在原位生物过程单细胞形态实时测定的显微镜

Summary

研制了一种光学原位显微镜装置，用于直接监测细胞悬浮液中单个细胞的大小。通过将光光学可消毒探头与自动图像分析相结合，进行实时测量。形态变化表现为依赖生长状态和栽培条件。

Abstract

微生物生物工艺中的原位监测主要限于介质的化学和物理特性（例如，pH值和溶解氧浓度）。然而，细胞的形态可以是最佳条件的合适指标，因为它随着生长状态、产物积累和细胞压力的依赖而变化。此外，单细胞大小分布不仅提供有关种植条件的信息，而且还提供有关种群异质性的信息。为了获得这种信息，研制了一个光学原位显微镜装置^1，以便直接监测生物反应器中细胞悬浮液中的单细胞大小分布。基于神经网络模型的自动图像分析与显微镜相结合，该模型使用用户带号的图像进行训练。从显微镜捕获中获得的几个参数与细胞的加工相关特征（如其代谢活性）相关。到目前为止，已采用原位显微镜探针系列测量丝状真菌悬浮液的颗粒大小。用于区分微藻栽培中的单细胞大小，并将其与脂质积累联系起来。细胞颗粒的形状与酵母培养物的萌芽有关。显微镜分析通常可以分为三个步骤：（一） 图像采集，（ii） 粒子识别和 （iii） 数据分析。所有步骤都必须适应生物体，因此需要特定的有分号信息才能获得可靠的结果。能够直接在线或在线（旁路）监控细胞形态的变化，从而在过程开发和生产规模中实现实时值的监测和控制。如果线下数据与实时数据相关，则当前繁琐的线下测量对像元大小的影响变得未知。

Introduction

细胞的形态特征往往与生理状态有关，许多应用存在形态与功能之间的连接。单个细胞的形态受生长状态、细胞年龄、渗透和其他潜在细胞应力或产物积累的影响。细胞的形态变化通常是一种文化生长活力的量度。细胞内产物合成、藻类中脂质积累、细菌内含物形成等都与细胞大小有关。细胞聚集可能是另一个值得研究的因素，最近总结^2。

种群异质性可以根据单个细胞的形态特征进行量化。研究表明，一种培养体内的异质性可能很重要，例如，在大规模生产条件下^，总产量可能受亚种群^低性能4的影响。

通常，细胞的形态特征评估是通过人工采样或与光光学器件耦合的通路流室进行的。这导致几个限制：有限的获取数据很难提供统计上可靠的测量;与过程动态相比，采样与结果可及性之间的时间延迟可能太长;最重要的是，取样过程（取样口的位置、测量前样品的预处理、取样或旁路管中的不利条件）可能会触发有偏差的错误，因为采样过程本身已经会影响细胞形态。最后，在取样过程中或在通过式溶液中，如果它们不能就地消毒，则始终存在很高的污染风险。

原位显微镜（ISM）的应用可以绕过其中的几个问题。如果细胞被自动检测到，可以调查其形态特征的正确识别^5。到目前为止，这种方法的主要局限性是：（i） 图像的评估时间，对于原位应用来说太长，以及 （ii） 图像分辨率差，特别是在高单元密度下。虽然ISM的第一个解决方案包括机械取样，稀释探头，或限于一个通过系统^6，7，进一步的方法允许捕获细胞悬浮直接^8。

ISM的最新进展允许在单细胞基础上对细胞进行在线或在线监测，从而在细胞浓度相当高的细胞悬浮液中直接实时地分布形态参数。通过对细胞关键参数的线下分析，可以识别与耦合自动细胞检测和ISM提供的信息的相关性。然后，实现了新的软传感器设计，其中用单细胞形态估计了不可测量的参数。

在本报告中，ISM是通过将光光学探头与自动图像分析耦合来进行的。ISM 由单杆传感器探头组成，该探头可通过高分辨率 CCD 摄像机 [MM-Ho + CCD GT2750 （2750×2200） 和 MM 2.1 = CMOS G507c （2464×2056）]在可调节的测量间隙中捕获已知对焦范围内的图像。闪光灯照明通过传输进行。因此，光线来自摄像机⁹的另一侧，可以调整其强度。细胞通过液体流动连续通过这个间隙。因此，获得了具有代表性的样本总体。探头可直接安装在生物反应器上，使其伸入细胞悬浮液，或可灭菌的通过。传感器外壳在灭菌前连接到系统，光学部件随后安装到外壳中。

到目前为止，相关工业微生物，如丝状真菌（直径高达200μm），异营养微藻Crypthecodiniumcohnii（平均细胞直径为20μm），以及酵母糖霉菌（平均细胞直径为5μm），被研究，这是不久描述的。

在一定的栽培条件下，丝状真菌往往形成颗粒。这些大小高达几百微米。真菌细胞的子宫在流体阶段对流体动力学应力的依赖性不同。这对代谢和生长活性、基质摄入和产品释放有影响。ISM用于识别颗粒大小分布和颗粒边缘低生物量密度区域的宽度（自己的未发布数据）。

当细胞在氮限制下积累多不饱和脂肪酸多糖六烯酸（DHA）时，cohnii的体积在15至26μm之间改变。这种生物技术DHA生产工艺由两部分组成，即细胞分裂和变小的生长阶段，以及细胞积累产品并因此变大的生产阶段。因此，细胞大小用于确定过程状态，其中生长或DHA生产有利。最后，发现细胞大小与DHA含量之间的相关性。在这种情况下，ISM允许实时监测细胞内DHA积累，无需取样、细胞中断和常见的气相色谱分析^10。

发芽酵母的大小通常在3至8μm之间。一次处于成熟状态的细胞比例，如萌芽指数（BI）所述，提供了生长活力^11、12的信息，甚至与重组蛋白分泌的关系也已被证明^为13。在ISM的帮助下，萌芽和非发芽的酵母细胞（有芽和无芽的细胞）被区分^为14。压力条件还可能导致酵母群体中细胞大小的更大变化，正如最近在缩小栽培中显示的，其中大规模营养有限喂养批次种植的条件被模仿^为3。

因此，ISM有可能在生物过程的所有阶段监测单细胞水平上的生长活力和产品形成，以识别最佳的培养条件，或用于过程控制。本文描述的方法侧重于单细胞的微生物应用，但也适用于较大的颗粒，如人类和动物细胞、细胞聚集物和丝状生物颗粒。

Protocol

注：以下步骤是使参数适应各自的微生物和培养条件所必需的。对于有经验的用户，探头设置的调整持续约 20 分钟。SOPAT GmbH 的相应探测手册中详细介绍了工具和步骤。通常，需要以下协议中提供的工具：（i） 探头控制器用于探头调整和图像采集;（二） 探头控制器用于探头调整和图像采集;（三） 探头控制器用于探头调整和图像采集;（三）探头控制器用于探头调整和图像采集。（二）<em…

Representative Results

利用ISM和自动图像检测成功检测酵母培养物中的细胞大小，以区分萌芽细胞和非发芽细胞。频闪镜强度和测量间隙的选择都有一个公差范围，其中颗粒识别不受影响。例如，在干生物质浓度为4 gL-1的11%的变异范围内，用各种频闪镜强度测量S.cerevisiae细胞。相应的图像提供了清晰的细胞边界，因此，在细胞大小可接受的变化（1%）下，粒子识别是可行的。无论…

Discussion

此处提供的ISM具有相同或非常相似的装置，用于测量真菌、微藻和酵母细胞的形态动力学，从而能够确定生长活性，在藻类的情况下，细胞内产品积累。该传感器没有可移动部件，可直接适用于任何标准搅拌罐生物反应器，无论是通过标准端口还是可灭菌的通过。由于酵母比藻类小得多，因此细胞尺寸的减小需要一些最近的硬件调整，如更高的摄像机分辨率和传输照明，以便获得足够的酵母像素?…

Materials

Sensor MM 2.1 – MFC	SOPAT GmbH, Germany	n.a.	Inline Monocular Microscopic probe Version 2.1 with a Mirco Flow Cell
Sofware version v1R.003.0092	SOPAT GmbH, Germany	n.a.
Thickness gauge	n.n.		It can be any supplier, DIN 2275:2014-03
Ethanol 70%	n.n.		It can be any supplier
SOPAT manual Version 2.0.5	SOPAT GmbH, Germany
Optical lense paper	VWR	470150-460
Fiji, ImageJ	open source
50 mL conical centrifuge tubes			It can be any supplier