Summary
Substrate mit Steifheit im Bereich Kilopascal sind nützlich, um die Reaktion der Zellen auf physiologisch relevanten Mikroumgebung Steifigkeit zu studieren. Verwenden nur ein Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskop, kann des Elastizitätsmoduls weichen Silikon-Gel mit einer Einbuchtung mit einer geeigneten Kugel bestimmt werden.
Abstract
Weiche Gewebe im menschlichen Körper haben in der Regel Steifigkeit im Bereich Kilopascal (kPa). Entsprechend, Silikon und Hydrogel flexible Substrate nachweislich nützliche Substrate für die Kultivierung von Zellen in einem physischen Mikroumgebung, die teilweise in Vivo Bedingungen imitiert werden. Hier präsentieren wir Ihnen ein einfaches Protokoll für die Charakterisierung der Youngs Moduli isotrope lineare elastische Substrate, die in der Regel verwendet für Mechanobiology Studien. Das Protokoll besteht aus Vorbereitung eine weiche Silikon-Substrat auf einer Petrischale oder steif Silikon, Beschichtung der Oberfläche des Substrates Silikon mit fluoreszierenden Perlen, mit Hilfe einer Millimeter-Skala-Kugel an die Oberseite (durch die Schwerkraft), imaging die fluoreszierenden Einrücken Perlen auf der eingerückten Silikon-Oberfläche mit dem Fluoreszenzmikroskop, und analysieren die resultierenden Bilder zur Berechnung des Elastizitätsmoduls des Substrats Silikon. Kopplung der Substrat-Oberfläche mit einem Moduli extrazelluläre Matrix Protein (neben der fluoreszierenden Perlen) ermöglicht das Silikon Substrat leicht für Zelle Beschichtung und anschließendem Studium mit Traktion Kraft-Mikroskopie Experimente verwendet werden. Der Einsatz von steifen Silikon, anstelle einer Petrischale als Basis aus weichem Silikon, ermöglicht die Verwendung von Mechanobiology Studien mit externen Strecke. Ein besonderen Vorteil dieses Protokolls ist, dass ein Fluoreszenzmikroskop Weitfeld, die allgemein verfügbar in vielen Labors ist für dieses Verfahren erforderlichen Geräte. Wir zeigen dieses Protokolls durch die Messung des Elastizitätsmoduls von weichem Silikon Substraten von verschiedenen elastischen Moduli.
Introduction
Zellen in den weichen Geweben befinden sich in einem Mikro-Umgebung deren Steifigkeit in Kilopascal Palette1, im Gegensatz zu Gewebekultur Gerichte ist deren Steifigkeit mehrere Größenordnungen höher ist. Frühe Experimente mit Zellen auf extrazelluläre Matrix Protein-beschichtete weichen Untergründen zeigte, dass die Steifigkeit des Substrats beeinflusst, wie Zellen bewegen sowie halten uns an die extrazelluläre Matrix unter2,3. In der Tat beeinflusst die Substrat-Steifigkeit grundlegend die Zelle Funktion4 in gewissem Sinne ähnlich durchdringend biochemische Signale. Polyacrylamid-Gele (beschichtet mit extrazellulärer matrixproteine) sind (Wasser durchdringt) Hydrogele, die ausgiebig genutzt wurden als Kultursubstrate Zelle für Mechanobiology5Studien. Polydimethylsiloxan (PDMS), das am häufigsten verwendete Silikon (Polysiloxan), hat als eine steife Silikon mit Megapascal-Palette Steifigkeit für Mikron-Skala Fertigung6verbreitet. Seit kurzem weichem Silikon, die Substrate mit Steifheit im Bereich mehr physiologisch relevanten Kilopascal als Zelle Kultursubstrate für Mechanobiology Studien7,8angestellt gewesen sein.
Verschiedene Methoden wurden verwendet, um die Steifigkeit der flexible Substrate, einschließlich Rasterkraftmikroskopie, makroskopische Deformation des ganzen Proben auf Dehnung, Rheologie und Einzug mit Kugeln und sphärisch gekippt Microindentors9 Messen . Während jede Technik ihre vor- und Nachteile hat, ist Einzug mit einer Kugel eine besonders einfache, aber ziemlich genaue Methode, die lediglich den Zugang zu einem Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskop. Einzug mit einer metallischen Kugel wurde verwendet, um die Steifigkeit der Hydrogele in früheren Arbeiten3,9,10messen. Frühwerk, das die Wichtigkeit des Substrats Steifigkeit zu Zelle Bewegung gezeigt verwendet diese Methode, um festzustellen, Hydrogel Substrat Steifigkeit3. Vor kurzem hat konfokalen Mikroskopie auch für ein elegantes Charakterisierung10verwendet.
Hier präsentieren wir eine Schritt für Schritt-Protokoll für die Zubereitung von einem weichen Silikon-Substrat, Kupplung fluoreszierende Perlen (und eine extrazelluläre Matrix Proteine wie Kollagen ich) nur auf der Oberseite imaging eine Einrücken Sphäre und der oberen Oberfläche mit phase und Fluoreszenz imaging, beziehungsweise, und schließlich analysiert die Bilder zur Berechnung des Elastizitätsmoduls des Substrats Silikon. Das weiche Silikon-Substrat vorbereitet auf diese Weise kann problemlos für Traktion Kraft-Mikroskopie Experimente verwendet werden. Der Einsatz von steifen Silikon (anstelle einer Petrischale) als Basis für das weiche Silikon ermöglicht auch Mechanobiology Studien mit einem externen Strecke. Gerechtfertigt, sind praktische Erwägungen notwendig zur Vermeidung von möglichen Komplikationen auch angegeben.
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Protocol
1. Herstellung von weichem Silikon Substrat
- Die Komponente A und B-Komponente 1,75 g 1,75 g abwiegen (a = 1:1) aus dem weichen Silikon-Elastomer-Kit (Polystyrol) mit einem Gewicht von Schalen.
- Der B-Komponente in das Fach mit einem Gewicht von der A-Komponente hinzu und mischen sie zusammen für 5 min mit einem geeigneten Applikator-Stick.
- Ein 35 mm Petrischale der obige Mischung hinzufügen. Lassen Sie die Mischung gleichmäßig auf der Petrischale für ein paar Minuten verteilt.
Hinweis: Die Wahl der Petrischale Durchmesser und die Höhe aus weichem Silikon bestimmt die weichen Silikon-Dicke. Hier werden die Dicke ca. 3,5 mm; mehr über die Wahl der Elastomer-Stärke im Abschnitt Diskussion . - Bringen Sie die Petrischale mit der Silikon-Mischung, mit dem Deckel aus, in einer Vakuumkammer für 15 min um Luftblasen zu entfernen. Während dieser Zeit Vorwärmen einer Heizplatte bis 70 ° C.
- Sobald die heiße Platte 70 ° C erreicht, setzen Sie einen Objektträger auf und dann legen Sie die Petrischale mit der Silikon-Mischung auf den Objektträger. Lassen Sie das Silikon Heilung bei 70 ° C für 30 Minuten. Stellen Sie Polystyrol Teller nicht direkt auf der heißen Platte, da die Petrischale schmelzen kann.
(2) Kopplung von fluoreszierenden Microbeads auf dem weichen Silikon
- Legen Sie das ausgehärtete weiche Silikon (in der ungedeckten Petrischale) in einer tiefen UV-Kammer (ein Gehäuse mit einer Tiefe UV-Lampe Lichtwellenlängen von 185 und 254 nm). Die weichen Silikon-Probe (~ 5-10 cm entfernt von der UV-Lampe) tiefen UV-Licht für 5 min aussetzen.
- Während das Silikon tiefen UV-Licht ausgesetzt ist, fahren Sie mit folgenden Schritten 2.2-2.6. Nach der tiefen UV-Exposition Entgasen der tiefen UV-Kammer für mindestens 5 min vor dem Abrufen der Probenmaterials.
- In der Zwischenzeit 19 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) Carbodiimide (EDC) in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch abwiegen und 500 μL deionisiertes Wasser (DI) Wasser hinzufügen. Auflösen der EVG durch das Rohr vorsichtig schütteln.
- Wiegen Sie in einem separaten 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch 11 mg N- Hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS), 500 μL DI Wasser hinzu, und lösen Sie die Sulfo-NHS durch das Rohr vorsichtig schütteln. Dann kombinieren Sie die EDC und Sulfo-NHS Lösungen in einem einzigen Microcentrifuge Schlauch.
- Diese EDC/Sulfo-NHS-Projektmappe fügen Sie 30 μL 0,44 μm Durchmesser rot (oder jede andere Farbe der Fluoreszenz basierend auf die Filter-Cubes zur Verfügung in dem Fluoreszenzmikroskop) carboxylat geändert fluoreszierende Microbeads (mit einer 1 % w/V Lager Konzentration hinzu).
- Die EDC/Sulfo-NHS/Wulst-Mischung hinzufügen 0,02 mg Kollagen I (von einem Rattenschwanz, Lager Konzentration von 4 mg/mL in 0,02 M Essigsäure), eine Konzentration von etwa 0,02 mg/mL zu erhalten.
- Wirbel der EDC/NHS/Perle/Kollagen ich Mischung kurz um sicherzustellen, dass die Perlen gleichmäßig im gesamten Gebäude, vor dem Kuppeln verteilt sind.
- 1 mL EDC/NHS/Perle/Kollagen Pipette ich Mischung auf einem Stück Parafilm eine andere flache, flache Deckel (mit kleinerem Durchmesser) platziert. Drehen Sie die Petrischale mit weichem Silikon auf diese Mischung, so dass die weichen Silikon-Oberfläche die Mischung Kontakte aber die Oberfläche von den kleineren Petrischale Deckel unten nicht direkt berühren. Um die umgekehrte Petrischale zu erhöhen, verwenden Sie ein oder zwei Glas-Objektträger unter beiderseits der invertierten Petrischale Abstandhalter.
Hinweis: Siehe Abbildung 1 zu sehen, wie Schritt 2.7 durchgeführt wird. - Die Probe mit Alufolie abdecken und bei Zimmertemperatur 30 min inkubieren.
- Die Petrischale mit weichem Silikon entfernen und setzen Sie ihn aufrecht (Silikon-Seite nach oben).
- Waschen Sie die weichen Silikon-Oberfläche mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) durch Zugabe von 2 mL PBS (pH 7,4) in die Schale. Lassen Sie es für ein paar Minuten. Aus der PBS Aspirieren und das Silikon wieder mit 2 mL PBS waschen. Lassen Sie die Silikon Heilung weiter für etwa einen Tag. Stellen Sie aus diesem Grund die weichen Silikon-Probe mit PBS-Puffer bei 37 ° C über Nacht.
3. Messung Silikon Steifigkeit mit Kugel Einzug mit einem Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskop
- Rufen Sie die Petrischale mit weichem Silikon und sicherstellen Sie wollen, dass es mindestens 1 mL PBS, die Silikon-Oberfläche mehrere mm unterhalb der Flüssigkeitsoberfläche zu haben.
- Pinzette Spitz, fünf 1 mm Zirkon Kugel Eindringkörper auf dem weichen Silikon fallen. Tauchen Sie die Kugeln in das flüssige Medium ein und legen Sie ab, Weg von den Rändern der Silikonschicht und mindestens 5 Eindringkörper Durchmessern vom Standort der anderen Eindringkörper entfernt.
Hinweis: Wenn über der Flüssigkeitsoberfläche gelöscht, können die Kugeln nicht das flüssige Medium (Float) geben aufgrund der Oberflächenspannung des flüssigen Mediums. - Legen Sie die Petrischale mit weichem Silikon auf Mikroskoptisch, so dass es möglich, Bild durch die Petrischale Basis ist.
- Mit Phase-Bildgebung mit einem 10 X-Objektiv (wie z. B. eine trockene 10 X Objektive von NA 0,30), zu lokalisieren und eine Kugel Eindringkörper in den Fokus zu bringen.
- Nehmen Sie eine Phase Bild eines Teils oder der gesamten der Eindringkörper und speichern Sie dieses Bild. Verwenden Sie einen Kachel-Scan, falls vorhanden. Wenn der Eindringkörper sichtbare Mängel hat, entsorgen Sie und ersetzen Sie es mit einem anderen Eindringkörper.
- Schwenken Sie unter live Phase Bildgebung nach links von der Eindringkörper Rand damit der linke Rand des Rahmens mindestens ein Abstand von ~1.5 R aus dem Eindringkörper Center ist. Stellen Sie sicher, dass das Zentrum der Eindringkörper auf der rechten Seite, nahe an den rechten Rand des Bildrahmens sichtbar bleibt. Eine Phase Bild nehmen und es zu speichern.
- Wechseln Sie die Mikroskop-Lichtquelle bis hin zur Beleuchtung für den roten fluoreszierenden Kanal. Mit der X- und y-Koordinaten unverändert (die X-y -Position des Zentrums Eindringkörper innerhalb aber nahe am rechten Rand des Rahmens), Schwerpunkt nach unten (Abnahme Z) bis rot fluoreszierende Microbeads unter der Kugel Eindringkörper Center gehen Sie einfach unscharf.
- Nehmen Sie einen Z-Stapel mit einem Bild für jeden Z-Inkrement von 0,5 µm bis Microbeads in die oberste Schicht des Silikons weit von der Eindringkörper (nahe dem linken Rand des bildgebenden Rahmens) unscharf gehen.
- Wiederholen Sie die Schritte 3,4-3,8 mit den anderen Eindringkörper auf die Probe.
4. Berechnung des Silikons Steifigkeit (Elastizitätsmodul)
- Öffnen Sie das Bild der Phase von der Eindringkörper mit ImageJ, klicken Sie auf das Linienwerkzeug und gemessen Sie der Eindringkörper Durchmesser in Pixeln. Klicken und halten Sie einen Punkt am Rande Eindringkörper bewegen Sie den Cursor auf einen diametral gegenüberliegenden Punkt am Rand und beachten Sie die Länge in Pixeln auf der Statusleiste des Hauptfensters ImageJ vor der Freigabe des Cursors angezeigt.
- Sicherzustellen, dass die Längeneinheit Pixel gesetzt, indem Sie auf analysieren | Maßstab festlegen und Überprüfung der Längeneinheit.
- Der Eindringkörper Radius in Pixeln in μm unter Berücksichtigung der objektiven Vergrößerung und der CCD-Kamera-Pixel-Größe konvertieren (R in μm = R in Pixel x die CCD-Kamera-Pixelgröße in μm / Objektive Vergrößerung).
- Den Rot-Kanal Z-Stack von Microbead Bildern (wenn die Microbeads rot fluoreszierende sind) in ImageJ durch Anklicken Datei zu öffnen | Import | Bild-Sequenz und wählen Sie jedes Bild im Stapel und klicken Sie auf "OK" , um den Stapel zu öffnen.
Hinweis: F1 ist die Frame-Nummer auf der Microbeads unter dem Eindringkörper Center befinden sich in der besten möglichen Fokus und F2 die Frame-Nummer, bei der die Microbeads (an einem Bereich der ~1.5 R die Perle entfernt) am linken Rand des Rahmens in der besten möglichen Fokus sind. Die Z-Unterschied zwischen den beiden Rahmen ist die Einrückung Tiefe δ.- Mit dem Linienwerkzeug in ImageJ, zeichnen Sie eine Linie über eine klar definierte Microbead im Bild. Klicken Sie auf analysieren | Plot-Profil und klicken Sie auf die Live -Taste, um die aktualisierte Zeile Scan Intensität über den Wulst zu erhalten, bei der Auswahl von unterschiedlichen Frames. Das Bild, das den höchsten Wert für die maximale Intensität gibt kann als Frame im Fokus gewählt werden.
- Da die Z-Inkrement zwischen den Frames in der Z-Stack 0,5 μm ist, berechnen die Eindringtiefe in μm als δ = (F2-F1) x 0,5.
- Auf das Gel von der Eindringkörper aufgrund seines Gewichts (abzüglich der gegnerischen Auftriebskraft), d. h. ausgeübte Kraft zu berechnen, die Einrückung Kraft F, als das Volumen der Eindringkörper x (die Dichte der Eindringkörper - die Dichte des flüssigen Mediums) x die Erdbeschleunigung. Verwenden Sie die Gleichung F = (4/3) X 3.142 x (R3) x (ρEindringkörper - ρMedium) x g wo R der Radius der Eindringkörper ist ρEindringkörper ist die Dichte der Eindringkörper, ρMedium ist die Dichte des flüssigen Mediums und g ist die Erdbeschleunigung (9,81 m/s2). Drücken Sie alle Mengen, die auf der rechten Seite in SI-Einheiten, F (N) zu erhalten.
- Berechnen Sie Elastizitätsmodul (E) des Silikons mit einer veränderten11 Hertz Modell12 Gleichung:
Wo:
c = einen Korrekturfaktor, der den Hertz-Modell Ausdruck ändert, die folgt;
V = Poisson Verhältnis von Silikon-Gel (genommen als 0,5 wie bei inkompressiblen Materialien7);
F = die Einrückung Kraft;
R = den Eindringkörper Radius; und
Δ = die Eindringtiefe.
Ausdruck aller Größen auf der rechten Seite in SI-Einheiten zu E in PA.- Berechnen Sie die Korrektur Faktor c 3folgendermaßen:
Wo:
; und
.
Es sei darauf hingewiesen, dass dieser Korrekturfaktor speziell verwendet werden, nur dann, wenn das weiche Silikon gut an die Petrischale (oder steif Silikon) darunter hält (was hier der Fall ist). - Berechnen Sie die Höhe h der die weiche Silikonschicht anhand der Menge an Silikon hinzugefügt und die Petrischale Durchmesser. Alternativ erhalten h direkt durch die Bestimmung der Z-Koordinate der oberen und unteren Flächen der Silikon-Schicht durch Phase-Bildgebung (geringfügige Verunreinigungen kommen in den Fokus an beiden Oberfläche). Beachten Sie, dass für eine große h (h2 > Rδ), die Korrektur Faktor c liegt in der Nähe 1.
- Berechnen Sie die Korrektur Faktor c 3folgendermaßen:
- Wiederholen Sie die Schritte 4.1-4.4 für jedes Eindringkörper. Durchschnitt des Elastizitätsmoduls gewonnen aus jeder Eindringkörper, die mittlere Elastizitätsmodul für die Silikon-Probe zu erhalten.
; und
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Representative Results
Mit der oben beschriebenen Protokoll, wir weichen Silikon in einem 35 mm Petrischale vorbereitet, bei 70 ° C für 30 min geheilt und fluoreszierende Microbeads gekoppelt (und Kollagen ich) auf die obere Fläche als schematisch in Abbildung 1dargestellt. Tiefen UV wurde zuvor für das eventuelle Protein Ankopplung an Substraten13verwendet. Beachten Sie, dass (I) die Aushärtung Bedingungen verwendet hier spezifisch für diese weiche Silikon sind und (II) die Einrückung Messung am nächsten Tag erfolgt wie das weiche Silikon erwartet wird, um ein bisschen weiter im Laufe eines Tages zu heilen.
Verschiedene Parameter, die die kugelförmige Vertiefung des Silikon-Oberfläche charakterisieren sind in Abbildung 2Agezeigt. Phase-Bildgebung wird verwendet, um entweder (I) das gesamte Bild der Eindringkörper zu erfassen, wie in Abbildung 2gezeigtB (mit Bild zu nähen, wenn nötig) oder (II) Teil des Bildes der Kugel. Der einzige Parameter aus der Eindringkörper Bild ist sein Durchmesser. Zum Beispiel hatte verschiedene individuelle Eindringkörper aus der gleichen Charge für den Eindringkörper, die, den wir mit dem 1:1 weichen Silikon in diesem Protokoll verwendet, Durchmessern, die von 950 µm bis zu 1.200 µm mit einem Mittelwert von 1.037 µm und einer Standardabweichung von 47 µm (8 Eindringkörper) reichten. Beachten Sie, dass der Durchmesser für ein bestimmtes Eindringkörper (anstatt der mittlere Durchmesser für viele Eindringkörper) gemessen von dieser bestimmten Eindringkörper für die Berechnung der Steifigkeit der Einrückung-induzierte verwendet werden soll.
Fluoreszierende Bilder von Microbeads in die obere Fläche des Silikons werden auf ein X-y -Frame-Position getroffen, so dass die Region unter der Eindringkörper im rechten Teil des Rahmens ist. Die Region im linken Teil des Rahmens wird gewählt, um die Region abseits der Eindringkörper werden wie in Abbildung 3dargestellt. Z-Stapel Bilder der Regionen unter der Eindringkörper und Weg von der Eindringkörper sind in Abbildung 3sowie angezeigt. Für die 1 mm Durchmesser Zirkonium Eindringkörper mit dem 1:1 weichen Silikon verwendet unterscheiden sich die Z-Werte an die die 2 Regionen in den Fokus gerückt von etwa 20 µm (δ). Dies ist viel kleiner als die Dicke aus weichem Silikon, das war rund 3.500 µm mit der Dichte (4,66 g/cm3) von der Zirkonium-Eindringkörper (das tatsächlich aus einer Mischung aus Zirkondioxid und Siliziumdioxid besteht) und die Dichte der Flüssigkeit Medium (für PBS: 1,01 g/cm3), die Nettokraft, die auf das Silikon ausgeübt kann berechnet werden. Für den Fall in Betracht gezogen war es im Bereich von 20-25 µN. Elastizitätsmodul, die wir für die 1:1 weiche Silikon berechnet war 7,2 ± 2,4 kPa (von 28 Standorten gebündelt aus 6 unabhängige Stichproben). Die repräsentative Ergebnisse für andere umlenkern Kennzahlen für die gleichen weichen Silikon (angegeben in der zugehörigen Tabelle der spezifischen Reagenzien) sind in Tabelle 1angegeben. Schließlich, um die Kugel Einzug Methode zu validieren, die ein Weitfeld-Mikroskop verwendet, wie wir in diesem Protokoll beschrieben, wir auch die jungen Moduli gemessen ein Polyacrylamid-Gel, die wir mit einem Rheometer einen Elastizitätsmodul von 21 ± 3 kPa haben gekennzeichnet. Mit der Kugel Einzug Methode dieses Protokolls unter Verwendung eines Mikroskops Weitfeld Polyacrylamid-Gel von der gleichen Zusammensetzung zeigte sich ein Elastizitätsmodul von 22,1 ± 4.2 kPa, zeigt eine gute Übereinstimmung10. Vorbehalte zu diesen Messungen durchführt, während Aufmerksamkeit richten sich in die Diskussion Abschnitt.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Verfahrens zur Kopplung fluoreszierende Microbeads an der Oberseite aus weichem Silikon. (A) dem weichen Silikon, die geheilt wurde ausgesetzt, tiefen UV Licht für 5 min. (B) eine Mischung von EDC, Sulfo-NHS, Perlen und Kollagen ist ich im Wasser nach unten auf ein Stück Parafilm platziert einen Deckel mit kleinerem Durchmesser pipettiert. (C) die weichen Silikon-Probe wird auf diese Mischung invertiert, so dass es in Kontakt mit der Flüssigkeit, aber nicht mit der Oberseite des kleineren Deckels unter. Zwei Glas-Objektträger auf beiden Seiten, unter der Petrischale fungieren als Abstandshalter. (D) nach dem Waschen der Probe mit PBS, die weichen Silikon-Oberfläche beschichtet mit fluoreszierenden Microbeads Steifigkeit messbereit ist. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Schematische Darstellung der Kugel Einzug der weichen Silikon Oberfläche. (A) diese schematische Darstellung zeigt eine sphärische Eindringkörper auf der Oberfläche einer weichen Silikon-Probe. Verschiedene Parameter des Interesses sind angegeben. (B) dieses Panel zeigt ein Bild von einem 1 mm-Eindringkörper (auf einer weichen Silikon-Stichprobe) über Phase Bildgebung. Der Maßstab zeigt 250 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Bead Bildaufnahme und Bestimmung der in-Fokus Bild. (A) diese fluoreszenzbild zeigt Microbeads auf der Oberseite der weichen Silikon-Probe und der gewünschten X-y -Position der Frame im Verhältnis zu der Eindringkörper (gestrichelte Linie). Der Maßstab gibt an, dass 150 µm. Platten B und C Z-Stapel Fluoreszenzbilder der Regionen auf der weichen Silikon-Oberfläche (B) unter dem Eindringkörper und (C) Weg von der Eindringkörper (boxed Regionen im oberen Bild) zeigen. Die Z-Werte an die Region unter der Eindringkörper und der Region abseits der Eindringkörper bzw. kurz gefasst, sind entsprechen die Indikatoren z1 und z2. Die Skala Balken zeigen 20 µm. Die monochrome Bilder gezeigt werden denen, die im roten Kanal da nominell Rosa Microbeads verwendet wurden, deren Anregung und Emission Profile den roten-Kanal passen. (D) dieses Panel zeigt einen Intensität Linie Scan über eine Mikro-Perle (dargestellt in den Einschub-Bild mit einer gelben Linie über ihn), vielfältig im Mittelpunkt in Z-Schritten von 0,5 µm. Der Fokus (Z-Wert) entspricht das Bild im Fokus sind Objektiv basierend auf dem Z-Wert entsprechend des Linie Scans mit der höchsten maximalen Intensität wählbar. Der Maßstab im Einschub zeigt 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Silikon Elastomer * b | Youngs Modulus ** (kPa) |
| 1:1 | 7.2±2.4 |
| 4:7 | 37.6±3.9 |
| 1:2 | 64.1±6.9 |
| * in der zugehörigen Tabelle der Reagenzien/Spezialausrüstung angegeben ** als mit der Kugel-Einzug-Methode gemessen unter Verwendung eines Weitfeld-Mikroskops wie in diesem Protokoll aufgeführt |
|
Tabelle 1. Elastizitätsmodul aus weichem Silikon (für das besondere Silikon spezifiziert in der Tabelle der spezifischen Reagenzien/Gerät) für unterschiedliche Zusammensetzungen als gemessen unter Verwendung des Protokolls detailliert hier. Werte für das Verhältnis zwischen den zwei verschiedene Zubehör-umlenkern (und die entsprechende Anzahl der Messungen) sind 1:1 (28), 4:7 (13) und 1:2 (8).
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Discussion
Während die Kugel Einzug Methode einfach zu implementieren ist, Aufmerksamkeit auf die Wahl der Eindringkörper und die Dicke der Probe weichem Silikon zu entrichten. Die Gleichung zur Berechnung des Elastizitätsmoduls gilt unter einer Reihe von Bedingungen11und diese sind in der Regel erfüllt, wenn die Dicke der Probe Silikon > 10 % des Radius Eindringkörper ist und < ~ 13 x der Eindringkörper Radius. Wir fanden, dass Silikon Dicke von 5-10 x der Eindringkörper Radius eine gute Wahl, wobei die Probendicke nicht zu hoch ist (d. h.die Objektive Arbeitsabstand wird keine Einschränkung) und die berechnete Steifigkeit war auch nicht zu empfindlich, um die genauen Wert der Silikon Dicke. Die Wahl der sphärischen Eindringkörper sollte auch so sein, dass die Einrückung Tiefe δ < 10 % Silikon Dicke sowie < 10 % des Radius Eindringkörper. Mit diesen Überlegungen im Auge können Eindringkörper aus unterschiedlichem Material und Durchmesser verwendet werden, um die Steifigkeit des weicheren und härteren Silikone zu messen. Die Bestimmung der Eindringtiefe ist der kritischste Schritt dieses Protokolls. Die Methode vorgeschlagen, die in diesem Protokoll in unscharfe Bilder identifizieren sollen die Eindringtiefe zuverlässig zu bestimmen. Anzumerken ist, dass die Steifigkeit Berechnungsmethode für die Kugel Einzug Methode Hertzsche Theorie verwendet die reibungslose Kontakt übernimmt. Hier, das ist eine gute Voraussetzung für Eindringkörper geringer Rauheit. Während wir eine spezielle weiche Silikon-Elastomer (aufgeführt in der zugehörigen Tabelle der spezifischen Reagenzien) verwendet haben, können anderen gewerblichen Silikon-Elastomer-Kits verwendet werden. Hinweis, die steifere Silikon für Microfabrication verbreitet ist keine gute Wahl für die Herstellung von Substraten mit Steifheit im Bereich von kPa. Jedoch können weiche Silikone (die Steifigkeit im unteren Ende des Bereichs kPa) mit einem kleinen Prozentsatz der steifen Silikon zu Substraten mit Steifheit in den höheren Ende des Bereichs kPa gemischt werden. Je nach Elastomer kann ein Eindringkörper mit einer anderen Größe oder Dichte gewählt werden, solange die zuvor genannten Bedingungen erfüllt sind.
Ein paar wichtige Überlegungen für die Kopplung von fluoreszierenden Microbeads auf dem weichen Silikon-Oberfläche sind wichtig. Zunächst einmal, wir wählten 0,44 µm carboxylat Perlen, weil inhaltlich Fluorophor und Helligkeit war daher größer als die von ähnlichen Perlen von kleiner Größe. Kleinere Perlen Größen können verwendet werden, wenn die Perlen heller Fluorophore enthalten, aber wir empfehlen, dass Sub-Mikrometer-carboxylat-Perlen verwendet werden soll, um nicht die Auflösung des Verfahrens beeinträchtigen. Die Inkubation von der Silikon-Oberfläche mit dem EDC/Sulfo-NHS/Perle/col1-Gemisch wird mit der Silikon-Oberfläche in einer umgekehrten Konfiguration durchgeführt. Der Grund dafür, dass ist, wenn die Mischung mit den Perlen auf die Silikon-Oberfläche platziert wird, Regeln Wulst Klumpen auf die Silikon-Oberfläche führt zu einer schlechten räumlichen Auflösung während der fluoreszierenden Microbeads abgebildet sein werden. Sogar mit diesem Protokoll wurden Perle Klumpen (helle Regionen im oberen Bild in Abbildung 3) gelegentlich beobachtet. Sie sind jedoch nicht umfangreich genug, um die Methode Auflösung beeinträchtigen. Es ist auch möglich, Abstandhalter unter den Rändern der entweder der Petrischalen in Abbildung 1 zu verwenden, um die Silikon-Oberfläche, die Flüssigkeit zu kontaktieren, aber nicht die feste Oberfläche darunter zu ermöglichen. Die Kopplung der Microbeads an der Oberseite aus weichem Silikon kann auch ohne einen tiefen UV Licht Schritt durchgeführt werden, wenn Microbeads mit einer hydrophoben Beschichtung gewählt werden. Die Steifigkeit-Messung erfolgt auf dem endgültigen Substrat (nach der UV-Behandlung, Wulst Kupplung und ECM-Kupplung) auf welche Zellen überzogen werden kann. Es sollten berücksichtigen, dass eine Steifigkeit Charakterisierung nach Schritten (z. B. UV-Behandlung) durchgeführt werden sollte, die möglicherweise die Substrat-Steifigkeit verändern können, so dass die gemessenen Steifigkeit ist derjenige, der die Zellen ausgesetzt werden.
Anstelle einer Petrischale kann eine Platte aus steifen PDMS als Basis für die weichen Silikon-14verwendet werden. Eine solche Konfiguration kann verwendet werden, für die Anwendung einer externen Strecke auf Zellen, wobei die steifere Silikon der Rahmen bietet, der gedehnt werden kann, und das weiche Silikon bietet eine Zelle Mikro-Umgebung der Steifigkeit, die mehr physiologische ist. Traktion-Kraft-Mikroskopie-15,-16können auch mit Zellen überzogen auf diese weiche Silikon Gel7,8durchgeführt werden, und das Vorhandensein von fluoreszierenden Microbeads in nur die oberste Schicht ermöglicht eine gute Auflösung mit nur ein Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskop. Kollagen, die ich in diesem Protokoll mit anderen Proteinen der extrazellulären Matrix ersetzt werden kann. Im Vergleich zu etwas aufwändiger Methoden wie Rasterkraftmikroskopie, kann die Kugel Einzug Methode leichter, im allgemeinen implementiert werden. Die Abweichung in der Zwischenzeit Youngs Moduli erhalten mit der Kugel-Einzug-Methode im Vergleich zu bestimmt, dass mit einem Rheometer ist in der Regel < 10 %10. So bietet die Kugel Einzug Methode (mit dem Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskop) eine zugängliche Methode für die Quantifizierung von weichem Silikon (oder Hydrogel) Steifigkeit für Anwendungen im Mechanobiology.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir danken Margaret Gardel für großzügig erlaubt die Verwendung von dem Rheometer. Wir erkennen an Unterstützung von den NIH (1R15GM116082), die diese Arbeit ermöglichte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CY 52-276 A/B silicone elastomer kit | Dow Corning | CY 52-276 | Store at room temperature |
| Thermo Scientific Pierce EDC | Fisher Scientific | PI22980 | Store at -20°C |
| Thermo Scientific Pierce Sulfo-NHS crosslinker | Fisher Scientific | PI-24510 | Store at 4°C |
| Carboxyl fluorescent pink particles, 0.4-0.6 µm, 2 mL | Spherotech, Inc. | CFP-0558-2 | Store at 4°C, do not freeze |
| 1.0 mm Acid washed Zirconium beads | OPS Diagnostics LLC | BAWZ 1000-250-33 | |
| Deep UV chamber with ozone evacuator | Novascan Technologies, Inc. | PSD-UV4, OES-1000D | |
| Wide field fluorescence microscope | Leica Microsystems | DMi8 | |
| Collagen I, from rat tail | Corning | 354236 | Stock concentration = 4 mg/ml; store at 4°C |
| ImageJ-NIH | N/A | N/A | public-domain software |
References
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