Summary
Burada biz hidrojel tabanlı karmaşık geometriler mühendislik kurcalayarak üretmek için kullanılan özel polydimethylsiloxane kalıpları imalatı için hızlı, facile ve düşük maliyetli bir yöntem mevcut. Ayrıca bu tekniği kullanılarak üretilen mühendislik kalp dokuları üzerinde yürütülen mekanik ve histolojik değerlendirme sonuçları açıklanmıştır.
Abstract
Doku mühendisliği alanında olgun devam etmiştir olarak artan doku parametreleri, doku şekli de dahil olmak üzere geniş bir ilgi oluştu. Doku şekil mikrometre santimetre ölçek üzerinde manipüle hücre hizalama doğrudan, etkili mekanik özelliklerini değiştirmek ve gerekeni yapabileceğimizi için besin difüzyon ile ilgili sınırlamalar. Buna ek olarak, bir doku hazırlanan gemi mekanik dokusu daha fazla hücre ve matris yapısı etkileyebilir stres alanlarında sonuçlanan, kısıtlamalar aktarabilir. Son derece tekrarlanabilir boyutları şekilli kurcalayarak hangi örneğinde tüm doku mekanik analizi gibi kritik boyutlardır vitro deneyleri için yardımcı programı da mevcuttur.
Bu el yazması lazer kazınmış akrilik hazırlanan negatif ana kalıpları kullanan bir alternatif üretim yöntemini açıklar: bu kalıpları de polydimethylsiloxane (PDMS) ile gerçekleştirmek, santimetre ölçekte ve özellik boyutlu tasarımlar izin boyutları 25 µm, daha küçük ve hızlı bir şekilde tasarlanmış ve düşük bir maliyetle ve en az uzmanlığı ile imal edilmiştir. Çok az zaman ve maliyet gereksinimleri lazer kazınmış kalıpları için isteğe bağlı bir tasarım belirlenir kadar hızla üzerine tekrarlanır ve ilgi, doku mühendisliği alanı dışında da dahil olmak üzere herhangi bir tahlil uyacak şekilde kolayca adapte olmak için izin verir.
Introduction
Son iki yılda, yumuşak litografi kapsamlı bir imalat Teknik olarak özellikle havacilik, malzeme araştırma ve doku mühendisliği1,2alanlarında bilimsel araştırmaları desteklemek için kullanılmıştır, 3. Nesne istenen şeklinde bir negatif Ana kalıp, oluşturulduğu yineleme kalıplama üreten bir uygun ve ucuz Yöntem PDMS çoğaltır olumlu hydrogels şeklinde döküm için kullanılabilir sunar. Ancak, gerekli negatif ana kalıpları genellikle pahalı, zaman alıcı, boyutu, sınırlı microfabrication teknikleri kullanılarak üretilen ve temiz oda alanı ve gelişmiş donanımları gerektirir. 3D baskı olası bir alternatif sunarken, yararını biraz daha düşük maliyetli yazıcılar ve yaygın 3D printerlere harcama maddeler polimerler ve kür engellediğini PDMS arasındaki kimyasal etkileşimler çözünürlük sınırları nedeniyle sınırlıdır.
Lazer kesme sistemleri hem kesme ve plastik, ahşap, cam ve metal gibi maddeler aşındırma özelliği son zamanlarda büyük ölçüde daha ucuz ve bu nedenle araştırma araçları imalatı için daha erişilebilir hale gelmiştir. Ticari kalite Lazer kesiciler nesneleri en az özelliklerle 25 µm küçük santimetre ölçekte imalatı yeteneğine ve daha fazla en az terbiye, uzmanlık ve kullanmak için zaman gerektirir. Lazer ablasyon PDMS, daha önce Havacilik cihazlar fabrikasyon kullanılan iken bilgimizi yok el yazması bir işlem tarafından hangi milimetre ve santimetre negatif ana kalıpları4 kesme lazer ölçek kalıpları fabrikasyon nitelendirdi .
Öncelikle besin difüzyon, hücresel hizalama ve mekanik özellikleri5,6,7geliştirmek için tasarlanmış doku şeklinde işlemek için bu tekniği kullanmış. Ancak, bu teknik çok yönlülüğü kalıp hydrogels ilaç teslim ve malzeme bilimi araştırma8gibi ilgi nerede herhangi bir alanda kullanımı için izin verir. Bir lazer kesici erişim sayesinde, neredeyse herhangi bir geometri (yani kaldırma bu yazının kapsamı dışındadır bir çok parçalı kalıp olmadan inhibe) çıkıntılar olmadan için PDMS kalıp çoğaltır yapılabilir ve lazer bed boyutlarının içinde uyuyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. vektör biçimi Ana kalıp tasarımları oluşturmak
- Vektör biçimi bir vektör grafik programı kullanarak istediğiniz kalıp geometride bir araya ( malzeme, ekipman ve Yazılımlar tablosunabakın). Dosyayı seçin | Yeni ve RGB renk biçimi ile uygun boyutları bir tuval oluşturun. Sol panelinde Şekil araçları kullanarak istenen geometri oluşturmak: (Eğer başlangıçta görünür değil üst Dönüştür düğmesini tıklatın) penceresinin en üstündeki istediğiniz boyutları girin şekli boyutları tam olarak tanımlamak için.
Not: Kalıp geometrileri için en dıştaki özellikleri kenarı ile kesme hattı arasında en az 6 mm kenarlık kalıp döküm takip PDMS menisküs kırpma izin vermek için izin vermelisiniz. Bu bitmiş kalıp kültür çanak alt ile aynı hizada düzenlemek izin verir. Ayrıca, kalıp geometrileri çentik genişlik ve minimum özellik boyutu da dahil olmak üzere kullanılacak, lazer kesici modeli ile ilişkili dikkate sınırlamalar almalıdır. Açıklanan iş için kullanılan lazer burada ( malzeme, ekipman ve Yazılımlar tablosunabakın) 0.2 mm çentik genişlik ve 25 µm (1000 maksimum DPI) en az kazınmış özellik boyutunu seçme. Kalıp boyutları 10 cm çanak veya 6 - veya 24-da tabak gibi bir istenen kültür gemi karşılamak için seçilebilir. - Pencerenin sol üst köşesindeki Renk Seçicisi'ni açıp yeni renk örneklerini lazer kesici yazılımı ile uyumlu tanımlayın.
Not: Kırmızı (RGB 255, 0, 0) kesme için kullanın ve gravür için mavi (RGB 0, 0, 255). (Örneğin, birden fazla gravür derinlik arzu edilirse) ek renk örnekleri tasarımı için gereksinimleri bağlı olarak tanımlanabilir.- Bu renk örneğini renk yolunu seçtikten sonra yol renk için kesme örneği ve [yok] dolgu rengi için Renk Seçici'den kesme yolları atayın.
- Benzer şekilde, nesneyi seçerek ve sonra dolgu rengi için gravür yolu ve [yok] yol renk için Renk Seçici'den seçerek yolları aşındırma için renk örneği renkleri atayın.
- Either.ai or.pdf dosya biçimleri, vektör grafik programı ve lazer kesici uyumluluğu (Şekil 1A ve Ek dosya) bağlı olarak farklı tasarımlar Kaydet.
2. akrilik Master kalıpları lazer kesim
- Bir negatif Ana kalıp malzeme seçin.
Not: Çeyrek inç kalın akrilik lazer kesim, nispeten düşük maliyetli ile uyumluluk nedeniyle bu uygulama için uygundur ve özellikler için fazla izin verir kalınlığı ~ 5,5 mm içinde yükseklik. Ancak, aşağıdaki gereksinimleri karşılayan diğer malzemeler de kullanılabilir: (i) Sigara PDMS kür ile; reaktif (ii) Sigara-gözenekli/güçlü yapıştırıcı tedavi PDMS için; (iii) keser ve temiz bir şekilde lazer kesici ile etches; (IV) tutar bir cam gibi devlet ilâ 60 ° C; (v) bir kalınlığı istenen en büyük özelliği yüksekliği ile uyumlu. - Lazer kesici kesme üreticinin belirtimlerine göre hazırlayın. Yeterli havalandırma kullanılır ve yatak yüksekliği seçilmiş negatif Ana kalıp malzemenin kalınlığı için düzgün kalibre edilmiş olun.
- Tasarım dosyası lazer kesici bağlı olduğu bilgisayarda bir vektör grafik programında açıp dosya | Baskı. Lazer kesici yazıcı olarak ayarlanır ve "Yapmak ölçeği" ölçekleme seçili olduğundan emin olun yazdırma iletişim kutusunun altındaki Yazdır düğmesini tıklatmadan önce tasarım bozulmasını önlemek için menü aşağı açılır.
- Lazer kesici yazdırma programı alt sağ köşedeki Ayarlar düğmesini tıklatın. Güç, hız ve bakliyat inç (PPI) ayarı başına her kesim/etch parametrelerini tüm tasarım özellikleri belirlemek için daha önce seçilen renkleri atayın.
Not: Burada, lazer kesici ile donatılmış bir 75 W ( malzeme, ekipman ve Yazılımlar tablosunabakın), kullanılan ayarları aşağıdaki lazer: % 100 güç, %1 hız ve 1.000 PPI keser temiz bir şekilde ¼" akrilik; % 100 güç, % 8 hız ve 500 akrilik 2.75 mm derinliğe PPI etches; ve % %5 100 güç, hız, akrilik 3,50 mm derinliğe 500 PPI etches. Bilinmeyen bir lazer kesici yapılandırma veya malzeme için Eğer, bu parametreler ampirik olarak test parça ile deneme yanılma yoluyla belirlenebilir. - Büyük yeşil düğmeye lazer lazer kesici yazılımında etch ve negatif Ana kalıp kesme tıklayın.
- Negatif ana kalıpları küçük fırçalar ve/veya basınçlı hava (Şekil 1B) ile herhangi bir kalıntı kesme enkaz kaldırarak PDMS döküm için hazır olun.
3. hücre veya doku kültürü için PDMS kalıpları hazırlama
- Onun üreticinin belirtimlerine göre PDMS döküm karışımı hazırlayın. 0,35 mL/cm2 Ana kalıp hazırlamak; Bu yükseklik ve kalıp özellikleri göre değişir.
- Degas vakum odasında hazır PDMS bağlı bir Standart laboratuvar vakum hattına (< 500 mmHg) tüm kabarcıklar ortadan kaldırıldı kadar veya 1 h için.
- Öyle ki kaseti uzanır kalıp vinil veya maskeleme bandı (renkli etiket teyp iyi çalışıyor) ile dış kenarını bant > 3 mm negatif Ana kalıp kazınmış yüzünü yukarıda. Sıkıca karşı daha sonra sızıntıları önlemek için kalıp yan bant basın.
Not: Akrilik Ana kalıp delik aracılığıyla varsa, kaset kalıp de (Şekil 1 c) altına uygulamak gerekli olabilir. - Degassed PDMS negatif Ana kalıp kazınmış yüzünü dökün.
Not: kalın PDMS dipleri kalıp rağmen PDMS kalınlığı uygulamaya, bağlı olacaktır hedef zorlu Imaging yapabilirsiniz. Minimum kalınlığı ~ 1.5 mm grev görüntüleme hakkında önemli noktalar ve Kalıp Temizleme kolaylığı arasında iyi bir denge. - PDMS kaplı negatif Ana kalıp vakum bir odaya yerleştirin ve tekrar tüm kabarcıklar ortadan kaldırıldı kadar veya 1 h için degas.
- Degassed PDMS kaplı negatif Ana kalıp en az 6 h. fırın raf düzeyinin olduğundan emin olun tedavi etmek için 60 ° C fırında yerleştirin. Alternatif olarak, bir gecede 37 ° C'de veya için ortam sıcaklığında tedavi PDMS izin ~ 72 h.
- Birden çok kalıp üzerinde aynı negatif Ana kalıp döküm edildi, onlar hala negatif Ana kalıp üzerinde iken bu kalıpları ayrı kesmek için bir razorblade kullanın. Sonra her PDMS kalıp negatif Ana kalıp kapalı soyma. PDMS Kalıplar yavaş yavaş ve dikkatlice toplanır sağlamak kalıp Özellik toplama sırasında yırtılma önlemek için.
- Bir tıraş bıçağı, döküm, kalıp yalancı düz yanı sıra daha fazla malzeme veya enkaz (Şekil 1 d) engel üzerinden menisküs bölgeleriyle kapalı gelene dek kırpın.
- Gerekirse, kalıpları ısıyla tarafından hücre/doku döküm için hazırlayın.
4. döküm kollajen ve Fibrin hidrojel dokular
Not: kısırlık korumak için uygun bir aseptik yordamı kullanın.
- Kalıplar istenilen geminin altına uygun. Doku kültürü tedavi plaka altına yeni kalıpları sıkıca karşı (PDMS hydrophobicity) nedeniyle tedavi edilmezse plastik kalıp basarak uygun.
Not: Ancak, doku kültürü tedavi Eğer Polikarbonat kullanılmak üzere ya da daha az sıkıca bağlı kalmak eğilimindedir, yeniden kullanılan kalıplar durumunda (örneğin, fibrin veya silikon dolgu macunu gecede tedavi) doğal veya sentetik yapıştırıcı eki sağlamak için kullanılabilir. - Fibrinojen, Trombin ve etkisiz kollajen öyle ki her istenen konsantrasyonu döküm dokusunda elde çözümleri döküm hazırlayın. Kollajen buz üzerinde döküm kadar tutun.
Not: Fibrinojen ve Trombin hemen önce döküm kadar karıştırmak için izin verilmemelidir. Gerekirse, fibrinojen ve Trombin çözümleri de polimerizasyon zamanı artırmak için soğuk. Biz-si olmak kullanılmış son fibrinojen konsantrasyonu arasında 0-8 mg/mL, 10-100 U/mL ve son kollajen konsantrasyon 0,8 - 2.0 mg/mL (Şekil 2) arasında arasında son Trombin konsantrasyon. Mühendislik kalp dokuları için sık sık cardiomyocytes 12 x 106 hücre/mL 1.6 mg/mL, 4 mg/mL Fibrinojen ve 20 U/mL Trombin, kullandığımız (Trombin hemen önce döküm eklenir). (Bu önerilen aralıklar) dışında bile en uygun konsantrasyonlarda ampirik olarak tespit edilmelidir. - Standart protokolleri takip hücre hasat ve döküm doku istenen ilk hücre yoğunluğu elde etmek uygun bir konsantrasyon, resuspend.
Not: Lian ve ark. içinde açıklandığı gibi insan indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı cardiomyocytes hasat edildi 9 hasat hücreler buz üzerinde tutmak. Hücre birim hücre süspansiyon hazırlarken için muhasebesi. En uygun aralıklar ile hücre nüfus (Şekil 2) değişir bekleniyor olsa sıra--dan 9-18 x 106 hücre/mL, hücre konsantrasyonları kullandık. - (Bkz. Adım 4.2 örnek için) fibrinojen, etkisiz kollajen ve hücre süspansiyon bir döküm karışım oluşturmak için birleştirir. Döküm mix buz üzerinde tutun.
Not: Fibrinojen ve Trombin sıcaklıklar ve konsantrasyonları polimerizasyon kinetik belirleyecektir; polimerizasyon döküm sırasında önlemek için bağlı olarak döküm karışımı ayrı toplu işlemleri ve döküm olacak yapıları hacmi hazırlamak gerekli olabilir. - Maruz kalacağı kalıp yüzeylerinin PDMS hydrophobicity azaltmak için döküm karıştırmak için tedavi (PDMS hydrophobicity protein adsorpsiyon artırmak ve döküm yapmak zor).
- Hidrofilik yüzey modifikasyonu ile oksijen plazma, gibi bir el yüksek frekanslı jeneratör (Örneğin, BD-20A Litton Mühendislik) ile davranarak elde. 3-5 s, 5 dk önce döküm için plazma tedavi hücre/jel karışımı ile temasa tüm kalıp yüzeylerinin maruz.
- Alternatif olarak Pluronic F-127 (% 1 w/v)10gibi bir yüzey aktif tedavi. Polarite değişikliği zaman içinde bozulabilir gibi döküm zaman, mümkün olduğunca yakın olarak yüzey işleme gerçekleştirin.
- Hemen döküm önce Trombin döküm karışımı için iyice yukarı ve aşağı kabarcıklar tanıtımı olmadan pipetting tarafından ekleyip karıştırın.
- Hızlı bir şekilde çalışma pipette döküm mix kalıpları içine karışımı tüm köşeleri ve kalıp yarıklar içine yatırmak ister kullanarak. Pipet çıkarma yapıları içinde kabarcık oluşumunu önlemek için ilk durağı ötesinde kaçının.
- 4,6 ve 4,7 olarak herhangi bir ek toplu işlemler döküm karışımı için gerekli adımları yineleyin.
- 37 ° C kuluçka 45 dk için doku kültürü taşıyıcıyı koyun. Kuluçka makinesi de nemlendirilmelidir değil, hücre medya yapı su kaybı önlemek için kuluçka önce kalıpları etrafında Kasası.
Not: Hücre ortam türü hücre türüne bağlıdır, ama kalp doku mühendislik yapıları için kullandığımız RPMI 1640 + B27 Özet. - 45 dakika sonra yapıları hood ve hücre medya ile kapak da kuluçka için dönmeden önce dönün.
- Hücre medya her 48-72 h hücre için gerektiği gibi değiştirin ve türü oluşturmak.
Not: Medya değişiklik en büyük hücre sağlık sağlamak için tedarikçi tarafından önerilen yönergeleri göre planlanmalıdır. Medya değiştirirken yapıları rahatsız edici önlemek için dikkatli olun. Biz yüzer yapıları ile ilgili sorunlar yaşamamış, ama bu durum ortaya çıkarsa, bu medya düzeyi genişletmek kalıp tasarımı uzun mesaj ekleyerek engellenebilir. - Kullanımdan sonra kalıpları sırayla ile % 10 çamaşır suyu, % 70 etanol, yıkama ve distile su. O zaman hava kuru ve otoklav yeniden kullanım için ilâ ~ 10 kat.
5. analiz teknikleri: Doku sıkıştırma
Not: matris remodeling dan kaynaklanan sıkıştırma doku canlılığı ve optik mikroskobu ve görüntü analizi ile kolayca ölçülebilir gelişim bir göstergesidir.
- Optik mikroskobu görüntüleri kalıpları 2 h 96 h için döküm sonra değişen zaman aralığı olarak kullandığınız, yapıları, toplamak.
Not: gerekli büyütme düşük derecesi nedeniyle, bir fotoğraf makinesi dağ diseksiyon mikroskop bu uygulamaya son derece uygundur. - ImageJ gibi bir görüntü analiz paketi görünür yapı alanında izleme (açık kaynak, imagej.nih.gov/ij/).
- Oranı ve sıkıştırma (Şekil 2) son derece analiz.
6. analiz teknikleri: Gerilme test
Not: Her iki etkin mekaniği (kuvvetler ya da tasarlanmış bir doku tarafından oluşturulan hücre aktivite nedeniyle suşları) ve pasif mekanik (kuvvetler ya da uygulamalı suşları veya kuvvetleri karşılık olarak üretilen suşların) birçok mühendislik kritik fonksiyonel özellikleri vardır doku ve bu özellikle mühendislik kalp dokuları için geçerlidir. Analizler için kullanılan micromechanical analyzer Malzemeler tabloaçıklanmıştır. Diğer mekanik test için aygıtlar aynı şekilde onlar sulu test etmek için izin ve uzunluk kontrolünü yeteneğine sahiptirler ve ölçüm aralıkları ve çözümleri üzerinde doku için ilgili kuvvet varsayarak uygulanabilir. Tek kare milimetre sırasına kesitsel alanları ve stiffnesses kPa onlarca sırasına olan dokular için 5 mN yük hücresi iyi bir seçimdir. Daha büyük ve daha sert malzemeler daha büyük bir yük hücresi gerektirir. Test önce güç dönüştürücü ve uzunluğu denetleyicisi düzgün kalibre emin olun.
- Uzunluğu denetleyicisinde açın, dönüştürücü, nabız jeneratör ve sıcaklık denetleyicisi ekibi.
- İçin mekanik test yalak Tyrode'nın çözüm (1.8 mM kalsiyum klorür, 1.0 mM magnezyum klorür, 5.4 mM potasyum klorür, 140 mM sodyum klorür, 0,33 mM sodyum fosfat, 10 mM HEPES ve GKD2O, pH 7.4 için ayarlanmış 5 mM glikoz) doldurmak kalp dokuları mühendislik. Öyle ki bir banyo sıcaklığı 37 ° c elde ısıl ayarlayın.
- Mekanik bir test protokolü etkin daralma veri toplamak için yük.
Not: Etkin contractile mekaniği hangi uzunluğu %5 zorlanma adımda arttırır % 30 bir uzunluk adım protokol 120 için düzenlenen kullanarak değerlendirilir varsa s kasılma gücü (Şekil 3A) üzerinde yük etkisini değerlendirmek için. Buna ek olarak, pasif mekanik özellikleri % 10 zorlanma/dk (Şekil 3B) sürekli zorlanma oranında çekme sonu protokolü kullanılarak değerlendirilir varsa. Bu iletişim kurallarının her ikisi de aktif ve pasif mekanik analiz için iyi başlangıç noktaları olarak hizmet verebilir. - Böyle serbestçe yüzen bir diseksiyon kapsamına dikkatle tasarlanmış doku yapısı PDMS kalıp üzerinden bağlantısını kesin.
Not: doku sıkıştırma uğramıştır Cellularized yapıları büyük olasılıkla zaten iç kalıp yüzeyler arasında ayrılacaktır ve bu gibi durumlarda en az düzenleme gereklidir.- Sıkıştırma serbest bırakmak yapı neden olmayacağından, yavaşça taraf ve doku zarar görmesini önlemek için kalıp alt yapı ayırt etmek forseps kullanın.
- Yavaşça yapı çekme forseps kullanıyorsanız ve mekanik test Kaplıcalar'a aktarmak.
- Yapı ile ilgilenen bir diseksiyon mikroskop, inşa etmek için güç dönüştürücü ve kol kol bağlı kanca bir ucunu bağlayın.
- Yapı uygulanan zorlanma yerleştirilir kadar micromanipulator kullanarak kolu kol pozisyonunu ayarlayýn. Sıfır uzunluk denetleyicisi ve denetleyicisi zorlamak.
- Böylece yapı boyutları görüntü analizi ölçülebilir diseksiyon kapsam aracılığıyla yapı görüntü.
- Aktif güç iletişim kuralı başlatmak ve toplanan kaydetmek protokol edildikten sonra veri tamamlandı (Şekil 3).
- Pasif mekanik veri de gerekliyse, kalmayıncaya kadar sıfır uygulanan yük kolu kol yeniden ayarlayın. Uzunluğu sıfır ve denetleyicileri zorla ve yapı bir saniye görüntü zaman önce yükleme ve pasif mekanik Protokolü (Şekil 3) başlatılıyor. Toplanan verileri kaydetmek.
7. analiz tekniği: Parafin Histoloji ve immünhistokimya
Not: Biz mühendislik doku bölümleri doku morfoloji en iyi korunmuş parafin blok kullanarak Imaging en büyük başarısı oldu. İşlemin tüm adımları olmalı dikkatli bir şekilde kabul ve işleme örnekleri vakum veya basınç olmadan, ampirik olarak uygun antijen alma yöntemleri belirleme ve birincil antikor titrating gibi mühendislik doku için uyarlanmış konsantrasyon. Donmuş bloğu slaytlar, hazırlamak için kullanma gibi diğer teknikleri, daha az zaman ve masraf bağlı olarak amaçlanan uygulama yeterli sonuçları verimli süre gerektirebilir.
- Bir diseksiyon kapsamına dikkatle tasarlanmış doku yapısı böyle serbestçe yüzen yavaşça PDMS ayırmak için yapı ve PDMS arasında kaydırdı forseps kullanarak PDMS kalıp üzerinden bağlantısını kesin. Bu yapıları fiksasyon için microcentrifuge tüp aktarın.
Not: Kırılgan yapıları ya da kalıp tarafından sağlanan statik stres durumu altında sabit kalıp içinde kültür çözümlerinde de değiştirip yapı fiksasyon sonra kalıp çıkarmadan sabit olabilir. - Mühendislik dokularda % 4 paraformaldehyde (PF) Oda sıcaklığında 10 dakika içinde batış tarafından sorunu hemen. Doku kalınlığı 1 mm den fazla 1 h tahmin etmek; aşırı düzeltme yok.
- Fosfat tamponlu tuz (PBS) kurcalayarak durulayın.
- Islak mendil tutmak, bir damla eozin 10-30 s için pembe leke ve % 70 etanol ile durulayın için üzerine yerleştirin.
Not: Pembe renk daha sonra kesit için parafin blok tanımlamak için yardımcı olur ve deparaffinization sırasında yıkadı. - Objektif kağıt doku ve yer bir Histoloji kasete sarın. Köpük pedler kasete doku düz tutmak için gerektiği gibi kullanın.
- Parafin işleme için hazır kadar %70 alkol ve mağaza 4 ° C'de kasete daldırın.
- Doku konsantrasyonları etanol (2 x 30 dk her 70, 95 ve % 100) artırmada dehydrating tarafından işlem. O zaman üç sıralı ksilen banyolar için 30 dk örnekleri banyo.
- Üç sıralı parafin banyoları için 30 dk örneklerinde daldırın.
- Kaset kadar sıcak, dikkatle açılmak ve eozin lekeli doku objektif kağıttan kaldırmak ve parafin sızmış doku parafin blok içinde embed. Örnek düz daha kolay kesit etkinleştirmek için kalıp dibinde yatıyordu için dikkatli olun.
- (5-8 µm kalınlığında) istediğiniz gibi bir microtome kullanarak doku bölüm ve mühendislik doku (Şekil 4) için en iyi duruma getirilmiş standart prosedürler kullanarak leke.
Not: morfoloji örnek olabilir tehlikeye rağmen alternatif parafin bölümlerine donmuş bloklar, kullanmaktır. Sabit yapıları % 30 sükroz 3 h ya da örnek dengelenmiş (Örneğin, bir gecede) olana PBS içinde yerleştirin. Donmuş bloklarda % 70 kullanarak orta dondurma OCT ile yapıları 1 h. yerleştirmek için orta donma çözüm 50/50 hacmen % 30 sukroz ve en uygun kesme sıcaklık (OCT) ile Döviz Kuru buz Bulamaç için hızlı blok plastik tepsilerde dondurma ile alkol. Bölüm 10-50 µm kalınlığında bölümlerine cryostat bloklarla.
8. analiz tekniği: Hücre hizalama
Not: doku şekli ve iç stres alanları manipüle hücre hizalama, birçok yerli dokuların bir belirleyici özelliği modüle.
- PDMS kalıpları geometrileri ilgi ile mühendislik doku yapıları hazırlamak.
- Kültür dönemin sonunda yapıları PBS içinde yıkayın, tamir %4 oranında PF (bkz. Adım 7.2) ve hasat yapıları görüntüleme için kesit ve histoloji tarafından (bkz. Bölüm 7) hazırlamak için veya tüm boyama monte edin.
Not: Tüm bağlama boyama Histoloji/immünhistokimya için benzer adımlar izlenir ama daha uzun kuluçka dönemleri gerektirir ve penetrasyon derinliği boyalar, antikorlar ve herhangi bir görüntüleme teknikleri (yapıları içine ışık penetrasyon derinliği gibi) olacak Yapı kompozisyon için ampirik olarak belirlenmesi gerekir. - Yatay düzlemde (paralel kalıp alt boyutunda) doku bölümlerde yönlendirmek ve faiz hücresi için bir işaretçi için leke. Aktin stres lifleri çoğu hücre tiplerinin işaretlemek için phalloidin gibi bir f-aktin etiketi kullanın. Alternatif olarak, bir hücre belirli işaretçisini kullanın.
Not: mühendislik kalp dokuları söz konusu olduğunda, α-Aktinin ile lekeli sarcomeres yönünü tespit edilmiştir. - El ile tüm hücreleri veya çekirdek ilgi bölgede Binbaşı ekseni değerlendirmek veya bir analizi ile aracı (Örneğin, ImageJ, MATLAB).
Not: Farklı bölgelerinde aynı yapı ("düğüm" ve "paket" bölgelerde bir kafes gibi geometri, ya da "çekirdek") ve "edge" dairesel bir geometri gibi geometri bağlı olarak kategorilere ayırmak yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Optik lazer kesici kazınmış alanları çok hafif derinlik artar aşındırma olarak boyutları düştü neden olur ve sonuçlarında duvarlar çok ince bir eğim ile nedeniyle lazer demeti sivrilen için kalıp. Bu döküm PDMS kalıpları kaldırılmasını kolaylaştırmak yardımcı olur, ancak çok derinden negatif ana kalıpları kazınmış eğer dikkatle düşünülmelidir (> 6 mm) vardır (Şekil 1) gerekli.
Kültür zaman içinde cellularized yapıları nedeniyle, yine de oranı ve için bu hücre yük, iskele kompozisyona bağlıdır gerçekleştiği ölçüde remodeling ve koşullar kültür matris düzenleyin.
Matris remodeling reorganizasyon ve bozulma, yasam çevresindeki matris (aynı zamanda yeni matris birikimi) ile ortaya çıkabilir, ama genellikle mekanik sertlik kesit alanı azalma nedeniyle bir artış ile ilişkilidir. Salt kollajen yapıları ile 1.6 mg/mL kollajen ve 12 x 106 cardiomyocytes/mL oluşan yapıları bkz: kompakt 19.7 ± 2.8 oranında ilk genişliklerini sıkıştırma tahlil döküm (Şekil 2) aşağıdaki dört gün içinde. Bu tahlil 3D bir süreç bir temsilcisi 2D yaklaşım verir, veri toplama ve non-yıkıcı doğa kolaylığı yaparken, bu yapı geliştirme süreci eğitim için güçlü bir araç. Hücreleri, yokluğunda bile hücre kültür koşullarda kollajen mekaniği nedeniyle her ikisi de zamanla kendinden montajlı değişebileceğini Not ve cross-linking11. Fibrin hızla fibrinolitik tarafından bozulmuş vivo içinde ve vitro huzurunda bir antifibrinolytic Eğer, aprotinin veya aminocaproic asit12gibi. Bu nedenle, uzun vadeli doku kalkınma ve sadece doku oluşumu, iskele bileşenleri etkisini bir yapı formülasyon seçerken dikkate alınmalıdır. Son doku boyutu belirli bir uygulama için önemli ise, sıkıştırma da kalıp tasarımı ve ampirik olarak düşünülmelidir belirlenen hücre türleri ve matris kompozisyona göre. Bu doku sıkıştırma da stres alanları cellularized yapıları hücre hizalama (Şekil 4) teşvik etmek için manipüle edilebilir doku içinde neden olabilir unutmayın.
Literatürde mühendislik dokular oluşturmak için kullanılan çok çeşitli iskele polimer konsantrasyonları ve ilk hücre yoğunluğu tohum ve bu öncelikle çeşitli hücre tipleri, hücre satırları ve uygulamalar için farklı gereksinimleri bağlanabilir. HiPSC elde edilen cardiomyocytes ile kendi çalışmalarını dayanarak, inanıyoruz ki 1.25 mg/mL ve tohum yoğunluğu kollajen konsantrasyon ~ 15 milyon hücre/mL olan iyi bir başlangıç noktası13. Alternatif olarak, fibrin yaygın bir kalp doku iskele malzeme olarak de, genellikle 3-4 mg/mL14aralığında kullanılır. Bir dizi faktöre bağlı olarak uygulamanın temel hücre yoğunluğu tohum seçilebilir, ancak yerel doku hücre yoğunlukları iyi referans noktası sağlar. Ayrıca yüksek konsantrasyonlu hücre çözümleri özellikle küçük birimler için çalışmak zor olabilir düşünün. Belli bir hücre nüfus için iskele formülasyonu ayarlanabilir; dokular çok kırılgan veya sıkıştırma ve dokular çok sert ya da başaramamak-e doğru15kompakt polimer konsantrasyon artırma üzerine kırmak genellikle ile polimer konsantrasyonu artan.
Herhangi bir zamanda pasif mekanik analiz gerçekleştirmeden önce kültür sırasında noktası, mekanik yapı örnek yaygõn uygun olabilir. Doğal polimer hydrogels Önkoşullanma ve mühendislik doku malzeme alakalıdır nedeniyle test sonucunun tekrarlanabilirlik artırmak ve yapý bir klinik sergileyecek özellikleri daha iyi bir gösterge sağlar uygulama. Biz bir üçgen dalga mekanik değerlendirme (Şekil 3) başlamadan önce zorlanma/dk % 10 oranında % 10 baskı 8 döngüleri kullanın.
Doku ve hücre tipi belirli morfoloji Histoloji ve immünhistokimya geleneksel yöntemleri ile tespit edilebilir. Ancak, bu duruma getirilmesi için karşılaştırıldığında mühendislik kalp doku kaplama hücreleri veya yerel kesitli parafin katıştırma, kesit, antijen alma ve boyama gerekli olmuştur işleme, neredeyse tüm adımları bulduk doku (Şekil 4).
Resim 1 : Tasarlama ve lazer üzerinden PDMS kalıpları hazırlama sürecinin hatları kesilmiş akrilik masters. (A)kalıp tasarım vektör grafik biçiminde hazırlanmıştır. (B) Cleaned lazer kazınmış akrilik negatif usta. (C) PDMS bantlanmış akrilik Ana kalıp yüzeyinde döküm. (D) elde edilen PDMS doku kültürü önce sterilizasyon için hazır kalıp. İç metin: üstten görünüm, aynı ölçek. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : İnşa sıkıştırma zaman içinde kültür. Zaman içinde kültür onaylatılacak sıkıştırma içinde hazırlanan dikdörtgen yapıları,(a)görüntüler. Yeşil bindirmeleri görüntü analizi için görünür yapı alanı hesaplamak için kullanılan maskeler temsil eder. (B) Arsa yapı alanı (yapı sıkıştırma, iki boyutlu ölçülü) zaman içinde. Yatay çizgiler ortalama değerleri temsil eder ve hata çubukları standart sapma gösterir. Tüm grupların, n = 3 ve * p gösterir < ANOVA tarafından değerlendirilen olarak 0,05. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Mekanik mühendislik kalp dokuları karakterizasyonu için ham izleri. İnsets bir tek temsilcisi seğirme daralma izleme (ana arsa olarak aynı eksen) görüntüler. (A)etkin mekanik yanıt hızlı adımları tutar % 5 zorlanma artışlarla, ardından kaynaklanan. Bir çekme sonu test % 10 zorlanma/dk hızında kaynaklanan (B) pasif mekanik yanıt. Tüm örneklerini bir Tyrode'nın çözüm 37 ° C banyosunda analiz edildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Parafin blok mühendislik kalp doku yapıları çeşitli tasarımlar için Histoloji görüntüler. Parafin blok Histoloji görüntüler mühendislik kalp doku yapıları çeşitli tasarımlar için(a)Hematoksilen ve eozin, (B) diaminobenzidine (Anti-kardiyak troponin T, kahverengi) ve Hematoksilen nükleer counterstain, (C ile lekeli ) picrosirius kırmızı leke kollajen hızlı yeşil sitoplazmik counterstain ve (D) fare anti-α-Aktinin antikor (yeşil) ve 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) nükleer counterstain (mavi) ile için. Hücre hizalama yapı tasarım ve doku sıkıştırma işlemi sonucu olarak farklıdır. Ölçek çubuğu a B ve C için de geçerlidir. D iç metin çizgili cardiomyocytes gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Doku kültürü ile uyumlu olan özelleştirilmiş PDMS kalıp geometrileri hücre hizalama, difüzyon oranı ve etkili sertlik gibi önemli mühendislik doku özelliklerini ayarlamanın büyük yarar var. Ayrıca, bu kalıpları çok geometri mekanik test16,17gibi önemli olduğu çözümleme uygulamaları için doku hazırlamak için yararlıdır. Bu aygıtlardan Lazer hazırlanıyor negatif Ana kalıp teklif etmek zaman özellikle zaman ve maliyeti ile geleneksel microfabrication göre bu araçları kullanan, facile, hızlı ve düşük maliyetli bir yöntem kes. Lazer kesim aynı zamanda büyük bir maksimum kalıp boyutu, yalnızca kesici yatak boyutu tarafından sınırlı izin verir. Biz başarıyla çalışmaları ile mühendislik kardiyak dokular, Aksiyon potansiyeli yayılma optik haritalama, güç üretim ve pasif mekanik özellikleri ve implantasyon değerlendirme de dahil olmak üzere çok çeşitli yürütmek için bu çok yönlü kalıplar kullanmıştır bir sıçan modelinde miyokard infarktüsü13,18. Biz araştırma niş kardiyovasküler Rejeneratif Mühendislik alanları doku mühendisliği, ilaç dağıtım ve malzeme araştırma uygulamalarda büyük tanır.
Kalıp kendilerini fabrikasyon birkaç teknik olarak zor adım iken, orada birkaç kritik adım fonksiyonel doku oluşturmada. Yapıları çevreleyen matris 24 h sonra kompakt için başarısız olursa, öncelikle mühendislik dokuların canlılığı boyama yoluyla hücre canlılığı onaylamak. Hücre canlılığı yüksekse, dokuların sonraki seti için yapı kompozisyon değiştirme göz önünde bulundurun. Sonuçlar büyük ölçüde hücre nüfus bağlı olarak değişiklik gösterir iken, yüksek sıkıştırma daha yüksek tohum yoğunlukları ve alt kollajen konsantrasyonları ile ilgili gözlemledim. Son olarak, aynı zamanda numaralı seribaşı hücre nüfus sıkıştırma teşvik etmek için de matris, tadilat nedeniyle fibroblastlar gibi uygun bir hücre tipi ile tamamlamak yararlı olabilir.
Bu kalıpları bir sınırlama PDMS küçük hidrofobik moleküller absorbe için potansiyel mevcuttur. Süre bizim uygulamaları için bu sorunlu olmuştur değil, endişe içinde deneyleri bu moleküller kaybına yol çok hassas olabilir. Bu gibi durumlarda, PDMS protein Adsorpsiyon Malzemeleri19polyhydrophilic veya polyzwitterionic gibi bir zehirli aracı ile tedavi yoluyla azaltılabilir. Alternatif olarak, steril bir PDMS kalıp olarak özel gibi başka sigara adsorbent malzeme artığını bir negatif ustadan (lazer kazınmış olumlu küf) bir kültür kalıp için hazırlanmış.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar NIH R00 HL115123 ve Brown Üniversitesi Mühendislik Fakültesi fon kabul etmiş oluyorsunuz. Onlar da eğitim için Brown tasarım atölyesi ve Chris Bull için minnettarız ve lazer kesici ile destek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Item | |||
| Bovine fibrinogen | Sigma | F8630-5G | Constructs |
| Bovine thrombin | Sigma | T6634-250UN | Constructs |
| Bovine aprotinin | Sigma | 10820-25MG | Constructs |
| Rat tail collagen I, 4 mg/mL | Advanced Biomatrix | 5153-100MG | Constructs |
| Sodim chloride | Fisher | BP358-10 | Constructs |
| PBS | Life Technologies | 14190-250 | Constructs |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Constructs |
| Sylgard 184 silicone elastomer | Corning | 4019862 | PDMS Molds |
| Lab tape | Fisher | 15-901-5R | PDMS Molds |
| Acrylic, 1/4" thick | McMaster-Carr | 8560K356 | PDMS Molds |
| HEPES Buffer, 1 M | Sigma | H3537-100ML | Constructs |
| RPMI 1640 medium, powder | Fisher | 31800-089 | Constructs |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher | AC423520250 | Constructs |
| Magnesium chloride hexahydrate | Fisher | M33 500 | Constructs |
| Potassium chloride | Sigma | P9541-500G | Constructs |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9390-500G | Constructs |
| Glucose | Sigma | G5767-25G | Constructs |
| OCT | VWR | 25608-930 | Histology |
| Frozen block molds | VWR | 25608-916 | Histology |
| Hematoxylin | Fisher | 3530 1 | Histology |
| Eosin Y | Fisher | AC152880250 | Histology |
| Fast green FCF | Fisher | AC410530250 | Histology |
| Software | |||
| Illustrator | Adobe Systems | Vector Graphics | |
| Inkscape | (Open Source) | Vector Graphics | |
| UCP (Universal Control Panel) | Universal Laser Systems | Laser Cutter Interface | |
| Equipment | |||
| PLS6.75 Laser Cutter | Universal Laser Systems | Laser Cutter | |
| Micromechanical Analyzer | Aurora Scientific | 1530A with 5 mN load cell | Mechanical Analysis |
References
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protoc. 5, 491 (2010).
- Rogers, J. A., Nuzzo, R. G. Recent progress in soft lithography. Mater. Today. 8, 50-56 (2005).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft Lithography in Biology and Biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
- Isiksacan, Z., Guler, M. T., Aydogdu, B., Bilican, I., Elbuken, C. Rapid fabrication of microfluidic PDMS devices from reusable PDMS molds using laser ablation. J. Micromechanics Microengineering. 26, 035008 (2016).
- Lee, K. Y., Mooney, D. J. Hydrogels for Tissue Engineering. Chem. Rev. 101, 1869-1880 (2001).
- Kloxin, A., Kloxin, C., Bowman, C., Anseth, K. Mechanical properties of cellularly responsive hydrogels and their experimental determination. Adv. Mater. Deerfield Beach Fla. 22, 3484-3494 (2010).
- Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31, 6941-6951 (2010).
- Jaiswal, M. K., et al. Vacancy-Driven Gelation Using Defect-Rich Nanoassemblies of 2D Transition Metal Dichalcogenides and Polymeric Binder for Biomedical Applications. Adv. Mater. 29, (2017).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nat. Protoc. 8, 162-175 (2013).
- Boxshall, K., et al. Simple surface treatments to modify protein adsorption and cell attachment properties within a poly(dimethylsiloxane) micro-bioreactor. Surf. Interface Anal. 38, 198-201 (2006).
- Pins, G. D., Christiansen, D. L., Patel, R., Silver, F. H. Self-assembly of collagen fibers. Influence of fibrillar alignment and decorin on mechanical properties. Biophys. J. 73, 2164-2172 (1997).
- Pipan, C. M., et al. Effects of antifibrinolytic agents on the life span of fibrin sealant. J. Surg. Res. 53, 402-407 (1992).
- Roberts, M. A., et al. Stromal Cells in Dense Collagen Promote Cardiomyocyte and Microvascular Patterning in Engineered Human Heart Tissue. Tissue Eng. Part A. 22, 633-644 (2016).
- Ye, K. Y., Sullivan, K. E., Black, L. D. Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering. JoVE. , (2011).
- Zimmermann, W. H., et al. Tissue Engineering of a Differentiated Cardiac Muscle Construct. Circ. Res. 90, 223-230 (2002).
- McCain, M. L., Agarwal, A., Nesmith, H. W., Nesmith, A. P., Parker, K. K. Micromolded Gelatin Hydrogels for Extended Culture of Engineered Cardiac Tissues. Biomaterials. 35, 5462-5471 (2014).
- Hu, J. J., Chen, G. W., Liu, Y. C., Hsu, S. S. Influence of Specimen Geometry on the Estimation of the Planar Biaxial Mechanical Properties of Cruciform Specimens. Exp. Mech. 54, 615-631 (2014).
- Munarin, F., Kaiser, N. J., Kim, T. Y., Choi, B. R., Coulombe, K. L. K. Laser-Etched Designs for Molding Hydrogel-Based Engineered Tissues. Tissue Eng. Part C Methods. 23, 311-321 (2017).
- Zhang, H., Chiao, M. Anti-fouling Coatings of Poly(dimethylsiloxane) Devices for Biological and Biomedical Applications. J. Med. Biol. Eng. 35, 143-155 (2015).
