Summary
ركائز مع تصلب في نطاق كيلوباسكال مفيدة لدراسة استجابة الخلايا لفسيولوجيا ذات الصلة الصغرى والبيئة صلابة. استخدام مجهر الأسفار ويديفيلد فقط، يمكن تحديد معامل للشباب من الهلام لينة سيليكون استخدام المسافة بادئة مع مجال مناسبة.
Abstract
الأنسجة الرخوة في جسم الإنسان وعادة ما يكون تصلب في نطاق كيلوباسكال (كيلو باسكال). بناء على ذلك، ثبت ركائز مرنة السيليكون والمائية لتكون ركائز مفيدة لاستزراع الخلايا في المكروية المادي الذي يحاكي جزئيا في فيفو الظروف. وهنا، يقدم بروتوكول بسيط لتميز بواقي للشباب من ركائز مطاطا خطي الخواص المستخدمة عادة للدراسات ميتشانوبيولوجي. يتكون البروتوكول من إعداد الركازة سيليكون ناعمة على طبق بيتري أو سيليكون قاسية، طلاء السطح العلوي للركيزة سيليكون مع الخرز الفلورسنت، واستخدام مجال ملليمتر-مقياس للمسافة البادئة السطح العلوي (بخطورة)، التصوير في فلوري الخرز على سطح السيليكون مسافة بادئة باستخدام مجهر الأسفار، وتحليل الصور الناتجة لحساب معامل للشباب من الركازة سيليكون. اقتران السطح العلوي للركيزة مع بروتين خارج الخلية مصفوفة بواقي (بالإضافة إلى الخرز الفلورسنت) يسمح الركيزة السيليكون يتم استخدامها بسهولة لطلاء الخلية والدراسات اللاحقة باستخدام تجارب الفحص المجهري قوة الجر. استخدام سيليكون قاسية، بدلاً من طبق بيتري، كالقاعدة السيليكون لينة، يمكن استخدام الدراسات ميتشانوبيولوجي التي تنطوي على امتداد خارجي. ميزة محددة من هذا البروتوكول هو مجهر الأسفار ويديفيلد، التي تتوفر عادة في العديد من المختبرات، المعدات الرئيسية اللازمة لتنفيذ هذا الإجراء. نظهر هذا البروتوكول عن طريق قياس معامل للشباب من ركائز السيليكون لينة من بواقي مطاطا مختلفة.
Introduction
الخلايا في الأنسجة الرخوة الموجودة في بيئة الجزئي الذي تصلب في كيلوباسكال مجموعة1، على النقيض من أطباق زراعة الأنسجة التي تصلب عدة أوامر من حجم أكبر. وأظهرت تجارب مبكرة مع الخلايا في المصفوفة خارج الخلية ركائز الناعمة المغلفة بالبروتين أن تصلب الركازة التأثيرات كيف الخلايا الانتقال، فضلا عن التمسك بالمصفوفة خارج الخلية تحت2،3. في الواقع، يؤثر تصلب الركازة أساسا وظيفة الخلية4 بطريقة مماثلة للإشارات البيوكيميائية انتشارا. المواد الهلامية polyacrylamide (مغلفة بالبروتينات المصفوفة خارج الخلية) (تتخلل المياه) الهلاميات المائية التي استخدمت على نطاق واسع كخلية ركائز الثقافة للدراسات ميتشانوبيولوجي5. بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS)، سيليكون الأكثر شيوعاً (polysiloxane)، قد استخدمت على نطاق واسع سيليكون قاسية مع تصلب ميجا باسكال-مجموعة ل تصنيع ميكرون-مقياس6. أكثر مؤخرا, لينة سيليكون ركائز مع تصلب في النطاق ذات الصلة أكثر فسيولوجيا كيلوباسكال وقد استخدمت كركائز ثقافة الخلية للدراسات ميتشانوبيولوجي7،8.
وقد استخدمت عدة أساليب لقياس صلابة ركائز مرنة، بما في ذلك مجهر القوة الذرية، تشوه العيانية عينات كاملة عليها، ريولوجيا، وتمتد المسافة البادئة باستخدام المجالات وكرويا مقلوب ميكرويندينتورس9 . بينما كل أسلوب له مزاياه وعيوبه، المسافة البادئة مع مجال هي طريقة خاصة بسيطة ولكنها دقيقة إلى حد ما فقط ويتطلب الوصول إلى مجهر الأسفار ويديفيلد. وقد استخدمت المسافة البادئة مع مجال معدني لقياس صلابة من الهلاميات المائية في الأعمال السابقة3،،من910. الأعمال المبكرة التي أثبتت أهمية صلابة الركيزة لحركة الخلية تستخدم هذا الأسلوب لتحديد المائية الركازة صلابة3. في الآونة الأخيرة، استخدمت أيضا لتوصيف أنيقة10مجهرية [كنفوكل].
هنا، نحن نقدم بروتوكول خطوة بخطوة لإعداد الركازة سيليكون لينة، اقتران الخرز الفلورية (بروتين مصفوفة خارج الخلية مثل الكولاجين وأنا) فقط للسطح العلوي، التصوير مجالاً الطعج واستخدام السطح العلوي المرحلة و الأسفار التصوير، على التوالي، وأخيراً تحليل الصور لحساب معامل للشباب من الركازة سيليكون. يمكن أن تكون الركيزة السيليكون لينة أعد بهذه الطريقة استخدامها بسهولة لتجارب الفحص المجهري قوة الجر. كما يتيح استخدام سيليكون قاسية (بدلاً من طبق بيتري) كالقاعدة السيليكون لينة الدراسات ميتشانوبيولوجي باستخدام امتداد خارجي. متى استلزم الأمر ذلك، يتم أيضا الإشارة إلى الاعتبارات العملية اللازمة لتجنب المضاعفات المحتملة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-تلفيق الركازة السيليكون لينة
- وزن أصل 1.75 ز المكون A و g 1.75 العنصر ب (A:B = 1:1) من السيليكون لينة الاستومر kit (البوليسترين) باستخدام وزنها الصواني.
- إضافة المكون A إلى المكون ب في علبة وزنها ومزجها معا لمدة 5 دقائق عصا قضيب مناسبة باستخدام.
- إضافة الخليط أعلاه إلى 35 مم طبق بيتري. السماح الخليط أن تنتشر بالتساوي عبر صحن بيتري لبضع دقائق.
ملاحظة: اختيار قطر طبق بيتري ومقدار السيليكون لينة ستحدد سماكة السيليكون لينة. وهنا سوف يكون السمك حوالي 3.5 مم؛ مزيد من المعلومات حول اختيار سمك الاستومر في جزء المناقشة . - ضع طبق بيتري مع خليط السيليكون، مع الغطاء قبالة، في فراغ غرفة لمدة 15 دقيقة لإزالة أي فقاعات الهواء. وخلال هذا الوقت، قبل تسخين صفيحة إلى 70 درجة مئوية.
- مجرد صفيحة تصل إلى 70 درجة مئوية، ضع شريحة زجاجية عليها ثم قم بوضع طبق بيتري مع خليط السيليكون على الشريحة الزجاجية. واسمحوا السيليكون علاج عند 70 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. لا تضع الطبق البوليستيرين مباشرة على صفيحة، كما قد تذوب طبق بيتري.
2-اقتران ميكروبيدس الفلورية السيليكون لينة
- ضع السيليكون لينة الشفاء (في طبق بتري كشفت) في غرفة الأشعة فوق البنفسجية عميقة (ضميمة مع مصباح الأشعة فوق البنفسجية عميقة لأطوال موجية الضوء نيوتن متر 185 و 254). تعرض العينة السيليكون لينة (~ 5-10 سم بعيداً عن مصباح الأشعة فوق البنفسجية) للأشعة فوق البنفسجية العميقة الخفيفة لمدة 5 دقائق.
- بينما السيليكون هو التعرض للأشعة فوق البنفسجية العميقة، المضي قدما في الخطوات 2، 2، 2-6 أدناه. بعد التعرض الأشعة فوق البنفسجية العميقة، ديغا قاعة الأشعة فوق البنفسجية العميقة لمدة 5 دقائق على الأقل قبل استرداد العينة.
- وفي الوقت نفسه، تزن بملغ 19 من كاربودييميدي 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) (EDC) في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل وإضافة 500 ميكروليتر من المياه المياه (DI) لذلك. حل الصادرات التي تهز الأنبوب بلطف.
- في أنبوب ميكروسينتريفوجي مل 1.5 منفصلة، تزن بملغ 11 من N-هيدروكسيسولفوسوكسينيميدي (سالفو--دائرة الصحة الوطنية) وإضافة 500 ميكروليتر من المياه دي لأنها وحل سالفو--دائرة الصحة الوطنية التي تهز الأنبوب بلطف. ثم، الجمع بين الحلول سالفو--دائرة الصحة الوطنية وتنمية الصادرات في أنبوب ميكروسينتريفوجي واحد.
- لهذا الحل تنمية الصادرات/سالفو--دائرة الصحة الوطنية، بإضافة 30 ميكروليتر ميكرومترات 0.44 قطرها الأحمر (أو أي لون الفلورية الأخرى استناداً إلى مكعبات التصفية المتوفرة في المجهر الأسفار) كاربوكسيلات تعديل ميكروبيدس نيون (مع تركيز مخزون 1% w/v).
- لتنمية الصادرات/سالفو--دائرة الصحة الوطنية/حبة المخلوط بإضافة 0.02 مغ الكولاجين أنا (من ذيل الفئران، تركز الأسهم 4 مغ/مل في حمض الخليك 0.02 M) للحصول على تركيز حوالي 0.02 ملغ/مل.
- دوامة تنمية الصادرات/المستشفيات/حبة/الكولاجين أنا المخلوط بإيجاز لضمان أن الخرز موزعة بالتساوي في جميع أنحاء، قبل اقتران.
- "الماصة؛" 1 مل تنمية الصادرات/المستشفيات/حبة/الكولاجين أنا الخليط على قطعة من بارافيلم وضعت على رأس آخر غطاء ضحلة، مسطحة (ذات قطر أصغر). عكس طبق بيتري مع سيليكون ناعمة في هذا الخليط حيث أن سطح السيليكون لينة المخلوط بالاتصال ولكن لا تلمس مباشرة على سطح غطاء صحن بيتري أصغر أدناه. رفع طبق بيتري مقلوب، استخدام الشرائح الزجاجية واحد أو اثنين تحت أي من جانبي الفواصل المقلوبة طبق بيتري.
ملاحظة: يرجى الرجوع إلى الشكل 1 لمعرفة كيف يتم تنفيذ الخطوة 2.7. - وتغطي العينة مع رقائق الألومنيوم واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
- إزالة طبق بيتري مع السيليكون لينة ووضعه تستقيم (سيليكون--الجانب الأعلى).
- أغسل سطح السيليكون لينة مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) بإضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 7.4) إلى الطبق. فلنجلس لبضع دقائق. نضح إيقاف برنامج تلفزيوني وتغسل السيليكون مرة أخرى مع 2 مل من برنامج تلفزيوني. واسمحوا علاج سيليكون المزيد لمدة يوم واحد. لهذا السبب، وضع العينة السيليكون لينة في برنامج تلفزيوني في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
3-قياس "صلابة السيليكون" مع "مسافة بادئة المجال" استخدام "مجهر الأسفار ويديفيلد"
- استرداد طبق بيتري مع السيليكون لينة والتأكد من أنه يحتوي على 1 مل على الأقل من برنامج تلفزيوني أن يكون سطح سيليكون مم عدة تحت سطح السائل.
- استخدام الملقط أشار، قطره خمسة ملم 1 الزركونيوم المجال إيندينتورس على السيليكون لينة. تزج المجالات في الوسط السائل وإفلاتها، بعيداً عن حواف طبقة السيليكون وعلى الأقل 5 أقطار indentor بعيداً عن موقع إيندينتورس الأخرى.
ملاحظة: عندما أسقطت فوق سطح السائل، قد تفشل المجالات بسبب التوتر السطحي في الوسط السائل الدخول المتوسطة السائل (عدد عشري). - ضع طبق بيتري مع السيليكون لينة على المسرح المجهر حيث أنه من الممكن للصورة عن طريق طبق بيتري قاعدة.
- استخدام التصوير مرحلة ذات هدف X 10 (مثل جافة 10 X هدف نا 0.30)، قم بتحديد موقع وتجلب indentor مجال في التركيز.
- تأخذ صورة مرحلة جزء أو كلها إيندينتور وحفظ هذه الصورة. استخدام مسح بلاط إذا كانت متوفرة. إذا كان إيندينتور أي عيوب واضحة، تجاهل واستبداله بآخر إيندينتور.
- ظل يعيش مرحلة التصوير، عموم إلى يسار حافة إيندينتور حيث تكون الحافة اليسرى من الإطار على الأقل مسافة ~1.5 آر من مركز إيندينتور. ضمان أن مركز إيندينتور يبقى مرئياً على الجانب الأيمن، قريبة من الحافة اليمنى من إطار الصورة. تأخذ صورة مرحلة وحفظه.
- التبديل مصدر الضوء المجهر على الإضاءة لقناة الأحمر نيون. مع xو y-التركيز دون تغيير الإحداثيات ( x-y موقف وسط indentor داخل لكن قرب الحافة اليمنى من الإطار)، أسفل (النقصان Z) حتى ميكروبيدس نيون أحمر تحت المركز إيندينتور المجال ل مجرد الخروج من التركيز.
- تأخذ z-مكدس مع صورة لكل z-الزيادة 0.5 ميكرون حتى ميكروبيدس في الطبقة العليا من السيليكون أبعد ما تكون عن إيندينتور (بالقرب من الحافة اليسرى للإطار التصوير) الخروج من التركيز.
- كرر الخطوات من 3.4 3.8 مع إيندينتورس أخرى في العينة.
4-حساب صلابة سيليكون (معامل يونغ)
- فتح صورة المرحلة إيندينتور استخدام إيماجيج، انقر فوق الأداة خط، وقياس القطر إيندينتور في بكسل. انقر مع الاستمرار على نقطة على حافة indentor، حرك المؤشر إلى نقطة معاكس تماما على الحافة وملاحظة طول بكسل عرض في شريط الحالة للإطار الرئيسي ImageJ قبل تحرير المؤشر.
- تأكد من تعيين وحدة طول بكسل بواسطة النقر فوق تحليل | ضبط مقياس والتحقق من وحدة الطول.
- تحويل دائرة نصف قطرها إيندينتور بالبكسل ميكرومتر مع مراعاة تكبير موضوعية وحجم بكسل كاميرا CCD (R في ميكرومتر = R في بكسل x حجم بكسل كاميرا CCD في ميكرومتر/التكبير موضوعية).
- فتح قناة الأحمر z-كومة من الصور ميكروبيد (إذا كانت ميكروبيدس الأحمر نيون) في إيماجيج بالنقر فوق الملف | الاستيراد | صورة تسلسل وحدد أي صورة في المكدس، وانقر فوق موافق لفتح المكدس.
ملاحظة: F1 هو رقم الإطار الذي ميكروبيدس تحت مركز إيندينتور في التركيز ممكن أفضل و F2 هو رقم الإطار الذي يتم ميكروبيدس (في منطقة ~1.5 R بعيداً عن مركز حبة) قرب الحافة اليسرى من الإطار في التركيز ممكن أفضل. ض-هو الفرق بين إطارين δ عمق المسافة البادئة.- باستخدام أداة سطر في إيماجيج، رسم خط عبر ميكروبيد واضحة المعالم في الصورة. انقر فوق تحليل | ارسم الشخصية وانقر على زر لايف للحصول على كثافة المسح الضوئي تحديث خط عبر حبة أثناء تحديد أطر مختلفة. ويمكن اختيار الإطار الذي يعطي أعلى قيمة لكثافة قصوى كالإطار في التركيز.
- ولما z-الزيادة بين الإطارات في مكدس z-0.5 ميكرومتر، حساب عمق المسافة البادئة في ميكرومترات ك δ = (F2-F1) × 0.5.
- حساب القوة تمارسها على الهلام indentor بسبب وزنها (ناقص معارضة قوة الطفو)، هذا هو، قوة المسافة البادئة و، كحجم indentor x (كثافة indentor-كثافة متوسطة السائل) x التسارع الجاذبية. استخدام المعادلة F = x (4/3) 3.142 x (ص3) x (ρindentor -ρالمتوسطة) × ز حيث R هو نصف قطر إيندينتور، ρindentor هو كثافة indentor، ρالمتوسطة كثافة متوسطة السائل وهو g التسارع الجاذبية (9.81 م/ث2). التعبير عن جميع الكميات على الجانب الأيسر في وحدات SI للحصول على F (N).
- حساب معامل للشباب (ه) من السيليكون استخدام معدلة11 هيرتز النموذجي12 المعادلة:
حيث:
ج = عامل تصحيح الذي يقوم بتعديل التعبير النموذجي هيرتز الذي يلي ذلك؛
v = نسبة بواسون جل سيليكون (التي اتخذت ك 0.5 أما بالنسبة للمواد7)؛
F = القوة البادئة؛
R = نصف قطر إيندينتور؛ و
Δ = عمق المسافة البادئة.
التعبير عن جميع الكميات على الجانب الأيسر في وحدات SI للحصول على ه في السلطة الفلسطينية.- حساب معامل تصحيح c كما يلي3:
حيث:
; و
.
تجدر الإشارة إلى أن هذا عامل التصحيح على وجه التحديد ليتم استخدامها فقط عند السيليكون لينة تتمسك جيدا إلى طبق بتري (أو سيليكون قاسية) تحته (وهي الحال هنا). - حساب ارتفاع ح طبقة السيليكون لينة استناداً إلى كمية سيليكون أضيف وقطر طبق بيتري. وبدلاً من ذلك، الحصول على ح مباشرة بتحديد اﻻحداثي z للأسطح العلوية والسفلية لطبقة سيليكون بتصوير المرحلة (شوائب طفيفة موضع التركيز في أما السطح). لاحظ أنه بالنسبة ح كبير (ح2 > Rδ)، عامل تصحيح ج قريبة من 1.
- حساب معامل تصحيح c كما يلي3:
- كرر الخطوات من 4، 1-4، 4 لكل إيندينتور. متوسط معامل للشباب التي تم الحصول عليها من كل إيندينتور للحصول على معامل للشباب يعني للعينة سيليكون.
; و
.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
استخدام بروتوكول المفصلة أعلاه، نحن إعداد السيليكون لينة في 35 مم طبق بيتري والشفاء عند 70 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وإلى جانب ميكروبيدس نيون (والكولاجين وأنا) إلى السطح العلوي تخطيطياً كما مبين في الشكل 1. وقد استخدمت الأشعة فوق البنفسجية العميقة سابقا للبروتين في نهاية المطاف اقتران لركائز13. لاحظ أن (ط) شروط المعالجة المستخدمة هنا محددة لهذا السيليكون لينة ويتم تنفيذ (الثاني) بقياس المسافة البادئة في اليوم التالي كما متوقع السيليكون لينة لعلاج قليلاً كذلك على مدى يوم واحد.
تظهر المعلمات المختلفة التي تميز المسافة البادئة كروية سطح السيليكون في الشكل 2أ. تصوير المرحلة يستخدم لالتقاط الصورة بأكملها إيندينتور أما (الأول) كما هو مبين في الشكل 2ب (استخدام خياطة الصورة، إذا لزم الأمر) أو (الثاني) جزء من صورة المجال. هو المعلمة فقط يمكن أن تستمد من الصورة إيندينتور القطر. على سبيل المثال، كان إيندينتورس فردية مختلفة من نفس الدفعة ل indentor استخدمنا مع السيليكون لينة 1:1 في هذا البروتوكول، أقطار تتراوح من 950 ميكرون إلى مكم 1,200 مع متوسط قيمة مكم 1,037 وانحراف معياري 47 ميكرومتر (إيندينتورس 8). علما بأنه ينبغي استخدام القطر يقاس إيندينتور خاص (بدلاً من قطر يعني للعديد من إيندينتورس) لحساب صلابة للمسافة البادئة المستحثة بأن إيندينتور خاصة.
يتم أخذ صور الفلورسنت من ميكروبيدس في السطح العلوي السيليكون في x-y الإطار موقف حيث تكون المنطقة تحت إيندينتور في الجزء اليمين المتطرف من الإطار. يتم اختيار المنطقة في الجزء اليسار المتطرف من الإطار أن تكون المنطقة بعيداً عن إيندينتور كما هو مبين في الشكل 3. Z-رص الصور من المناطق تحت إيندينتور وبعيدا عن indentor مبينة في الشكل 3، وكذلك. ل indentor الزركونيوم قطرها 1 ملم المستخدمة مع السيليكون لينة 1:1، اختلفت z-القيم التي تأتي المناطق 2 إلى التركيز بحوالي 20 ميكرومتر (δ). هذا أصغر بكثير من سمك السيليكون لينة، الذي كان حول مكم 3,500. استخدام كثافة indentor الزركونيوم (الذي فعلا مصنوع من خليط من ثاني أكسيد الزركونيوم، وثاني أكسيد السيليكون) (4.66 غ/سم3) وكثافة السائل المتوسطة (لبرنامج تلفزيوني: 1.01 غرام/سم3)، يمكن أن تحسب القوة الصافية التي تمارس على السيليكون. للحالة قيد النظر، كان في النطاق µN 20-25. وكان معامل للشباب ونحن المحسوبة السيليكون لينة 1:1 7.2 كيلو باسكال ± 2.4 (من 28 موقعا المجمعة من 6 عينات مستقلة). وترد نتائج تمثيلية لنسب A:B أخرى لنفس السيليكون لينة (المحدد في مصاحبة الجدول الكواشف محددة) في الجدول 1. وأخيراً، للتحقق من صحة الأسلوب المسافة البادئة المجال الذي يستخدم مجهر ويديفيلد نحن المبينة في هذا البروتوكول، ونحن أيضا قياس بواقي للشباب من جل polyacrylamide نحن تتسم مع رهيوميتير أن يكون معامل للشباب من 21 كيلو باسكال ± 3. استخدام الأسلوب المسافة البادئة المجال لهذا البروتوكول باستخدام مجهر ويديفيلد، جل polyacrylamide لتكوين نفسه تبين أن معامل يونغ 22.1 كيلو باسكال ± 4.2، مما يشير إلى اتفاق جيد10. وتعالج المحاذير على إيلاء اهتمام لحين القيام بهذه القياسات في جزء المناقشة.
رقم 1: تصوير تخطيطي لإجراء اقتران ميكروبيدس الفلورية إلى السطح العلوي السيليكون لينة. (أ) السيليكون الناعمة التي قد شُفي تتعرض للأشعة فوق البنفسجية العميقة الخفيفة للمخلوط بأدنى 5 (ب) تنمية الصادرات وسالفو--دائرة الصحة الوطنية، والخرز، والكولاجين في المياه هو بيبيتيد إلى أسفل على قطعة من بارافيلم وضعت على رأس غطاء للقطر الأصغر. نموذج (ج) السيليكون لينة هو مقلوب في هذا الخليط حيث أنها على اتصال مع السائل ولكن ليس مع السطح العلوي للغطاء أصغر تحت. شريحتين من الزجاج على جانبي، تحت طبق بيتري، بمثابة الفواصل. (د) بعد غسل العينة مع برنامج تلفزيوني، على سطح السيليكون لينة مغطاة بطبقة ميكروبيدس نيون جاهزة لقياس صلابة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: توضيح التخطيطي للمجال المسافة البادئة من سطح السيليكون لينة. (أ) هذا تصوير تخطيطي يبين indentor كروية على سطح عينة لينة سيليكون. يتم الإشارة إلى المعلمات المختلفة ذات الاهتمام. (ب) هذا الفريق يظهر صورة إيندينتور 1 مم (على عينة سيليكون لينة) التي تم الحصول عليها عن طريق تصوير مرحلة. شريط مقياس يشير إلى 250 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: حبة الحصول على الصور، وتحديد الصورة في التركيز- (أ) هذه الصورة الفلورية ميكروبيدس يظهر على السطح العلوي للعينة السيليكون لينة والمطلوب x-y موقع الإطار الخاص به بالنسبة إلى إيندينتور (الخط المنقط). شريط مقياس يشير إلى 150 ميكرومتر. لوحات ب وج إظهار الصور fluorescence z-كومة من المناطق على سطح السيليكون لينة (ب) تحت إيندينتور و (ج) بعيداً عن إيندينتور (مناطق محاصر في الصورة أعلى). مؤشرات z1 و z2 تتوافق مع قيم ع فيه المنطقة تحت إيندينتور ومنطقة بعيداً عن إيندينتور في التركيز، على التوالي. وتبين أشرطة مقياس 20 ميكرومتر. الصور أحادية اللون التي تظهر هي تلك التي تم الحصول عليها في القناة الحمراء منذ اسمياً استخدمت ميكروبيدس الوردي ملامح الإثارة والانبعاثات التي تناسب القناة الحمراء. (د) يظهر هذا الفريق لكثافة خط مسح عبر حبة صغيرة (تظهر في الصورة اقحم مع خط أصفر عبرها) كما يتنوع التركيز في z-زيادات بمقدار 0.5 ميكرومتر. ويمكن اختيار التركيز (القيمة z) المقابلة للصورة في التركيز موضوعيا استناداً إلى قيمة z المقابلة لخط المسح الضوئي مع حدة الأقصى أعلى. يشير شريط مقياس في اقحم 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| سيليكون الاستومر * A:B | معامل يونغ * * (كيلو باسكال) |
| 1:1 | 7.2±2.4 |
| 4:7 | 37.6±3.9 |
| 1:2 | 64.1±6.9 |
| * المحدد في مصاحبة الجدول من الكواشف/معدات معينة * * الذي يقاس بمجال استخدام الأسلوب المسافة البادئة باستخدام مجهر ويديفيلد كما هو مفصل في هذا البروتوكول |
|
الجدول 1. معامل يونغ من السيليكون لينة (السيليكون الخاصة المحددة في الجدول من محدد الكواشف/المعدات) للتركيبات المختلفة كقياس استخدام البروتوكول بالتفصيل هنا. القيم لنسبة A:B المكونات مختلطة اثنين (وعدد القياسات المقابلة) هي 1:1 (28) و 4:7 (13)، و 1:2 (8).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بينما يكون الأسلوب المسافة البادئة المجال سهلة التنفيذ، يجب إيلاء اهتمام دقيق لاختيار إيندينتور وسمك العينة السيليكون لينة. المعادلة المستخدمة لحساب معامل للشباب يكون صالحاً بمقتضى مجموعة من الشروط11وهذه راضون عادة عندما يكون سمك العينة سيليكون > 10% من قيمة radius indentor و < ~ 13 × نصف قطرها إيندينتور. وجدنا أن سمك سيليكون x 5-10 دائرة نصف قطرها إيندينتور كان اختياراً جيدا، حيث سمك العينة ليست عالية جداً (أيالمسافة العامل الموضوعي لم يصبح القيد) وتصلب المحسوبة ليست حساسة للغاية القيمة الدقيقة لسمك سيليكون. كما ينبغي اختيار indentor كروية أن δ عمق المسافة البادئة هو < 10% من سمك السيليكون، فضلا عن < 10% من دائرة نصف قطرها إيندينتور. في ضوء هذه الاعتبارات، يمكن استخدامها إيندينتورس من مواد مختلفة والقطر لقياس صلابة السيليكون أكثر ليونة وصلابة. تحديد عمق المسافة البادئة هو الخطوة الأكثر أهمية لهذا البروتوكول. الطريقة المقترحة في هذا البروتوكول تحديد الصور في التركيز ينبغي أن تساعد في تحديد عمق المسافة البادئة موثوق بها. كما تجدر الإشارة إلى أن حساب صلابة المستخدمة لأسلوب مسافة بادئة المجال يستخدم نظرية غوغليلمو، الذي يفترض عديم الاحتكاك الاتصال. هنا، وهذا افتراضا جيدة إيندينتورس خشونة منخفضة. في حين أننا استخدمنا الاستومر سيليكون لينة محددة (المدرجة في مصاحبة الجدول الكواشف محددة)، يمكن استخدام مجموعات الاستومر سيليكون التجارية الأخرى. علما بأن سيليكون قاسية تستخدم على نطاق واسع ميكروفابريكيشن ليس خياراً جيدا لصنع ركائز مع تصلب في نطاق الجيش الشعبي الكوري. ومع ذلك، يمكن أن تكون مختلطة السيليكون لينة (التي لديها تيبس في الطرف الأدنى من النطاق كيلوباسكال) مع نسبة مئوية صغيرة من السيليكون شديدة جعل ركائز مع تصلب في الطرف الأعلى من نطاق الجيش الشعبي الكوري. اعتماداً الاستومر، يمكن اختيار إيندينتور مع حجم مختلف أو الكثافة، طالما توافرت الشروط المذكورة سابقا.
بعض الاعتبارات الرئيسية للاقتران من ميكروبيدس نيون إلى السطح العلوي السيليكون لينة مهمان. أولاً وقبل كل شيء، أننا اخترنا 0.44 الخرز كاربوكسيلات مكم لأن مضمونها فلوروفوري، ومن ثم كان سطوع أكبر من حبات مماثل لحجم أصغر. يمكن استخدام أحجام أصغر من حبة إذا الخرز تحتوي على فلوروفوريس أكثر إشراقا، ولكن نقترح أنه ينبغي استخدام الخرز كاربوكسيلات الفرعية ميكرون حتى لا تتعرض لتؤثر سلبا على القرار للأسلوب. ينفذ في الحضانة من على سطح السيليكون مع خليط الصادرات/سالفو--دائرة الصحة الوطنية/حبة/col1 مع سطح السيليكون في تكوين مقلوب. السبب في ذلك أنه، عندما يوضع الخليط مع الخرز فوق سطح السيليكون، تسوية حبة من كتل على سطح السيليكون، مما أدى إلى قرار مكانية فقيرة بينما ميكروبيدس الفلورية التي يجري تصويرها. وحتى مع هذا البروتوكول، لوحظت كتل حبة أحياناً (مناطق مشرقة في الصورة أعلى في الشكل 3). ومع ذلك، فليست واسعة النطاق للتأثير على قرار للأسلوب. من الممكن أيضا استخدام الفواصل تحت حواف أما من أطباق بيتري في الرقم 1 للسماح لسطح السيليكون الاتصال بالسائل ولكن ليس سطح صلب تحته. يمكن إجراء اقتران ميكروبيدس للسطح العلوي السيليكون لينة حتى بدون خطوة ضوء الأشعة فوق البنفسجية عميقة إذا هي اختارت ميكروبيدس مع طلاء مسعور. يتم قياس صلابة في الركيزة النهائية (بعد العلاج الأشعة فوق البنفسجية، واقتران حبة، واقتران ECM) في الخلايا التي يمكن أن تكون مطلي. ينبغي مراعاة أنه ينبغي إجراء توصيف صلابة بعد الخطوات (مثل علاج الأشعة فوق البنفسجية) التي ربما يمكن تغيير صلابة الركيزة حيث يكون تصلب قياس واحد أن الخلايا سوف يتعرض ل.
بدلاً من طبق بيتري، يمكن استخدام لوح PDMS قاسية كالقاعدة ل السيليكون لينة14. يمكن استخدام مثل هذا تكوين لتطبيق امتداد خارجي للخلايا حيث سيليكون قاسية يوفر الإطار الذي يمكن أن تمتد، والسيليكون لينة يوفر بيئة الصغير خلية من صلابة هو أكثر الفسيولوجية. يمكن أيضا إجراء عملية جر قوة مجهرية15،16مع خلايا مطلي على هذه المواد الهلامية الناعمة سيليكون7،8، ووجود ميكروبيدس الفلورية في الطبقة العليا فقط يتيح قرار جيد مع فقط مجهر الأسفار ويديفيلد. الكولاجين في هذا البروتوكول يمكن أن يكون محل البروتينات المصفوفة خارج الخلية الأخرى. مقارنة بأساليب أكثر قليلاً المعنية مثل مجهر القوة الذرية، الأسلوب المسافة البادئة المجال يمكن تنفيذها بسهولة أكبر، بصورة عامة. تحديد الانحراف في الوسط بواقي للشباب التي تم الحصول عليها باستخدام الأسلوب المسافة البادئة المجال مقارنة باستخدام رهيوميتير هو عادة < 10%10. وهكذا، الأسلوب المسافة البادئة للمجال (باستخدام مجهر الأسفار ويديفيلد) توفر طريقة موجوداً لتصلّب التحديد الكمي السيليكون لينة (أو hydrogel) للتطبيقات في ميتشانوبيولوجي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن نشكر مارغريت غارديل للسماح باستخدام رهيوميتير سخاء. نعترف بدعم من المعهد الوطني للصحة (1R15GM116082) الذي مكن هذا العمل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CY 52-276 A/B silicone elastomer kit | Dow Corning | CY 52-276 | Store at room temperature |
| Thermo Scientific Pierce EDC | Fisher Scientific | PI22980 | Store at -20°C |
| Thermo Scientific Pierce Sulfo-NHS crosslinker | Fisher Scientific | PI-24510 | Store at 4°C |
| Carboxyl fluorescent pink particles, 0.4-0.6 µm, 2 mL | Spherotech, Inc. | CFP-0558-2 | Store at 4°C, do not freeze |
| 1.0 mm Acid washed Zirconium beads | OPS Diagnostics LLC | BAWZ 1000-250-33 | |
| Deep UV chamber with ozone evacuator | Novascan Technologies, Inc. | PSD-UV4, OES-1000D | |
| Wide field fluorescence microscope | Leica Microsystems | DMi8 | |
| Collagen I, from rat tail | Corning | 354236 | Stock concentration = 4 mg/ml; store at 4°C |
| ImageJ-NIH | N/A | N/A | public-domain software |
References
- Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression. Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).
- Pelham, R. J., Wang, Y. -L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79, 144-152 (2000).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their Substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).
- Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017 (2014).
- Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
- Lee, E., et al. Deletion of the cytoplasmic domain of N-cadherin reduces, but does not eliminate, traction force-transmission. Biochemical and Biophysical Research Communications. 478 (4), 1640-1646 (2016).
- Frey, M. T., Engler, A., Discher, D. E., Lee, J., Wang, Y. L. Microscopic methods for measuring the elasticity of gel substrates for cell culture: microspheres, microindenters, and atomic force microscopy. Methods Cell Biol. 83, 47-65 (2007).
- Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement. Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).
- Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope. Biophysical Journal. 82 (5), 2798-2810 (2002).
- Hertz, H. Über die Berührung fester elastischer Körper. Journal für die reine und angewandte Mathematik. 92, 156-171 (1882).
- Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M. Protein micropatterns: a direct printing protocol using deep UVs. Microtubules: In Vivo. Cassimeris, L., Tran, P. , Academic Press. Burlington, San Diego. 133-146 (2010).
- Bashirzadeh, Y., Qian, S., Maruthamuthu, V. Non-intrusive measurement of wall shear stress in flow channels. Sensors and Actuators A: Physical. 271, 118-123 (2018).
- Muhamed, I., Chowdhury, F., Maruthamuthu, V. Biophysical tools to study cellular mechanotransduction. Bioengineering (Basel). 4 (1), 12 (2017).
- Dumbali, S. P., Mei, L., Qian, S., Maruthamuthu, V. Endogenous sheet-averaged tension within a large epithelial cell colony. Journal of Biomechanical Engineering. 139 (10), 101008 (2017).
