser geätzten Formen schnell auf wiederholt werden, bis ein optimales Design feststeht und einfach jedem Assay von Interesse, einschließlich derjenigen über den Bereich des Tissue Engineerings angepasst werden.
Introduction
In den letzten zwei Jahrzehnten wurde weiche Lithographie ausgiebig als Herstellung Technik verwendet, um wissenschaftliche Forschung, insbesondere in den Bereichen der Mikrofluidik, Materialforschung und Tissue engineering1,2zu unterstützen, 3. Replik-Formteil, in dem ein Objekt mit einer gewünschten Form aus einer Negativform master erstellt wird bietet eine bequeme und kostengünstige Verfahren zur Herstellung von positive PDMS repliziert, die für den Guss geformte Hydrogele verwendet werden kann. Jedoch die erforderliche negative Meister-Schimmel entstehen in der Regel mit Microfabrication Techniken, die sind in der Größe, begrenzt, teuer, zeitaufwendig, und benötigen sauberes Zimmer Platz und hoch entwickelte Ausrüstung. 3D-Druck bietet eine mögliche Alternative, zwar seine Nützlichkeit ist etwas eingeschränkt, aufgrund der begrenzten Auflösung günstigere Drucker und die chemischen Wechselwirkungen zwischen gemeinsamen 3D-Drucker Polymere und PDMS, die Aushärtung hemmen können.
Laser Cutter Systeme in der Lage sowohl schneiden und Ätzen Materialien wie Kunststoff, Holz, Glas und Metall sind vor kurzem drastisch weniger teuer und daher leichter zugänglich für die Herstellung von Recherche-Tools geworden. Handelsgüte Laserschneidanlagen sind in der Lage, die Herstellung von Objekten auf der Zentimeter-Skala mit minimalen Funktionen kleiner als 25 µm und weitere erfordern minimale Ausbildung, Fachwissen und Zeit zu verwenden. Während Laser-Ablation von PDMS in der Herstellung der Mikrofluidik Geräte verwendet wurde, hat nach unserer Kenntnis keine Handschrift ein Prozesses beschrieben durch welche Millimeter und Zentimeter Skala Formen aus lasergeschnittenen negative Meister-Schimmel4 gefertigt werden können .
Wir haben diese Technik verwendet, in erster Linie auf um die Form der technischen Gewebe zu manipulieren, um Nährstoff Diffusion, zelluläre Ausrichtung und mechanischen Eigenschaften5,6,7zu verbessern. Allerdings ermöglicht die Vielseitigkeit dieser Technik für den Einsatz in allen Bereichen wo geformte Hydrogele von Interesse, wie Drogen Lieferung und Material Science Forschung8 sind. Mit Zugriff auf ein Laser-Cutter, PDMS Schimmel Wiederholungen gemacht werden können für nahezu jede Geometrie ohne Überhänge (die Entfernung ohne eine mehrteilige Form, die außerhalb des Rahmens dieses Manuskriptes ist hemmen würde) und das passt in den Dimensionen des Laser-Bettes.
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Protocol
(1) erstellen Sie die Vector Format Master Schimmel Designs
- Montieren Sie die gewünschte Form Geometrie im Vektor-Format mit einem Vektor-Grafikprogramm (siehe Materialien, Ausrüstungen, und Tabelle "Software"). Wählen Sie -Datei | Neue und erstellen Sie eine Leinwand von entsprechenden Dimensionen mit RGB-Farbformat. Erstellen Sie die gewünschte Geometrie mit den Formwerkzeugen im linken Bedienfeld: Geben Sie die gewünschten Maße am oberen Rand des Fensters (Klicken Sie die Transformation an der Spitze, wenn nicht ursprünglich sichtbar), Form Größen genau zu definieren.
Hinweis: Schimmel Geometrien sollte für mindestens einen 6-mm-Grenze zwischen dem Rand der äußeren Merkmale und die Schnittlinie ermöglichen, erlauben Trimmen des PDMS Meniskus nach Form gießen. Dadurch wird die fertige Form bündig mit dem unteren Rand der Kulturschale zu legen. Darüber hinaus sollten Schimmel Geometrien berücksichtigen Berücksichtigung Einschränkungen verbunden mit dem Laser Cutter Modell, das verwendet werden, einschließlich der Schnittbreite und minimale Strukturgröße. Der Laser für die beschriebene Arbeit hierin vorgestellten (siehe Materialien, Ausrüstungen, und Tabelle "Software"), eine 0,2 mm Schnittbreite und eine minimale geätzten Strukturgröße von 25 µm (maximale Auflösung von 1.000 DPI). Formbemaßungen können gewählt werden, um eine gewünschte Kulturgefäß wie ein 10-cm-Schüssel oder 6 oder 24-Well Platten aufzunehmen. - Öffnen Sie die Farbauswahl in der oberen linken Ecke des Fensters und definieren Sie neue Farbfelder mit der Laser-Cutter-Software kompatibel.
Hinweis: Wir verwenden rot (RGB 255, 0, 0) zum Schneiden und blau (RGB, 0, 0, 255) für Radierung. Zusätzliche Farbfelder können je nach Anforderungen an die Gestaltung definiert werden (beispielsweise, wenn mehr als eine Radierung Tiefe gewünscht wird).- Weisen Sie diese Swatch Farben nach schneiden Wege indem Sie den Pfad auswählen und dann die geschnittenen Swatch für die streckenfarbe und [keine] für die Füllfarbe den Farbwähler auswählen.
- In ähnlicher Weise weisen Sie Swatch Farben Ätzen Pfade, indem das Objekt auswählen und dann die Radierung-Pfad für die Füllfarbe und [keine] für die Pfad-Farbe aus dem Farbwähler zu.
- Ausführungen als either.ai-or.pdf-Datei-Formate, je nach der Vektor Grafik Programm und Laser Cutter-Kompatibilität (Abbildung 1A und Ergänzende Datei) speichern.
2. Laser Schneiden der Acryl-Meister-Schimmel
- Wählen Sie ein master Negativform Material.
Hinweis: Viertel-Zoll dicken Acryl eignet sich gut für diese Anwendung aufgrund seiner Kompatibilität mit Laserschneiden, relativ niedrige Kosten, und Dicke ermöglicht Funktionen bis zu ~ 5,5 mm in der Höhe. Jedoch können andere Materialien, die die folgenden Anforderungen gerecht zu werden sowie verwendet werden: (i) rückwirkungsfreie mit PDMS zu heilen; (Ii) nicht-poröse/stark Kleber ausgehärtet PDMS; (Iii) schneidet und ätzt sauber mit einem Laser-Cutter; (iv) unterhält einen glasigen Zustand bis zu 60 ° C; (V) mit einer Dicke, die kompatibel mit der gewünschten maximalen Feature-Höhe. - Vorbereiten der Laser-Cutter zum Schneiden nach den Vorgaben des Herstellers. Stellen Sie sicher, dass ausreichende Belüftung verwendet wird und dass die Betthöhe auf den gewählten master Negativform Material Dicke richtig kalibriert ist.
- Öffnen Sie die Designdatei in einem Grafikprogramm Vektoren auf dem Computer mit der Laser-Cutter und klicken Sie auf Datei | Drucken. Sicherstellen, dass der Laser-Cutter wie der Drucker eingestellt ist und "Nicht Maßstab" in der Skalierung ausgewählt ist drop-down-Menü, um das Design vor dem Klicken auf die Schaltfläche "Drucken" am unteren Rand das Dialogfeld "Drucken" zu vermeiden.
- Der Laser Cutter Drucken Dienstprogramm klicken Sie auf die Schaltfläche " Einstellungen " in der rechten unteren Ecke. Ordnen Sie Kraft, Geschwindigkeit und Impulse pro Zoll (PPI) Einstellungen für jede der zuvor gewählten Farben Schnitt/Ätzen Parameter für alle Design-Merkmale zu
Hinweis: Hier die Laser-Cutter, ausgestattet mit einer 75 W laser (siehe Materialien, Ausrüstungen, und Tabelle "Software"), verwendete Einstellungen der folgenden Schritte aus: 100 % Leistung, 1 % Geschwindigkeit und 1.000 PPI schneidet sauber durch ¼" Acryl; 100 % Leistung, 8 % Geschwindigkeit und 500 ätzt PPI bis zu einer Tiefe von 2,75 mm Acryl; und 100 % Leistung, 5 % Geschwindigkeit, 500 PPI ätzt bis zu einer Tiefe von 3,50 mm in Acryl. Wenn für einen Laser Cutter Konfiguration oder Material unbekannt, können dieser Parameter empirisch durch Versuch und Irrtum mit einem Prüfling bestimmt werden. - Klicken Sie auf die große grüne Taste in der Laser-Cutter-Software zur laser-Ätzen und schneiden Sie die negative Meister-Schimmel.
- PDMS-Casting bereiten Sie der negativen Meister-Schimmel Entfernen Schmutzpartikel residual Schneiden mit Bürstchen und/oder Druckluft (Abbildung 1 b vor).
3. bereiten Sie die PDMS-Formen für Zelle oder Gewebekultur
- Bereiten Sie eine PDMS Gießen Mischung gemäß den Herstellerangaben. Bereiten Sie 0,35 mL/cm2 von master-Form; Dies wird anhand der Formelemente und Höhe variieren.
- Degas die vorbereiteten PDMS in einer Vakuumkammer mit einer standard-Lab-Vakuumleitung verbunden (< 500 MmHg) für 1 h oder bis alle Luftblasen beseitigt worden sind.
- Der äußere Rand der Form mit Vinyl oder Klebeband (farbige Label Band funktioniert gut), dass das Band erstreckt sich mit Klebeband > 3 mm über die geätzten Gesicht der master Negativform. Drücken Sie das Klebeband fest an der Seite des die Form, um undichte Stellen später zu verhindern.
Hinweis: Wenn der Acryl-master-Form Durchgangsbohrungen verfügt, kann es erforderlich, Klebeband auf den Boden der Form sowie (Abbildung 1) sein. - Das geätzte Gesicht der master Negativform übergießen Sie entgast PDMS.
Hinweis: Das Ziel, das PDMS Dicke von der Anwendung abhängen, obwohl Dicke PDMS Böden Schimmel können imaging eine Herausforderung. Einer minimalen Dicke von ~ 1,5 mm ist ein guter Kompromiss zwischen imaging Überlegungen und Einfachheit der Entformung. - Legen Sie die PDMS-beschichtete master Negativform in eine Vakuumkammer und degas wieder für 1 Stunde oder bis alle Luftblasen beseitigt worden sind.
- Legen Sie die entgast PDMS-beschichtete negative Meister Form in einem Ofen 60 ° C für mindestens 6 h stellen Sie sicher, dass der Backofen-Regal ist zu heilen. Alternativ können die PDMS, bei 37 ° C über Nacht oder bei Raumtemperatur für heilen ~ 72 h.
- Wenn mehrere Formen auf der gleichen negativen master-Form gegossen wurden, verwenden Sie eine Rasierklinge, um diese Formen auseinander zu schneiden, während sie noch auf die Negativform Meister sind. Dann schälen Sie jedes PDMS-Form aus der negativen master-Form. Sicherzustellen, dass PDMS Formen langsam und sorgfältig gesammelt werden um Schimmel Feature reißt während der Erfassung zu verhindern.
- Mit einer Rasierklinge, schneiden Sie Regionen mit der Meniskus aus Guss, die die Form von liegenden flachen sowie jede überschüssige Material oder Schmutz (Abbildung 1) verhindern würde.
- Bei Bedarf bereiten Sie Formen für Zellgewebe/Casting durch Autoklavieren.
(4) werfen Sie die Kollagen und Fibrin Hydrogel Gewebe
Hinweis: Verwenden Sie eine korrekte aseptische Verfahren zu Sterilität.
- Halten Sie die Formen nach unten das gewünschte Schiff. Halten Sie neue Formen auf den Boden einer Gewebe-Kultur behandelte Platte fest drücken die Form gegen die unbehandelten Kunststoff (wegen der Hydrophobie von PDMS).
Hinweis: Allerdings Wenn Gewebekultur behandelt Polycarbonat verwendet werden soll, oder im Falle von wiederverwendet Formen, die dazu neigen, weniger fest haften, ein natürlicher oder synthetischer Kleber (wie Fibrin oder Silikon-Dichtstoff über Nacht geheilt) kann zur Befestigung zu gewährleisten. - Bereiten Sie Fibrinogen, Thrombin und neutralisierte Kollagen Lösungen zu gießen, so dass die gewünschte Konzentration von jeweils in der Besetzung Gewebe erreicht wird. Bewahren Sie Kollagen auf Eis bis Gießen.
Hinweis: Fibrinogen und Thrombin darf nicht bis unmittelbar vor dem Guss mischen. Bei Bedarf können die Fibrinogen und Thrombin Lösungen auch gekühlt werden, um die polymerisationszeit zu erhöhen. Wir habe eine endgültige Fibrinogen Konzentration zwischen 0-8 mg/mL, eine endgültige Thrombin-Konzentration zwischen 10-100 U/mL und eine endgültige Kollagen-Konzentration zwischen 0,8 - 2,0 mg/mL (Abbildung 2). Für technische kardialen Gewebe, benutzen wir oft Kardiomyozyten bei 12 x 106 Zellen/mL mit 1,6 mg/mL, 4 mg/mL Fibrinogen und 20 U/mL Thrombin (Thrombin wird unmittelbar vor dem Gießen hinzugefügt). Optimale Konzentrationen (auch außerhalb dieser vorgeschlagenen Bereiche) sollte empirisch ermittelt werden. - Zellen nach Standardprotokollen ernten und in einer Konzentration zu erreichen die gewünschte anfängliche Zelldichte im Cast Gewebe Aufschwemmen.
Hinweis: Menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Kardiomyozyten geerntet wurden, wie in Lian Et Al. beschrieben 9 halten Sie die geernteten Zellen auf Eis. Zellvolumen sollten bei der Vorbereitung der Zellsuspension berücksichtigt werden. Wir haben Zelle Konzentrationen zwischen 9-18 x 106 Zellen/mL, verwendet, obwohl optimale Bereiche sollen mit Zell-Population (Abbildung 2) variieren. - Kombinieren Sie die Fibrinogen, neutralisierte Kollagen und Zellsuspension (siehe Punkt 4.2 für ein Beispiel) um eine Casting-Mix zu erstellen. Halten Sie die Casting-Mischung auf dem Eis.
Hinweis: Fibrinogen und Thrombin Temperaturen und Konzentrationen bestimmen Polymerisation Kinetik; um Polymerisation beim Casting zu verhindern, ist es möglicherweise erforderlich, vorbereiten, separate Chargen des Casting-Mix je nach Anzahl und Volumen der Konstrukte, die gegossen werden. - Behandeln Sie die Flächen der Form, die ausgesetzt werden in den Casting-Mix, PDMS Hydrophobie mildern (PDMS Hydrophobie erhöhen Protein Adsorption und Gießen erschweren).
- Erreichen Sie hydrophile Oberflächenmodifizierung durch Behandlung mit Sauerstoffplasma, wie z. B. mit einem Handheld-Hochfrequenz-Generator (z. B.BD-20A von Litton Engineering). Setzen Sie alle Oberflächen der Form, die die Zelle/Gel-Mischung auf die Plasmabehandlung für 3-5 s, ca. 5 min vor dem Gießen in Berührung.
- Alternativ mit einem Tensid, wie Pluronic F-127 (1 % w/V)10zu behandeln. Führen Sie die Oberflächenbehandlung wie nahe die Zauberzeit wie möglich, wie die Änderung der Polarität im Laufe der Zeit verschlechtern.
- Unmittelbar vor dem Gießen, Hinzufügen der Thrombin die Mischung Gießen und die Mischung gründlich durch pipettieren rauf und runter ohne Luftblasen.
- Arbeiten schnell, pipette die Mischung Gießen in die Formen mit sorgen, die Mischung in alle Ecken und Ritzen des Werkzeugs zu hinterlegen. Vermeiden Sie Pipette Auswurf über die erste Station, Blasenbildung innerhalb der Konstrukte zu verhindern.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.6 und 4.7 als notwendig für jede zusätzliche Chargen des Casting-Mix.
- Stellen Sie die Gewebekultur Gefäß in einem Inkubator 37 ° C für 45 Minuten. Hinterlegen Sie der Inkubator nicht gut befeuchtet ist, Zelle Medien rund um die Formen vor der Inkubation Konstrukt Austrocknung zu verhindern.
Hinweis: Die Art der Zelle Medien hängt Zelltyp, aber entwickelt Herzgewebe Konstrukte verwenden wir RPMI 1640 + B27 Ergänzung. - Nach 45 min zurück die Konstrukte der Haube und Deckel mit Zelle Medien vor der Rückkehr in den Inkubator.
- Wechseln Sie das Medium Zelle alle 48-72 h nach Bedarf für die Zelle und konstruieren Sie Art zu.
Hinweis: Medienwechsel sollte gemäß den empfohlenen Anweisungen durch den Lieferanten zu gewährleisten maximale Zellgesundheit geplant werden. Vorsicht beim Wechsel der Medien um nicht zu stören die Konstrukten. Wir haben Probleme mit Konstrukten schweben nicht erlebt, aber in diesem Fall kann es verhindert werden, indem Sie hohe Beiträge zu der Formengestaltung, die über die Medien-Ebene hinausgehen. - Nach Gebrauch waschen die Formen nacheinander mit 10 % Bleichmittel, 70 % Ethanol, und destilliertes Wasser. Dann die Luft trocken und Autoklaven zur Wiederverwendung bis zu ~ 10 mal.
5. Analyse Techniken: Gewebe Verdichtung
Hinweis: Verdichtung infolge Umbau Matrix ist ein Indikator für Gewebe überleben und Entwicklung, die leicht durch optische Mikroskopie und Bildanalyse gemessen werden kann.
- Optische Mikroskopie Bilder der Konstrukte in den Formen auf Zeit-Schritten von 2 h bis 96 h nach dem Gießen zu sammeln.
Hinweis: Aufgrund des geringen Umfangs der Vergrößerung erforderlich, ist eine Dissektion Mikroskop mit einer Kamerahalterung für diese Anwendung gut geeignet. - Bereich sichtbar Konstrukt in einer Bild-Analyse-Suite wie ImageJ zu verfolgen (open-Source, imagej.nih.gov/ij/).
- Analysieren Sie die Rate und letzten Grad der Verdichtung (Abbildung 2).
6. Analyse Techniken: Zugversuch
Hinweis: Beide aktive Mechanik (Kräfte oder Belastungen durch eine technische Gewebe wegen der Zellaktivität erzeugt) und passive Mechanik (Kräfte oder Stämme, die als Reaktion auf angewandte Spannungen oder Kräfte generiert) sind wichtige funktionelle Eigenschaften vieler entwickelt Gewebe, und dies gilt insbesondere für technische kardialen Gewebe. Der mikromechanischen Analyzer verwendet für die Analysen wird in der Tabelle der Materialienbeschrieben. Andere mechanische Tests Apparate konnte ebenso angewendet werden, vorausgesetzt sie hydratisiert Tests ermöglichen und sind in der Lage Längenkontrolle und Kraftmessungen über Bereiche und Auflösungen für das Gewebe. Für Gewebe mit Querschnittsflächen in der Größenordnung von einzelnen Quadratmillimeter und Steifigkeiten in der Größenordnung von 10 kPa ist eine 5 mN-Wägezelle eine gute Passform. Größere und härtere Materialien erfordern eine größeren Wägezelle. Vor dem Test, sicherzustellen Sie, dass die Kraftaufnehmer und Länge Controller richtig kalibriert sind.
- Schalten Sie den Controller Länge, Kraft, Wandler, Impulsgeber und Temperaturregler.
- Tyrode Lösung (Kalzium-Chlorid 1,8 mM, 1,0 mM Magnesiumchlorid, Kaliumchlorid 5,4 mM, 140 mM Natrium-Chlorid, 0,33 mM Natriumphosphat, 10 mM HEPES und 5 mM Glukose im DdH2O, pH auf 7,4 eingestellt) für füllen Sie die mechanische Prüfung Mulde ein kardialen Gewebe entwickelt. Passen Sie das Thermoelement, so dass eine Temperatur von 37 ° C erreicht wird.
- Laden Sie eine mechanische Testprotokoll für die aktive Kontraktion Datenerhebung.
Hinweis: Wir haben ausgewertet, aktiven kontraktilen Mechanik mit einer Länge Schritt Protokoll in welcher Länge inkrementiert Schritte in 5 % Dehnung bis zu 30 % sind für 120 statt s zur Bewertung der Auswirkungen der Belastung für die Kontraktion Kraft (Abb. 3A). Darüber hinaus haben wir passive mechanische Eigenschaften durch ein Pull-Pause-Protokoll mit einer konstanten Belastung Rate von 10 % Dehnung/min (Abb. 3 b) ausgewertet. Beide Protokolle können als gute Ausgangspunkte für aktive und passive mechanische Analyse dienen. - Im Rahmen einer Dissektion trennen Sie sorgfältig das technische Gewebe Konstrukt aus dem PDMS-Werkzeug so, dass er frei schwebt.
Hinweis: Cellularized Konstrukte, die Gewebe Verdichtung erfahren haben werden wahrscheinlich bereits abgenommen werden von der inneren Form Oberflächen, und in diesen Fällen ist die minimale Manipulation erforderlich.- Wenn Verdichtung nicht das Konstrukt freizugeben, verwenden Sie Zange sanft das Konstrukt trennen die Seiten und der Boden der Form um eine Beschädigung des Gewebes verursacht hat.
- Mit Pinzette, sanft das Konstrukt abholen und überträgt es auf das mechanische Tests Bad.
- Betrachten das Konstrukt durch eine Dissektion Mikroskop, montieren Sie entweder Ende des Konstrukts an den Haken an der Kraftaufnehmer und Hebelarm befestigt.
- Passen Sie die Hebelstellung Arm mit dem Mikromanipulator, bis das Konstrukt ohne angewandte Belastung positioniert ist. Null-Länge-Controller und Controller zu erzwingen.
- Das Konstrukt durch das Zielfernrohr Dissektion Bild, so dass die Dimensionen des Konstrukts über Bildanalyse gemessen werden können.
- Die aktive Kraft-Protokoll zu initiieren und speichern die gesammelten Daten, sobald das Protokoll wurde beendet (Abbildung 3).
- Wenn passive mechanische Daten erforderlich sind, stellen Sie den Hebelarm wieder gibt es NULL angewandte Belastung. Die Länge Null und Controller und das Konstrukt ein zweites Bild vor Be- und initiieren die passive Mechanik-Protokoll (Abbildung 3). Die erhobenen Daten zu speichern.
7. Analyse Technik: Paraffin Histologie und Immunhistochemie
Hinweis: Wir hatten den größten Erfolg in der Bildgebung entwickelt Gewebeschnitte mit Paraffin-Blöcke, so dass Gewebe Morphologie am besten erhalten ist. Alle Schritte des Prozesses müssen sorgfältig durchdacht und abgestimmt auf das veränderter Gewebe, einschließlich der Bearbeitung von Proben ohne Vakuum oder Druck, empirisch bestimmen die entsprechende Antigen Abrufmethoden und titrieren den primären Antikörper Konzentration. Andere Techniken wie die Verwendung von gefrorenen Blöcke für die Zubereitung von Folien, erfordern weniger Zeit- und Kostenaufwand beim nachgeben ausreichende Ergebnisse je nach dem Einsatzzweck.
- Im Rahmen einer Dissektion trennen Sie sorgfältig das technische Gewebe Konstrukt aus der PDMS-Form mit Pinzette glitt zwischen Konstrukt und PDMS, um sanft von der PDMS zu trennen, so dass er frei schwebt. Übertragen Sie diese Konstrukte zu einem Microcentrifuge Schlauch zur Fixierung.
Hinweis: Fragile Konstrukte oder diejenigen unter hoher statische Belastung zur Verfügung gestellt durch die Form selbst behoben werden können in der Form fixiert werden von Lösungen in der Kultur auch ändern und entfernen das Konstrukt aus der Form nach der Fixierung. - Sofort zu beheben die technischen Geweben durch Eintauchen in 4 % Paraformaldehyd (PF) für 10 min bei Raumtemperatur. Schätzen Sie nicht mehr als 1 h pro 1 mm Dicke Gewebe; nicht zu korrigieren.
- Spülen Sie das Gewebe mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
- Geben Sie das Gewebe feucht zu halten, einen Tropfen der Eosin, Rosa für 10-30 s zu beflecken, und spülen dann mit 70 % Ethanol.
Hinweis: Die rosa Farbe hilft, ihn in den paraffinblock für Schnitt später identifizieren und während 4.wenn weggespült. - Wickeln Sie das Gewebe in Linsenpapier und Ort in einer Histologie-Kassette. Verwenden Sie Schaumstoff-Pads in der Kassette Bedarf, um das Gewebe flach zu halten.
- Tauchen Sie die Kassette in 70 % EtOH und Speicher bei 4 ° C bis zum Paraffin Verarbeitung bereit.
- Verarbeiten Sie das Gewebe durch Austrocknen es in steigenden Konzentrationen von Ethanol (2 x 30 min pro 70, 95 und 100 %). Dann Baden Sie Proben in drei sequenziellen Xylol Bäder für 30 Minuten.
- Tauchen Sie die Proben in drei sequenziellen Paraffin-Bäder für 30 min.
- Wärmen Sie die Kassetten, sorgfältig nicht entfalten entfernen Sie das Eosin-gefärbten Gewebe aus dem Objektiv Papier zu und Betten Sie das Paraffin infiltriert Gewebe in einem paraffinblock ein. Achten Sie darauf, die Probe legen flach auf den Boden der Form einfacher Schnitt ermöglichen.
- Abschnitt der Gewebe, die mit einem Mikrotom beliebig (5-8 µm dick) und Flecken mit Standardverfahren für das technische Gewebe (Abbildung 4) optimiert.
Hinweis: Eine Alternative zu Paraffin Abschnitte ist gefrorene Blöcke verwenden, obwohl Morphologie der Probe beeinträchtigt sein kann. Legen Sie die feste Konstrukte in 30 % Saccharose mit PBS-Puffer für 3 h oder bis die Probe äquilibriert (z.B.über Nacht). Tauschen Sie die Lösung mit 50/50 V/V 30 % Saccharose und optimale Arbeitstemperatur (OCT) Einfrieren Medium für 1 h. statt der Konstrukte in gefrorenen Blöcke mit OCT Einfrieren Medium mit einem 70 % EtOH mit Trockeneis Gülle für schnelle Block in Kunststoffschalen einfrieren. Abschnitt die Blöcke mit einem Kryostaten, 10-50 µm Dicke Abschnitte.
8. Analyse Technik: Zellausrichtung
Hinweis: Manipulation der Gewebe Form und innere Spannungsfelder kann Ausrichtung der Zellen, ein bezeichnendes Merkmal von vielen einheimischen Geweben modulieren.
- Bereiten Sie die technische Gewebe-Konstrukte in PDMS Formen Geometrien von Interesse.
- Am Ende der Periode der Kultur, die Konstrukte in PBS waschen, in 4 % fix PF (siehe Punkt 7.2) und ernten Konstrukte zur Vorbereitung für die Bildgebung durch Schneiden und Histologie (siehe Abschnitt 7) oder ganze montieren Färbung.
Hinweis: Ganze Berg Färbung folgt ähnliche Schritte zur Histologie/Immunohistochemistry aber erfordert längere Inkubationszeiten und die Eindringtiefe von Farbstoffen, die Antikörper und jedes bildgebenden Verfahren (z. B. leichte Eindringtiefe in die Konstrukte) wird für die Zusammensetzung der Konstrukt empirisch ermittelt werden müssen. - Die Gewebeschnitte in der horizontalen Ebene (parallel zur Ebene der Form unten) zu orientieren und Flecken für eine Markierung für die Zelle von Interesse. Benutzen Sie ein f-Aktin-Label, wie z. B. Phalloidin, um die Aktin Stress Fasern von den meisten Zelltypen markieren. Alternativ können Sie einen Zelle spezifische Marker.
Hinweis: Bei veränderter kardialen Gewebe wurde Ausrichtung von Sarkomeren gebeizt mit α-Actinin bestimmt. - Beurteilen die Hauptachse aller Zellen oder Kerne in der Region von Interesse manuell oder mit einem Analyse tool (z.B.ImageJ, MATLAB).
Hinweis: Es möglicherweise sinnvoll, verschiedene Regionen des gleichen Konstrukts, abhängig von der Geometrie wie ("Knoten" und "Bundle" Regionen in einem netzartigen Geometrie oder "Kern") und "Edge" in eine kreisförmige Geometrie zu kategorisieren.
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Representative Results
Die Optik der Laser-Cutter erzeugen geätzte Bereiche Abmessungen wie Ätzen Tiefe steigt geringfügig zurückgegangen, und Ergebnisse im Formenbau Wände mit einer sehr feinen Fase wegen zur Verjüngung des Laserstrahls. Dies wird dazu beitragen, das Entfernen der Besetzung PDMS Formen zu erleichtern, aber sollte sorgfältig geprüft werden, wenn negative Meister-Schimmel sehr tief geätzt (> 6 mm) sind erforderlich (Abbildung 1).
Im Laufe der Zeit in der Kultur werden cellularized Konstrukte durch Matrix Umbau, obwohl die Rate und das Ausmaß, in diesem Fall von der Gerüst-Zusammensetzung, Zelle Last abhängen wird, und Kultivierung Bedingungen kompakt.
Umbau der Matrix kann durch Reorganisation und Verschlechterung der umgebenden Matrix (und die Ablagerung von neuen Matrix) auftreten, aber ist in der Regel verbunden mit einer Zunahme der mechanischen Steifigkeit aufgrund der Abnahme der Querschnittsfläche. Wir sehen mit Kollagen nur Konstrukte bestehend aus 1,6 mg/mL Kollagen und 12 x 106 Kardiomyozyten/mL, Konstrukte kompakt auf 19,7 ± 2,8 % der ihre ursprüngliche Breite in den vier Tagen nach Gießen (Abbildung 2) über die Verdichtung-Assay. Während dieser Assay eine repräsentative 2D Annäherung an ein 3D Verfahren ergibt, die einfache Datenerfassung und nicht-destruktive Natur machen es ein leistungsfähiges Werkzeug für das Studium des Entwicklungsprozesses Konstrukt. Beachten Sie, dass unter Kulturbedingungen Zelle, auch in Abwesenheit von Zellen, Kollagen Mechanik Selbstmontage im Laufe der Zeit durch beide verändern können und vernetzende11. Fibrin kann schneller abgebaut werden, durch Fibrinolyse in Vivo und in Vitro wenn nicht in Anwesenheit eines antifibrinolytischen, wie z. B. Aprotinin oder Aminocaproic Säure12. Daher sollten die Auswirkungen der Gerüst-Komponenten auf Gewebeentwicklung langfristig und nicht nur die Gewebebildung bei eine Konstrukt Formulierung Auswahl berücksichtigt werden. Wenn endgültige Gewebe Größe für eine bestimmte Anwendung wichtig, Verdichtung auch betrachtet werden im Formenbau und empirisch ermittelt basierend auf die Zelle (n) und Matrix-Zusammensetzung. Beachten Sie, dass das Gewebe Verdichtung auch Spannungsfelder innerhalb des Gewebes induzieren kann, die in cellularized Konstrukte zu ermutigen, Ausrichtung der Zellen (Abbildung 4) bearbeitet werden kann.
Eine Vielzahl von Gerüst Polymer Konzentrationen und erste Zelle Dichte Aussaat wurden verwendet, um technische Gewebe in der Literatur zu schaffen, und dies ist in erster Linie auf die unterschiedlichen Anforderungen für unterschiedliche Zelltypen, Zelllinien und Anwendungen zurückzuführen. Basierend auf unserer eigenen Arbeit mit HiPSC abgeleiteter Herzzellen, wir glauben, dass eine Kollagen-Konzentration von 1,25 mg/mL und Aussaatdichte von ~ 15 Millionen Zellen/mL ist ein guter Start Punkt13. Alternativ ist Fibrin als Herzgewebe Gerüst Material als auch in der Regel im Bereich von 3-4 mg/mL14verbreitet. Zelle Dichte Aussaat kann ausgewählt werden, basierend auf einer Reihe von Faktoren abhängig von der Anwendung, aber Zelldichten nativen Gewebe bieten einen guter Anhaltspunkt. Auch Bedenken Sie, dass hochkonzentrierte Zelle Lösungen anspruchsvoll zu arbeiten, vor allem für Kleinmengen werden können. Für eine bestimmte Zellpopulation kann die Gerüst Formulierung abgestimmt werden; in der Regel durch Erhöhung der Polymer-Konzentration, wenn Gewebe zu empfindlich sind oder Verdichtung und Erhöhung der Polymer-Konzentration, wenn Gewebe zu steif sind oder zu15compact nicht brechen.
Vor der Durchführung passive mechanische Analyse jederzeit während der Kultur zeigen, es kann angebracht sein, das Konstrukt Beispiel mechanisch Voraussetzung. Vorkonditionierung der natürlichen Polymer Hydrogele und technische Gewebe erhöht die Reproduzierbarkeit der das Testergebnis durch materielle Viskoelastizität und bieten einen besseren Indikator für die Eigenschaften, die das Konstrukt einer klinischen ausstellen werden Anwendung. Wir verwenden 8 Zyklen von 10 % Dehnung in eine dreieckige Wellenform mit einer Rate von 10 % Dehnung/min vor Beginn der mechanischen Beurteilung (Abbildung 3).
Gewebe und Zelltyp spezifische Morphologie kann durch Histologie und Immunhistochemie mit traditionellen Methoden beurteilt werden. Wir haben jedoch festgestellt, dass fast alle Schritte der Paraffin zu verarbeiten, einbetten, schneiden, Antigen-Retrieval und Färbung sind notwendig gewesen für das entwickelte Herzgewebe im Vergleich zu Zellen überzogen oder geschnittene native-Optimierung Gewebe (Abbildung 4).
Abbildung 1 : Überblick über den Prozess für die Konzeption und Vorbereitung PDMS Formen von Laser schneiden Acryl Meister. (A) Werkzeugkonstruktion in Vektor-Grafik-Format bereit. (B) gereinigt laser geätzten Acryl negative Meister. (C) PDMS gegossen auf der Oberfläche der aufgezeichneten Acryl-master-Form. (D) resultierende PDMS Schimmel bereit für die Sterilisation vor Gewebekultur. Einschub: Ansicht von oben gleich skaliert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Verdichtung im Laufe der Zeit in Kultur zu konstruieren. (A) Bilder von rechteckigen Konstrukte in dreifacher Ausfertigung Verdichtung im Laufe der Zeit in Kultur vorbereitet. Grüne Überlagerungen darstellen Masken verwendet, um sichtbare Konstrukt Fläche für die Bildanalyse zu berechnen. (B) Fläche des Konstrukts (eine zweidimensionale Metrik Konstrukt Verdichtung) im Laufe der Zeit. Horizontale Linien repräsentieren die Mittelwerte und Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung. Für alle Gruppen, n = 3 und * zeigt p < 0,05 wie ANOVA bewertet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Raw Spuren für die mechanische Charakterisierung von veränderter kardialen Gewebe. Kartenausschnitte anzeigen eine einzigen repräsentativen zucken Kontraktion Ablaufverfolgung (gleiche Achsen als Haupthandlung). (A) aktive mechanische Reaktion infolge raschen Schritten gefolgt von hält bei 5 % Dehnung-Schritten. (B) Passive mechanische Reaktion durch einen Zug zu brechen-Test mit einer Rate von 10 % Dehnung/min. Alle Proben wurden in einem 37 ° C Bad Tyrode Lösung analysiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Paraffin block Histologie Bilder für entwickelt Herzgewebe Konstrukte der verschiedenen Designs. Paraffin Block Histologie Bilder für entwickelt Herzgewebe Konstrukte der verschiedenen Designs gebeizt mit (A) Hämatoxylin und Eosin, (B) Diaminobenzidine (Anti-kardiale Troponin T, braun) und Hämatoxylin nuklearen gegenfärbung, (C ) Picrosirius Rote Fleck für Kollagen mit schnell grün zytoplasmatischen gegenfärbung und (D) Maus Anti-α-Actinin Antikörper (grün) und 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) nukleare gegenfärbung (blau). Ausrichtung der Zellen unterscheidet sich durch das Konstrukt Design und Gewebe Verdichtung. Maßstabsleiste in A gilt für B und C sowie. In D sehen Sie gestreift Kardiomyozyten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Maßgeschneiderte PDMS-Schimmel-Geometrien, die kompatibel mit Gewebekultur sind haben großen Nutzen in der Abstimmung wichtige technische Gewebeeigenschaften, z. B. Ausrichtung der Zellen, Diffusionsgeschwindigkeit und effektive Steifigkeit. Darüber hinaus sind diese Formen sehr nützlich für die Zubereitung von Geweben für Analyse-Anwendungen in denen Geometrie, wie mechanische Tests16,17ankommt. Vorbereitung dieser Geräte vom Laser geschnitten negative Meister-Schimmel Angebote eine schnelle, einfache und kostengünstige Methode, diese Tools zu nutzen, vor allem im Vergleich zu den Zeit- und Kostenaufwand verbunden mit traditionellen Microfabrication. Laserschneiden ermöglicht auch eine größere maximale Schimmel-Größe, begrenzt nur durch die Bett Größe des Fräsers. Wir haben diese vielseitige Formen erfolgreich eingesetzt, um eine Vielzahl von Studien mit veränderter kardialen Gewebe, einschließlich optischen Mapping des Aktionspotentials Vermehrung, Beurteilung der Kraft Produktions- und passiv mechanischen Eigenschaften und Implantation ausführen in einem Rattenmodell Myokardinfarkt13,18. Wir erkennen, dass jenseits der Forschung Nische des Herz-Kreislauf-regenerative Technik, die Anwendungen für die Felder Gewebetechnik, Drug-Delivery und Materialforschung weite.
Zwar gibt es einige technisch anspruchsvolle Schritte bei der Herstellung der Formen selbst, gibt es eine Reihe von kritischen Schritte bei der Erstellung von funktionellen Geweben beteiligt. Wenn Konstrukte nicht der umgebende Matrix nach 24 h kompakt, überprüfen Sie zunächst die Zellviabilität durch Lebensfähigkeit Färbung der technischen Gewebe. Sollten Sie Zellviabilität hoch ist, Änderung der Konstrukt-Zusammensetzung für den nächsten Satz von Gewebe. Ergebnisse variiert stark abhängig von der Zellpopulation, haben wir erhöhte Verdichtung verbunden mit höherer Dichte Aussaat und niedrigeren Kollagen-Konzentrationen beobachtet. Schließlich kann es auch sinnvoll, die kernigen Zellpopulation mit einem Zelltyp gut geeignet für die Umgestaltung der Matrix, wie z. B. Fibroblasten, Förderung der Verdichtung zu ergänzen sein.
Eine Einschränkung dieser Formen ist das Potenzial für PDMS zu kleine hydrophobe Moleküle adsorbieren. Während für unsere Anwendungen dies nicht problematisch gewesen ist, kann es von Interesse in Tests sehr empfindlich auf den Verlust dieser Moleküle sein. In diesen Fällen kann PDMS Protein Adsorption durch Behandlung mit einem Antifouling Mittel wie Polyhydrophilic oder Polyzwitterionic Materialien19gemildert werden. Alternativ könnte eine sterilisierte PDMS-Form als negative Meister (von einem Laser geätzt Positivform) für eine Kultur-Form in eine andere, nicht-Adsorbens Material, wie z.B. Agarose gegossen werden vorbereitet werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Autoren erkennen Finanzierung von NIH R00 HL115123 und Brown University School of Engineering. Sie sind auch dankbar für die Braun-Design-Workshop und Chris Bull für die Ausbildung und Unterstützung bei der Laser-Cutter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Item | |||
| Bovine fibrinogen | Sigma | F8630-5G | Constructs |
| Bovine thrombin | Sigma | T6634-250UN | Constructs |
| Bovine aprotinin | Sigma | 10820-25MG | Constructs |
| Rat tail collagen I, 4 mg/mL | Advanced Biomatrix | 5153-100MG | Constructs |
| Sodim chloride | Fisher | BP358-10 | Constructs |
| PBS | Life Technologies | 14190-250 | Constructs |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Constructs |
| Sylgard 184 silicone elastomer | Corning | 4019862 | PDMS Molds |
| Lab tape | Fisher | 15-901-5R | PDMS Molds |
| Acrylic, 1/4" thick | McMaster-Carr | 8560K356 | PDMS Molds |
| HEPES Buffer, 1 M | Sigma | H3537-100ML | Constructs |
| RPMI 1640 medium, powder | Fisher | 31800-089 | Constructs |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher | AC423520250 | Constructs |
| Magnesium chloride hexahydrate | Fisher | M33 500 | Constructs |
| Potassium chloride | Sigma | P9541-500G | Constructs |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9390-500G | Constructs |
| Glucose | Sigma | G5767-25G | Constructs |
| OCT | VWR | 25608-930 | Histology |
| Frozen block molds | VWR | 25608-916 | Histology |
| Hematoxylin | Fisher | 3530 1 | Histology |
| Eosin Y | Fisher | AC152880250 | Histology |
| Fast green FCF | Fisher | AC410530250 | Histology |
| Software | |||
| Illustrator | Adobe Systems | Vector Graphics | |
| Inkscape | (Open Source) | Vector Graphics | |
| UCP (Universal Control Panel) | Universal Laser Systems | Laser Cutter Interface | |
| Equipment | |||
| PLS6.75 Laser Cutter | Universal Laser Systems | Laser Cutter | |
| Micromechanical Analyzer | Aurora Scientific | 1530A with 5 mN load cell | Mechanical Analysis |
References
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