Summary
. Kuga et al. גילה כי זרחון-סטטוס נוגדנים ספציפיים נגד אקטין מחייב חלבון girdin phosphorylated-טירוזין 1798 (pY1798) יכול לשמש כדי לתייג אניץ תאים (TCs). פרוטוקול זה מאפשר הדמיה חזקה של TCs באמצעות צביעת immunofluorescent של מעי צם לתרשים cryosections עם נוגדנים pY1798.
Abstract
חלבון מחייב אקטין girdin הוא חלבון cytosolic הנדרשת עבור אקטין שיפוץ לעורר נדידת תאים ברקמות שונות. Girdin הוא phosphorylated על ידי קולטן והן שאינו קולטן טירוזין kinases-טירוזין 1798. אומורי. ואח פיתח אתר, זרחון מצב ספציפי נוגדנים נגד girdin האנושי-טירוזין-1798 (pY1798), אשר במיוחד לאגד phosphorylated טירוזין-1798, אך לא unphosphorylated טירוזין-1798. נוגדנים pY1798 שימשו לתייג באופן ספציפי אניץ תאים (TCs) נמצאים ברקמות מערכת העיכול יונקים, אך הפונקציה של תאים אלה אינו ברור. פרוטוקול זה מאפשר את החזיית TCs. חזקים במעי הריק באמצעות נוגדנים pY1798 ו- immunofluorescence. כדי להבטיח ויזואליזציה TC מוצלח ופשוט, פרוטוקול זה כולל שתי טכניקות היסטולוגית: הפקת cryosections לתרשים של רקמת מעי צם מלא ג'לטין, ואחזור אנטיגן בטמפרטורה נמוכה ב 50 מעלות צלזיוס במשך 3 ח' מילוי הריק עם ג'לטין שומרת על צורת סעיפים לתרשים לאורך כל ההליך מוכתמים, ואילו בטמפרטורה נמוכה אנטיגן אחזור מבטיחה אותות חזקים TCs. שימוש מוצלח של פרוטוקול זה מתבטא pY1798 כתמים TCs מופץ ועד סיסי הקריפטה. ויטראז'ים TCs יש של סומא בצורת סליל, אותות פלואורסצנט לדחוס בקצה lumenal, המתאים הבולטות 'אניץ.' צביעת Phalloidin colocalized עם pY1798-חיוביות TCs בגבול מברשת מעובה, מקביל מסה rootlet המשתרעת אניץ TC. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לבחון TCs ביופסיה האנושי הדגימות שנאספו עם אנדוסקופים במערכת העיכול. יתר על כן, TCs לאחרונה דווחו לצבור בעקבות זיהום טפיל בעכברים, פרוטוקול זה יכול שיש יישומים עבור אבחנה של זיהומים הטפיל בבטן האנושית.
Introduction
אניץ תאים (TCs) הם מרכיבים פזורים מינור של epithelia במערכת העיכול המאופיינת על ידי טאפטס הפסגה ו- somas בצורת סליל1. למרות TCs תוארו לראשונה ב- 19562, פונקציית TC עדיין לא ברור, חלקית עקב מחסור של סמנים TC אמין.
. Enomoto et al. תחילה מאופיין החלבון איגוד אקטין girdin3, שבא לידי ביטוי במערכת העצבים, כמו גם רקמות ללא עצביות כגון כלי דם, שסתומי הלב, הגידים, שרירי השלד4. עכברים עם אבלציה גנטי של girdin להציג פיגור גדילה ו-5,4,חריגות המוח מספר6. בינתיים, אובדן-של-פונקציה מוטציה ב girdin האנושית מזוהה עם אנצפלופתיה מתקדמת, פיגור קשה, התפרצות מוקדמת התקפים אפילפטיים7.
בשנת 2011, לין. ואח מזוהה זירחון דינמי של girdin-טירוזין 1798 מתווכת על-ידי טירוזין kinases כמו EGFR ו- Src8. הם גם הראו כי phosphorylated girdin נדרש עבור אקטין שיפוץ לעורר תא העברה8. אומורי. ואח פיתח אתר -, זרחון מצב ספציפי נוגדנים נגד girdin האנושי phosphorylated-טירוזין 1798 (נוגדנים pY1798) ע פ הפרוטוקול של גוטו, ואומת באמצעות מוטגנזה של נוגדנים הביטוי המומנט נשיאה באורך מלא girdin9,10. ב-2017, Kuga. et al. דיווחו על שהזאת pY1798 תוויות TCs עם ירידה לפרטים גבוהה, רגישות גבוהה1. נוגדנים pY1798 הוכחו להיות מעולה לסמני TC קודמת בהתבסס על מאפייני מכתימים מעולה שגילה הצורה התא כולו, כולל את המאפיין 'אניץ' בקצה lumenal, ובכל זאת את התפקיד הביולוגי של girdin ופוספו-girdin ב- TC הפונקציה נשאר לא ברור1.
השיטה המתוארת במחקר זה כרוך immunofluorescence מכתים, טכניקה היסטולוגית כדי לסמן חלבון ספציפי על רקמות באמצעות של נוגדן ראשוני נגד חלבון המטרה של נוגדן מצומדת פלורסצנטיות משני נגד הראשית נוגדן. מטרת שיטה זו היא לאפשר לחוקרים עם ניסיון מוגבל היסטולוגית להשיג תמונות TC באיכות גבוהה. פרוטוקול זה משתמש cryosections לתרשים למנוע את הצורך cryosections רכוב שקופיות, או שעוות פרפין סעיף. אולם, סעיפים לתרשים הם שבירים העדר תמיכה של זכוכית, העובי סעיף יכול להפחית נוגדן חדירות. פרוטוקול זה כולל שתי גישות להתגבר על בעיות אלה: 1) ממלא את לומן מעי צם כולו עם ג'לטין כדי לשמר את המורפולוגיה של מקטעים לתרשים לאורך כל ההליכים מוכתמים, 2) השימוש בטמפרטורה נמוכה אנטיגן אחזור כדי להגביר אותות pY1798.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי חיה אכפת ועל שימוש הוועדה במכון מחקר התפתחותי, מרכז שירות האדם איצ'י (מספר יישומים: M-03).
1. תכשירים
- להכין L 10 תמיסת פוספט buffered (PBS): g 32.27 של נה2HPO4·12H2O, 4.5 גר' NaH2PO4·2H2O, g 80.0 של NaCl להוסיף מים הנדסה גנטית לאמצעי הסופי של פתרון ל חנות 10 בטמפרטורת החדר (RT).
- להכין 200 מ של PBS-t: 200 מ"ל של PBS מהשלב 1.1 עם 100 µL של polyoxyethylene(10) octylphenyl האתר עד ריכוז סופי של 0.05% (vol:vol). החנות RT.
- כשאתה לובש כפפות והגנה העין, להכין 50 מ של 15% סוכרוז בפתרון 10% buffered פורמלין נייטרלי: 7.5 גר' סוכרוז נוספו 10% buffered פתרון ניטרלי פורמלין (טבלה של חומרים) באמצעי אחסון הסופי של 50 מ ל. החנות RT.
התראה: אינהלציה ו/או עור/עיניים קשר פורמלדהיד בפתרון פורמלין נייטרלי 10% buffered יכולים להיות מסוכנים. לטפל בזהירות. - להכין 1.5 מ של 200 יחידות/mL phalloidin-פלורסנט לצבוע מניות פתרון תרכיב: phalloidin-פלורסנט צבע המספר המשלים (300 יחידות מבחנה 1, lyophilized מוצקים, עירור, פליטה אורכי גל: 581 nm ו 609 nm, בהתאמה) מושעה ב 1.5 מיליליטר . מתנול. חנות פתרון בחושך ב-20 ° C.
- הכנת 5 מ"ג / מ"ל 4', 6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (דאפי) במלאי פתרון: 10 מ ג של דאפי, ב- 2 מ של N, N-dimethylformamide (DMF). חנות פתרון בחושך ב-20 ° C.
- להכין 5% שור אלבומין (BSA) ב- PBS: 0.5 גרם של BSA, 10 מ ל- PBS. חנות ב 4 º C.
- להסיר את קצה משופע מחט בקוטר 18 ישר באמצעות אוחז, לצבוט את הקצה nipped עם פינצ'ר בכיוון לאורך כדי לאפשר לנוזל לזרום דרך המחט לומן (איור 1 א'1).
הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן.
2. בעלי חיים לנתיחה ובידוד של מעי צם
- זלוף קיבוע של עכבר
- יש ללבוש כפפות ולעבוד באזור מאוורר היטב.
- להכין גביע זכוכית 100 מ ל, 10% buffered פתרון ניטרלי פורמלין, כלי ניתוח (מספריים, מלקחיים), מגש מתכת, ניילון 6-0 לחתוך לך תפרים מחט בקוטר 18 ישר מוכן כמו 1.7, מחט המכונף 22-מד, מזרק 20-mL.
- לטעון 20 מיליליטר 10% buffered פורמלין נייטרלי פתרון מ כשהספל זכוכית לתוך המזרק 20-mL, וצרף את המחט המכונף קליבר 22 שקע.
- להכין ג'לטין נוזלי על-ידי הוספת 1 גר' אבקת ג'לטין 20 מ ל- PBS (ג'לטין 5% הסופי) ל שפופרת צנטרפוגה 50-mL. לאחר ההשרייה-RT למשך 15 דקות דגירה ב 50 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים למשך 15 דקות מבלי לרעוד.
- בקצרה מערבולת, דגירה ב 50 מעלות צלזיוס למשך עוד 15 דקות לחלוטין להמיס את הג'לטין. להשאיר את הצינור RT עד השימוש.
- המתת חסד של העכבר למבוגרים מאת נקע בצוואר הרחם.
- הנח את העכבר משלב 2.1.6 על מגש מתכת, עושים חתך קטן על העור דרך הסחוס ensiform באמצעות כלי ניתוח.
- להרחיב את החתך בשתי הידיים כדי לחשוף את האזורים בית החזה והבטן.
- פתח את הצפק לחשוף את הסרעפת, ולאחר מכן פתח הסרעפת משני הצדדים.
- לחתוך את כלוב בית החזה לאורך הקווים בבית השחי הקדמי משני הצדדים, ולאחר מכן להסיר את קיר בית החזה על ידי חיתוך בכיוון רוחבי במיקום של בלוטת התימוס לחשוף את הלב.
- עושים חתך קטן-auricle של אטריום ימין כדי לנקז את הדם ולהוסיפו מחט המכונף קליבר 22 השיא של החדר השמאלי. לחצו הבוכנה כדי perfuse הרקמות עם פורמלין נייטרלי 10% buffered פתרון.
- לאחר חשיפת איברים באגן הירכיים, לחתוך את הקצה של החלחולת מפי-הטבעת, להפריד את המעיים מהגוף על ידי גזירה את מצע המעי.
- כדי לבודד מעי צם, לחתוך את המעיים ב 4 ס מ בצד אנאלי antrum קיבה. למחוק את החצי אנאלי של המעי הדק הנותרים.
- קליפ מעי צם לשניים כדי להקל את ההליך שטיפה. עומס 20 מיליליטר 10% buffered פורמלין נייטרלי פתרון לתוך המזרק 20-mL, לצרף את המחט ישר אל תדאגי מוכן בשלב 1.7 שקע.
- להזריק 10% buffered פורמלין נייטרלי פתרון מקצה אחד של מעי צם החתוכים לחשוף את תוכן המעי וכדי לתקן את השטח לומן מעיים (איור 1 א'2).
- רחץ לומן מעיים באמצעות הזרקת PBS כפי שמתואר בשלב 2.1.15.
- ריקון ג'לטין נוזלי לתוך לומן מעיים כפי שמתואר בשלב 2.1.15 להחליף PBS עם ג'לטין נוזלי.
- קרוב לקצה מעי צם החתוכים על ידי תפרים מצדו באמצעות ניילון 6-0 לחתוך בתפר, למלא את הריק עם ג'לטין נוזלי וסגור בצד השני על ידי תפרים מצדו (איור 1 א'3).
- הוסף ארבע קשר תפירה כדי להתאים קטע מעי צם בצורת נקניק לחלק מדוכא cryomold (איור 1 א'4).
הערה: עבור cryomolds עם 20 מ"מ x 25 מ"מ x 5 סעיף ממ מדוכא, מקטע מעי צם כמו נקניק ~ 20 מ"מ עדיפה. - להשרות את הרקמות 50 מ של 15% סוכרוז בפתרון 10% buffered פורמלין נייטרלי בין לילה ב 4 º C.
הערה: השלבים הבאים להבטיח cryoprotection על ידי קיבוע סוכרוז, חלבון באמצעות פורמלין של ג'לטין ורקמות. Gelatinized-פורמלין הג'לטין לא נמסות-RT, ואילו שאינו קבוע ג'לטין gelatinized ב 4 ° C נמס ב RT.
3. הצמד הקפאה של רקמות מעי צם מלא ג'לטין
- על ידי חיתוך מעי צם-הקשרים התפירות, שלוש חתיכות מעי צם כמו נקניק עם שני הקצוות מאתרים מתקבלים (איור 1 א'4). יישר את השברים, כמו נקניקיות cryomold עבור תוספת של הטבעה מורכבת להכנה של דגימות רקמה קפוא.
- הצמד להקפיא את cryomold ב איזופנטאן מקורר עם חנקן נוזלי. חנות cryomolds ב-80 מעלות צלזיוס
הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן.
4. immunofluorescence של אניץ תאים באמצעות Cryosections לתרשים
- Cryosectioning
- מוגדר cryostat קאמרית טמפרטורה (CT) והן האובייקט טמפרטורה (OT)-22 מעלות צלזיוס. המקום הרקמה קפוא לחסום של cryomold בבית הבליעה cryostat למשך 15 דקות לפחות.
- להוסיף 3 מ"ל של PBS לצלחת תרבות 35 מ מ.
- להסיר את גוש רקמות קפואים cryomold, חותכים את גוש לשניים סכין גילוח לחשוף חלק רוחבי מעי צם. הר אחד חצי הרחוב על צ'אק (מתאם cryostat) כדי סעיף המישור החותך עם הלהב גילוח.
- מקטע מעי צם מלא ג'לטין למקטעים מיקרומטר בעובי 30. שימוש קפוא מלקחיים להעביר בעדינות את המקטעים לתוך המנה תרבות 35 מ מ מוכן בשלב 4.1.2 (איור 2Bנכון).
- היישום של נוגדנים ראשי
- לשטוף את הסעיפים לתרשים בצלחת תרבות 35 מ מ 3 פעמים במשך 5 דקות כל 3 מ ל PBS-T ברעידות מתון על מטרף הדדיים (כ 36 פעמים / min).
- להכין פתרון אחזור אנטיגן: mL 0.3 של אנטיגן אחזור פתרון להתרכז (טבלה של חומרים) ב- 2.7 מ ל מים הנדסה גנטית. להוסיף 3 מ"ל של אנטיגן אחזור פתרון לצלחת תרבות 35 מ מ המכיל מקטעים לתרשים.
- סגור את המכסה, לסגור את הפער בין המנה את המכסה עם רצועה של הקלטת ויניל, דגירה ב 50 מעלות צלזיוס חממה הכלאה עבור 3 שעות מבלי לרעוד.
- הסר את המנה חממה וקריר ב RT כעשרים דקות. לאחר הסרת את הקלטת ויניל, לשטוף את הסעיפים 3 פעמים במשך חמש דקות כל אחד עם 3 מ"ל של PBS-T ורעדתי מתון.
- האחות ה-PBS-T ולהוסיף 5 טיפות פתרון חסימה (טבלה של חומרים) על הסעיפים. תקופת דגירה-RT של חמש דקות עם טלטול מתון.
- להכין את הפתרון נוגדן ראשוני: µL 495 של BSA 5% ב- PBS עם µL 5 פוספו-Y1798 girdin (pY1798) נוגדנים (טבלה של חומרים). להוסיף 500 µL של פתרון נוגדן ראשוני על הסעיפים (הפתרון חסימה אין צורך להסירו).
- למקם את המנה בחדר דגירה humidified, דגירה בין לילה ב 4 ° C ברעידות מתון.
הערה: הדגירה לילה ניתן להרחיב עד שלושה לילות.
- היישום של נוגדנים משניים
- לשטוף את הסעיפים 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד ב- 3 מ"ל של PBS-T ברעידות מתון.
- להכין פתרון מניות דאפי מדולל: 2 µL של פתרון מניות דאפי (שלב 1.5), µL 998 ל- PBS.
- להפוך את פתרון נוגדנים משניים: 476 µL של 5% BSA ב- PBS, 10.5 µL של פתרון דאפי מדולל, µL 12.5 בפתרון מניות תרכיב phalloidin-פלורסנט לצבוע, µL 1 של עז ארנב אנטי איג-פלורסנט צבע המספר המשלים (אורך גל: עירור 496 ננומטר, פליטה 520 ננומטר).
- לאחר כ רפה בעברית ה-PBS-T, החלת הפתרון נוגדנים משניים, דגירה בחדר דגירה ממוגן-אור ב RT למשך 30 דקות ברעידות מתון.
- לשטוף את הסעיפים 3 פעמים במשך חמש דקות כל אחד עם 3 מ"ל של PBS-T ורעדתי מתון.
- לאחר השטיפה הסופית ה-PBS-T להסיר ולהחליף עם 3 מ"ל של PBS חסר polyoxyethylene(10) octylphenyl אתר. להעביר את המנה מיקרוסקופ סטריאוסקופי.
- במקום 200 µL ל- PBS ב- droplet על המרכז של זכוכית לבנה מצופים MAS שקופית והעברת מעי צם אחת מקטע מתוך קערה לתוך ה-droplet באמצעות טיפ pipet P200.
- לאחר התאמת היישור בסעיף תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי, תשאף כל PBS הנותרים המקיפים את המקטע.
- להוסיף 20 µL של הרכבה מימית מדיה ומניחים על coverslip 20 x 20 מ מ על גבי המדיה.
- מייד לאטום את הקצוות coverslip עם מדיה מבוססי קסילן הרכבה. למקם את השקופית מפות עץ ולאפשר את המדיה מבוססי קסילן הרכבה שבמהלכו ב RT במשך 2-3 h.
הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן. אחרי התקשורת מבוססת קסילן הרכבה מתמצק, השקופיות ניתן לאחסן במשך 2-3 שבועות בתוך קופסה שקופית ממוגן-אור-RT.
5. מיקרוסקופיה קונפוקלית
- לשים שמן טבילה על המטרה X 63 של מיקרוסקופ קונפוקלי. להנמיך את השקופית coverslip ומניחים את השקופית על הבמה.
- דיגיטייז את התמונות TC רכשה ננומטר לייזר אורכי גל 405, 488, 555, ולשמור את התמונות בתבנית tiff (.tiff).
הערה: בחר ערכת מסנן הזיהוי המתאים צבעי זריחה (קרי, עירור/פליטה maxima: 358/461 nm, 490/525, 590/617).
Representative Results
ג'לטין-מילוי של מעי צם
הליך טיפוסי למילוי מעי צם עכבר עם ג'לטין מוצג (איור 1 א'), כמו גם היתרונות של ג'לטין-מילוי (איור 1B). בקצרה, קצה המחט ישר. אל תדאגי משופע הוסר כדי להגן מפני פירסינג קיר הבטן (איור 1 א'1). מילוי ג'לטין הושג באמצעות 10% buffered פתרון ניטרלי פורמלין מוזרק מקצה אחד של מקטע מעי צם החתוכים ריקון המעי וכדי לתקן את השטח לומן מעיים (איור 1 א'2) לפני מילוי עם ג'לטין נוזלי ( איור 1A3). החלקים כמו נקניק וכתוצאה מכך (איור 1 א'4) היו מוטבעים, קפוא, באופן רוחבי למחלקה לפרוסות בעובי מיקרומטר 30 ב cryostat. בהיעדרו של ג'לטין מילוי, jejunal סעיפים נוטים קינקיות, המאפשר את villi להתנדנד אחורה (איור 1Bהשמאלי). מילוי ג'לטין שומרת על הדיסק-הצורה העגולה של הסעיפים ושומר על מיקום זקוף villi (איור 1Bנכון). התמונות מצביעות בבירור על ההטבה המוענקת על ידי ג'לטין מילוי בשימור המורפולוגיה של מקטעי מעי צם לתרשים.
הדמיה מוצלחת של תאי המעי אניץ
נוגדנים pY1798 יכול להיות מיושם על טכניקות immunostaining משתנה, כולל נקודה סופג, סופג המערבי, פרפין סעיף מכתים, רכוב הפשרה cryosection מכתים או לתרשים cryosection מכתים1,9. פרוטוקול זה, אנחנו התמקדו cryosections לתרשים על ידי קרינה פלואורסצנטית כתמים TCs בתוך מעי צם העכבר באמצעות נוגדנים pY1798, phalloidin, ודאפי להכתים שמדגימה את המאפיינים המבניים של TCs1. באופן כללי, TCs מפוזרים בקצב של אחד TC/100 תאי אפיתל כנגד מהקצה סיסי קריפטה1. נציג התוצאות מציגות שאת pY1798 reproducibly מתארת TCs כולו, כולל הממברנה, הציטופלסמה של סומא בצורת סליל, הטיפ lumenal חריפה מוכתם, איפה אותות חזקים עיבוי מקביל בולטות 'אניץ' TC1 (איור 2A-2B). בינתיים, phalloidin phallotoxin, משפחה של heptapeptides bicyclic ארסי של פטריית אמנית, ויש לו זיקה גבוהה עבור אקטין filamentous (F-אקטין), אשר נמצא microvilli המהווים את הגבול מברשת מעיים 11. Phalloidin reproducibly, בהבלטה מציינת את הגבול מברשת מעובה המתאים מסה של rootlets המשתרעת אניץ1. לפיכך, לוקליזציה שיתוף עקבי של אותות pY1798 (בצורת סליל סומה, אות התעבות בקצה lumenal) עם הגבול מברשת phalloidin-חיובית באופן בולט מעובה מדגים כי פרוטוקול זה מזהה בהצלחה TCs ללא קשר אם הם ממוקמים על סיסיאיור 2A) (או באולם תת קרקעי, (להבין 2B).
אחזור בטמפרטורה נמוכה אנטיגן יעיל עבור צביעת חלקים לתרשים
אנטיגן מבוססת חום אחזור ב 95-99 ° C משמש לצורך ניתוח פרפין סעיפים ו cryosections רכוב שקופיות. עם זאת, יישום גישה זו לסעיפים לתרשים ללא גרימת נזק קשה בגלל קטעים כאלה הם בדרך כלל יותר שברירי מ סעיפים רכוב שקופית הנתמכים על-ידי שקופית12. מאז אחזור אנטיגן בטמפרטורה נמוכה (50 ° C עבור 3 שעות) שימוש באמבט מים לא השפיע על המורפולוגיה של הסעיפים מעי צם לתרשים בניסויים ראשוניים, הערכנו את האפקטיביות אובייקטיבית של אנטיגן אחזור ב עיוור לבדוק, אשר מבחינה סטטיסטית אישר את האפקטיביות של אנטיגן בטמפרטורה נמוכה אחזור (איור 3).
איור 1: מילוי ג'לטין סעיפים מעי צם לשימור מורפולוגיים cryosections
(א) צילומים של נהלים מילוי intraluminal מעי צם עכבר עם ג'לטין. (A1) קצה משופע המחט ישר אל תדאגי הוסר כדי להימנע פירסינג קיר הבטן. (A2) פתרון במאגר פורמלין נייטרלי (10%) הוזרק ב קצה אחד של מעי צם החתוכים לרוקן את תוכן המעי, ולתקן את פני השטח של לומן מעיים. (A3) מעי צם החתוכים מלא ג'לטין נוזלי בשני הקצוות מאתרים באמצעות של תפר ניילון 6-0 (חיצים שחורים). (A4) ארבעה יותר תפר קשרים (החצים הלבנים) בין על קשרים קיימים תפר (חיצים שחורים) הניב שלושה קטעים קצרים יותר. הרקמה ואז יופרד לתוך שלוש חתיכות כמו נקניק שתי עמדות המצוין (חץ לבן). (B) ההשפעות המיטיבות של ג'לטין-מילוי על מורפולוגיה cryosection לתרשים. ללא מילוי ג'לטין, סעיפים נוטים מעוקם ומאפשר את villi להתנדנד בקלות לאחור (שמאל); עם מילוי ג'לטין, מקטע מיקרומטר בעובי 30 שומרת על צורת הדיסק והוא במצב אנכי של villi משומר (מימין). התמונות צולמו באמצעות ניגוד הפרעות דיפרנציאלי Nomarski. גודל ברים, 1 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: זריחה נציג תמונות של העכבר מעיים אניץ תאים
קרינה פלואורסצנטית קונאפוקלית תמונות של TCs של סיסי (א) או בקריפטה (B), בסעיפים מעי צם העכבר לתרשים מוכתם בייעודי לאתר, זרחון-מצב-ספציפי נוגדנים נגד girdin phosphorylated-טירוזין 1798 ( pY1798, ירוק, עירור אופטימלית/פליטה אורכי גל 490/525 nm), phalloidin (אדום, 590/617 nm), 4, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי, כחול, 358/461 ננומטר). האזור מוקף תיבות לבנות של תמונות הגדלה נמוכה (סולם ברים, 50 מיקרומטר) מורחב בצד הימין (סולם ברים, 10 מיקרומטר). נוגדנים pY1798 כתם reproducibly TCs, ללא תלות במיקום (על סיסי (), או קריפטה (B)), עם כתמים נוכח lumenal עצה (חיצים), קרום, הציטופלסמה של סומא TC בצורת סליל. גבול מברשת בצורה בולטת מעובה ב phalloidin מכתים (חץ) היא סימן ייחודי נוסף של TCs. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: אחזור אנטיגן בטמפרטורה נמוכה מגבירה את pY1798 immunofluorescence
שתי קבוצות של נהלים ניסיוני הושוו כדי לאשר את האפקטיביות של אחזור אנטיגן בטמפרטורה נמוכה. מעי צם לתרשים מקטעים (30 מיקרומטר עבה, n = 13) של בלוק קפוא יחיד חולקו לשתי קבוצות, ו סעיפים מכל קבוצה היו מוכתמים בעקבות פרוטוקול מלא או זהה פרוטוקול בטמפרטורה נמוכה אנטיגן חסר אחזור (שלב 4.2.2). לאחר צביעת, סעיפים רכוב על שקופיות בודדות עם קבוצת מספרים ולאחר labelling בכל שקופית היה מכוסה המסיכה קלטת. כל השקופיות היו גרר, בלוחיות הסבר מספרים חדשים בקלטת, שנצפו תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות דרך מסנן FITC. סה כ סעיפי TCs pY1798-חיוביים גלויים היו בממוצע בכל קבוצה, הוצגו בגרף עמודות (זאת אומרת ± סטיית תקן). מבחן t-זנבית בוצעה כדי להשוות את ספירת ממוצע בין שתי הקבוצות. P-הערכים מתחת 0.05 נחשבו משמעותיים מבחינה סטטיסטית. אחזור בטמפרטורה נמוכה אנטיגן לשפר באופן משמעותי את היעילות של pY1798-immunofluorescence. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
פרוטוקול זה תוכנן כדי לאפשר לחוקרים ללא היסטולוגיה ניסיון להשיג תמונות אמין אניץ תאים (TCs). פרוטוקול זה יש שלוש נקודות קריטיות: 1) השימוש של האתר, זרחון מצב ספציפי ארנב polyclonal נוגדנים נגד האדם girdin phosphorylated-טירוזין 1798 (נוגדנים pY1798) שהושג (חברה ספציפית מעבדות Immuno-Biological = חברה X); 2) מילוי ג'לטין מעי צם; ו 3) לאחזור אנטיגן בטמפרטורה נמוכה. במובן הרחב ביותר, זרחון מצב ספציפי נוגדנים יכולים להיות מסווגים כ נוגדנים ספציפיים שינוי מזהה סוג ספציפי של שינוי post-translational (למשל acetylation, מתילציה או זרחון) של חלבון-משקע חומצת אמינו ספציפית. אומורי. et al. חברה X הפיק במשותף נוגדנים pY1798 על ידי immunizing ארנבים עם פפטיד phosphorylated, ולטהר את הנוגדנים המתקבל באמצעות כרומטוגרפיה מוצק-פאזי פפטיד unphosphorylated בעקבות גוטו שיטה9, 10. נוגדנים pY1798 היו תוקף באופן אינטנסיבי עם במבחנה זרחון מבחני באמצעות וקטורים באורך מלא הביטוי האנושי girdin עם/בלי מוטציה בטירוזין 17989. לאחר מכן, Kuga. et al. נמצא כי נוגדנים pY1798 של חברה X הם סימן ספציפי ורגיש TCs מעיים1. לכן, הכללה של נוגדנים pY1798 של חברה X הוא נקודה קריטית של פרוטוקול זה.
ג'לטין מכיל קולגן שחולצו מן הרקמות החיות, יש זמן רב השתמשו כדי להטביע את דגימות רקמה ללימודי פתולוגיה תוך שימוש cryosections13. נקודת ההיתוך הנמוכה ג'לטין, אשר הוא gelatinized ב 4 ° C אבל נמס בטמפרטורת החדר, החלו להיות מיושם כדי למנוע תופעות לוואי של חום על מנת לתחזק את הג'לטין במצב נוזלי במהלך הטבעה14. פרוטוקול זה, נקודת ההיתוך הנמוכה ג'לטין העשוי אבקת ג'לטין gelatinizes ב 4 ° C, נמס ב RT שימשה כדי לשמר את המורפולוגיה של cryosections רוחבי של העכבר מעי צם. כאשר ג'לטין זה שימש למלא לגמרי מעי צם, הדגימות היו אז פורמלין-קבוע להשגת gelatinization בלתי הפיך. חום-induced אנטיגן לאחזור היא שיטה יעילה כדי לחשוף אנטיגנים והעצמים עם המסיכה-כתות ומייצבים אלדהיד המכיל12. עם זאת, בטמפרטורות גבוהות (95-99 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות) הנפוץ עבור ניתוח סעיפים פרפין עלולה לגרום נזק המורפולוגיה של הרקמות/הג'לטין מורכבים. כאן השתמשנו אחזור אנטיגן בטמפרטורה נמוכה (50 ° C עבור 3 h) המאפשרת אחזור אנטיגן והן שימור רקמות מורפולוגיה.
נוגדנים pY1798 יכול תווית TCs לא רק העכבר מעי צם, אלא גם באיברים רבים (קיבה, מעי, המעי הגס ו כיס המרה) בעכברים ובבני אדם1. עם זאת, כי pY1798 אותות ברקמות מבולבל מרקמות כל תגרע במהירות, פרוטוקול זה כולל הזרקת פורמלין לתוך לומן מעי צם (שלב 2.1.15., 1A איור2).
קיימות מגבלות המשויך העובי של cryosections לתרשים. למרות cryosections דק יכול להיות יתרון מבחינת המוגבהת עבור מיקרוסקופ, עוביו הדק הופך מקטעים אלה פגיעה פיזית. לעומת זאת, cryosections עבה חסון פיזית, אבל יש חדירות נוגדנים נמוך לתוך המקטע. ב פרוטוקול זה, שימשו 30 מיקרומטר בעובי קטעים שהיו גם יציבה מבחינה פיזית וגם חדיר כדי נוגדנים. אמנם שיטה זו תוכננה עבור חוקרים ללא ניסיון רב בתחום היסטולוגיה, אם הפרוטוקול לא, צביעת טריפל pY1798/villin/דאפי, פרפין סעיפים דומה לזה המשמש Kuga. et al. ייתכן שבוצעו1. פרפין מקטעים לא שימשו כאן כדי למנוע קשיים הקשורים phalloidin מכתים של F-אקטין בסעיפים פרפין.
עקב השימור של רצפים של חומצות אמיניות סמוך girdin טירוזין-1798, ניתן להחיל נוגדנים pY1798 כתם TCs בעוד מינים אחרים עכבר, חולדה כולל האדם. ניתן להחיל מילוי ג'לטין בשימוש פרוטוקול זה גם עבור איברים חלולים אחרים. אכן, מלבד pY1798 או TC, השילוב של ג'לטין מילוי עם טמפרטורה נמוכה אנטיגן אחזור עשויה להיות שימושית עבור חשיפת לשמצה epitopes "קשה" בבטן העכבר, כתוצאה מכך, יכול להיות מעניין עבור חוקרים רבים.
את התפקיד הביולוגי של girdin ועל חשיבות שלה זרחון במצב TCs לא ברור. עם זאת, מחקר על ידי לין. et al. הציע את טירוזין זירחון של girdin קשורה עם מידת פלמור אקטין F8. בינתיים, Kuga. et al. מצאתי כזה קטלני מינונים של אפופטוזיס inducers (למשל., ציספלטין, קרינת רנטגן) גרמו לעלייה גדולה בשכיחות היחסית של TCs במעי הדק העכבר זה הם שיערו עשויה להיות קשורה ההמרה אפשרי מ- enterocytes ל- TCs, בסנכרון עם זירחון של girdin microvilli1. האפשרות הזו תדרוש חקירה נוספים בעתיד. שלוש קבוצות לאחרונה נצפו מהירה להגדיל תדירות TC לאחר טפיל זיהום15,16,17. לפיכך, צביעת לתרשים הזה יכול לשמש לא רק לנתח רקמות שנאספו endoscopically הבטן האנושית, אך TC הצטברות יכול גם לסייע באבחון של טפיל זיהום בבטן האנושית.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים Naoya Asai ב אוניברסיטת נאגויה למתן הצעות שימושיות עבור הפיתוח של אנטיגן בטמפרטורה נמוכה לאחזור עבור מקטעים מעי צם לתרשים. עבודה זו נתמכה על-ידי Grants-in-Aid עבור Scientific Research (KAKENHI) (C) בשנת 2012 (JP25460493) ו- (ב) ב-2017 (JP17H04065) מן האגודה יפן עבור הקידום של המדע (JSPS), A-צעד מעניקה בשנת 2014 (AS251Z02522Q) ובשנת 2015 (AS262Z00715Q) מ יפן מדע טכנולוגיה סוכנות (JST), ואת חזון טקדה מחקר 2014 המענק של קרן המדע טקדה (לתואר שני).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slc:DDY 6-week-old female mice | Chubu Kagaku Shizai | Not applicable | |
| Disodium hydrogenphosphate 12-water (Na2HPO412H2O) | Wako | 196-02835 | |
| Sodium dihydroenphosphate Dihydrate (NaH2PO42H2O | Wako | 199-02825 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Wako | 199-10665 | |
| Triton X-100, Polyoxyethylene(10) octylphenyl ether | Katayama Chemical | Not applicable | |
| Sucrose | Wako | 190-00013 | |
| 10% buffered neutral formalin solution | Muto Chemical | 20215 | Step 1.3. |
| Phalloidin-fluorescent dye conjugate, Alexa Fluor 594 phalloidin | ThermoFisher Scientific | A12381 | |
| Methanol | Nacalai Tesque | 21915-35 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| N.N-dimethylformamide (DMF) | Nacalai Tesque | 13015-75 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9647-10G | |
| 18-gauge stainless steel straight needle | Terumo | NN-1838R | |
| U.S.P. 6-0, 60 cm nylon cut suture, Crownjun | Kono Seisakusho | Not applicable | |
| 22-gauge winged needle | Terumo | SV-22DLK | |
| 20 mL TERUMO syringe | Terumo | SS-20ES | |
| 50 mL centrifuge tube | TPP | 91050 | |
| 15 mL Iwaki centrifuge tubes | Iwaki | 2325-015 | |
| 1.5 mL micro test tube | Star | RSV-MTT1.5 | |
| Gelatin powder, Gelare-blanc | Nitta Biolab | 2809 | |
| Embedding compound for frozen tissue specimen, O.C.T. Compound 118 mL 12 piece | Sakura FineTech | 4583 | |
| Cryomold, CRYO DISH No. 3, 125 piece, well size 20 x 25 x 5 (mm) | Shoei Work's | 1101-3 | |
| Isopentane | Nacalai Tesque | 26404-75 | |
| Falcon cell culture dish 35 x 10mm Easy-Grip | Corning | 353001 | |
| Antigen retrieval solution concentrate, Target Retrieval Solution pH 9 10x | Dako | S2367 | Antigen retrieval solution concentrate in step 4.2.2. |
| Protein Block | Dako | X0909 | Blocking solution in 4.2.5. |
| Phospho-Y1798 girdin (pY1798) antibodies | Immuno-Biological Laboratories (IBL) = Company X | 28143 | Phospho-Y1798 girdin antibodies in step 4.2.6. |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A11034 | |
| Aquous mounting media, Prolong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36930 | |
| Coverslips, Matsunami Micro Cover Glass 22 x 22 mm 100 pcs Thickness No.1 | Matsunami Glass | C022221 | |
| Entellan New, xylene-based mounting media for microscopy | Merck Millipore | 107961 | |
| MAS-coated slide glass white | Matsunami Glass | MI-MAS-01 | |
| Wooden Mappe KO-type | Shoei Work's | 99-40007 | |
| Immersion Oil 518 F Fluorescence Free 20 ml | Zeiss | 444960 | |
| Pipettes, Pipetman P (P2, P20, P200, P1000) | Gilson | F144801, F123600, F123601, F123602 | |
| Ultrapure water production system | Advantec | GS-590 | |
| Plastic glove, Star Nitrile Glove | Star | RSU-NGVM | |
| Cryostat | Leica Microsystems | CM1950 | |
| Deep freezer, SANYO Ultra Low | Sanyo | MDF-382 | |
| Showcase refrigerator | Nihon Freezer | NC-ME50EC | |
| Water bath, Thermominder SDminiN (to dissolve gelatin at 50 C) | Taitec | 0068750-000 | |
| Hybridization incubator (for antigen retrieval at 50 C) | Taitec | HB-100 | |
| Incubation chamber for immunostaining | Cosmo Bio | 10DO | |
| Reciprocal shaker for immunohistochemistry (for room temperature) | Taitec | NR-1 | |
| Reciprocal shaker for immunohistochemistry (for 4 C) | Tokyo Rika Kikai | MMS-3010 | |
| Stereoscopic microscope (for tissue handling) | Olympus | SZ61 | |
| Stereoscopic microscope (for Figure 1B) | Leica Microsystems | M165FC | |
| Fluorescence microscope (for Figure 3) | Nikon | E800 | |
| Confocal laser-scanning microscope | Zeiss | LSM700 |
References
- Kuga, D., et al. Tyrosine phosphorylation of an actin-binding protein Girdin specifically marks tuft cells in human and mouse gut. J Histochem Cytochem. 65 (6), 347-366 (2017).
- Jarvi, O., Keyrilainen, O. On the cellular structures of the epithelial invasions in the glandular stomach of mice caused by intramural application of 20-methylcholantren. Acta Pathol Microbiol Scand Suppl. 39 (Suppl 111), 72-73 (1956).
- Enomoto, A., et al. Akt/PKB regulates actin organization and cell motility via Girdin/APE. Dev Cell. 9 (3), 389-402 (2005).
- Asai, M., et al. Similar phenotypes of Girdin germ-line and conditional knockout mice indicate a crucial role for Girdin in the nestin lineage. Biochem Biophys Res Commun. 426 (4), 533-538 (2012).
- Kitamura, T., et al. Regulation of VEGF-mediated angiogenesis by the Akt/PKB substrate Girdin. Nat Cell Biol. 10 (3), 329-337 (2008).
- Wang, Y., et al. Girdin is an intrinsic regulator of neuroblast chain migration in the rostral migratory stream of the postnatal brain. J Neurosci. 31 (22), 8109-8122 (2011).
- Nahorski, M. S., et al. CCDC88A mutations cause PEHO-like syndrome in humans and mouse. Brain. 139 (Pt 4), 1036-1044 (2016).
- Lin, C., et al. Tyrosine Phosphorylation of the G alpha-Interacting Protein GIV Promotes Activation of Phosphoinositide 3-Kinase During Cell Migration. Science signaling. 4 (192), ra64 (2011).
- Omori, K., et al. Girdin is phosphorylated on tyrosine 1798 when associated with structures required for migration. Biochem Biophys Res Commun. 458 (4), 934-940 (2015).
- Goto, H., Inagaki, M. Production of a site- and phosphorylation state-specific antibody. Nat Protoc. 2 (10), 2574-2581 (2007).
- Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4498-4502 (1979).
- Jiao, Y., et al. A simple and sensitive antigen retrieval method for free-floating and slide-mounted tissue sections. J Neurosci Methods. 93 (2), 149-162 (1999).
- Feltkamp-Vroom, T. M., Boode, J. H. An embedding and sectioning technique for immunohistochemical studies of minute specimens of tissue. J Clin Pathol. 23 (2), 188-189 (1970).
- Ushida, K. Pre-embedding technique with low melting temperature gelatin for preparation of histological sections. Proceeding of the Annual Meeting on Technologies in Biological Research. 36, 66-69 (2014).
- Howitt, M. R., et al. Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut. Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).
- von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit. Nature. 529 (7585), 221-225 (2016).
- Gerbe, F., et al. Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites. Nature. 529 (7585), 226-230 (2016).
