In Situ Microscopía para la determinación en tiempo real de la morfología de una sola célula en bioprocesos

Summary

Se desarrolló un dispositivo fotoóptico de microscopía in situ para monitorear el tamaño de las células individuales directamente en la suspensión celular. La medición en tiempo real se lleva a cabo mediante el acoplamiento de la sonda esterilizable fotoóptica a un análisis de imagen automatizado. Los cambios morfológicos aparecen con dependencia del estado de crecimiento y las condiciones de cultivo.

Abstract

La monitorización in situ en bioprocesos microbianos se limita principalmente a las propiedades químicas y físicas del medio(por ejemplo,el valor de pH y la concentración de oxígeno disuelto). Sin embargo, la morfología de las células puede ser un indicador adecuado para condiciones óptimas, ya que cambia con dependencia del estado de crecimiento, acumulación de productos y estrés celular. Además, la distribución del tamaño de una sola célula proporciona no sólo información sobre las condiciones de cultivo, sino también sobre la heterogeneidad de la población. Para obtener dicha información, se desarrolló un dispositivo fotoóptico de microscopía in situ ¹ para permitir el seguimiento de la distribución del tamaño de una sola célula directamente en la suspensión celular en biorreactores. Un análisis de imagen automatizado se acopla a la microscopía basada en un modelo de red neuronal, que se entrena con imágenes anotadas por el usuario. Varios parámetros, que se obtienen de las capturas del microscopio, están correlacionados con el proceso de características relevantes de las células, como su actividad metabólica. Hasta ahora, la serie de sondas de microscopía in situ presentadas se aplicaba para medir el tamaño del pellet en suspensiones de hongos filamentosos. Se utilizó para distinguir el tamaño de una sola célula en el cultivo de microalgas y relacionarlo con la acumulación de lípidos. La forma de las partículas celulares estaba relacionada con el brote en los cultivos de levadura. El análisis de microscopía generalmente se puede dividir en tres pasos: (i) adquisición de imágenes, (ii) identificación de partículas y (iii) análisis de datos, respectivamente. Todos los pasos tienen que ser adaptados al organismo, y por lo tanto se requiere información específica anotada para lograr resultados confiables. La capacidad de monitorear los cambios en la morfología celular directamente en línea o en línea (en un by-pass) permite valores en tiempo real para la supervisión y el control, en el desarrollo de procesos, así como en la escala de producción. Si los datos fuera de línea se correlacionan con los datos en tiempo real, las tediosas mediciones actuales fuera de línea con influencias desconocidas en el tamaño de la celda se vuelven innecesariamente.

Introduction

Las características morfológicas de las células a menudo están relacionadas con el estado fisiológico, existe una conexión entre la forma y la función para muchas aplicaciones. La morfología de una sola célula está influenciada por el estado de crecimiento, la edad de la célula, las tensiones osmóticas y otras posibles tensiones celulares o la acumulación de productos. Los cambios morfológicos de las células son a menudo una medida de la vitalidad de crecimiento de una cultura. La síntesis de productos intracelulares, la acumulación de lípidos en las algas y la formación del cuerpo de inclusión en bacterias, entre otros, también están relacionados con el tamaño de la célula. La aglomeración celular puede ser otro factor que vale la pena investigar como se resume recientemente².

Las heterogeneidades de la población se pueden cuantificar en función de las características morfológicas de las células individuales. Los estudios demostraron que la heterogeneidad dentro de un cultivo podría ser significativa, por ejemplo,en condiciones de producción a gran escala³ el rendimiento global podría verse afectado por un bajo rendimiento de las subpoblaciones^4.

Por lo general, la evaluación de las características morfológicas de las células se realiza mediante muestreo manual o con una cámara de flujo de derivación acoplada a un dispositivo fotoóptico. Esto conduce a varias restricciones: la cantidad limitada de datos adquiridos difícilmente puede proporcionar mediciones estadísticamente confiables; el retraso de tiempo entre el muestreo y la accesibilidad de los resultados puede ser demasiado largo en comparación con la dinámica del proceso; y lo más importante, el procedimiento de muestreo (ubicación del puerto de muestreo, pretratamiento de la muestra antes de la medición, condiciones desfavorables en el muestreo o tubo de derivación) puede desencadenar un error sesgado ya que el procedimiento de la muestra en sí ya puede afectar a la célula Morfología. Por último, siempre existe un alto riesgo de contaminación durante el muestreo o en soluciones de derivación, si no son esterilizables en su lugar.

La aplicación de microscopía in situ (ISM) puede eludir varios de estos problemas. Si las células se detectan automáticamente, se puede examinar una identificación correcta de sus características morfológicas⁵. Hasta ahora, las principales limitaciones de este método eran (i) el tiempo de evaluación de las imágenes, que era demasiado largo para las aplicaciones in situ, y (ii) la mala resolución de las imágenes, especialmente en densidades de células altas. Aunque las primeras soluciones de ISM incluían muestreo mecánico, dilución de la sonda, o estaban restringidas a un sistema de derivación^6,7, enfoques adicionales permiten la captura de la suspensión celular directamente⁸.

Los avances recientes en ISM permiten el monitoreo en línea o en línea de las células sobre una sola célula, lo que proporciona la distribución de parámetros morfológicos en tiempo real directamente en suspensiones celulares a concentraciones celulares considerablemente altas. A través de análisis fuera de línea de los parámetros clave de las células, se pueden identificar correlaciones con la información proporcionada por la detección automatizada de células acopladas y el ISM. A continuación, se logran nuevos diseños de sensores blandos, en los que se estima un parámetro inconmensurable con la morfología de una sola célula.

En este informe, el ISM se lleva a cabo mediante el acoplamiento de una sonda fotoóptica a un análisis de imagen automatizado. El ISM consiste en una sonda de sensor de varilla única que permite la captura de imágenes dentro de un rango de enfoque conocido en una brecha de medición ajustable con una cámara CCD de alta resolución [MM-Ho – CCD GT2750 (2750×2200) y MM 2.1 – CMOS G507c (2464×2056)]. La iluminación de la luz del flash se lleva a cabo por transmisión. Por lo tanto, la luz se origina en el lado opuesto de la cámara⁹ y su intensidad se puede ajustar. Las células pasan continuamente a través de este hueco con el flujo de líquido. Por lo tanto, se obtiene una población de muestra representativa. La sonda se puede montar directamente en el biorreactor para que llegue a la suspensión celular, o se puede utilizar en un by-pass esterilizable. La carcasa del sensor está conectada al sistema antes de la esterilización, las piezas ópticas se montan posteriormente en la cáscara.

Hasta ahora, se investigaban con este o similar el diámetro de los hongos filamentosos (diámetro de hasta 200 m), microalgas heterotróficas Crypthecodinium cohnii (diámetro celular medio de 20 m) y la levadura Saccharomyces cerevisiae (diámetro celular medio de 5 m), que se describe en breve.

Los hongos filamentosos tienden a formar pellets bajo ciertas condiciones de cultivo. Estos son de un tamaño de hasta varios cientos de m. Las hifas de las células fúngicas desarrollan diferentes longitudes en dependencia a la tensión hidrodinámica en la fase fluida. Esto tiene una influencia en la actividad metabólica y de crecimiento, la toma de sustratos y la liberación del producto. ISM se aplicó para identificar la distribución del tamaño del pellet y la anchura de las zonas de menor densidad de biomasa en los bordes de los pellets (datos propios no publicados).

El tamaño de C. cohnii se altera entre 15 y 26 m cuando las células acumulan el ácido graso poliinsaturado docosahexaenoico (DHA) bajo limitación de nitrógeno. Este proceso biotecnológico de producción de DHA consta de dos partes, la fase de crecimiento, en la que las células se dividen y se hacen más pequeñas, y la fase de producción, en la que las células acumulan el producto y se hacen así más grandes. Por lo tanto, el tamaño de celda se utilizó para determinar el estado del proceso, en el que el crecimiento o la producción de DHA era favorable. Por último, se encontró una correlación entre el tamaño de celda y el contenido de DHA. En este caso, ISM permite monitorear la acumulación de DHA intracelular en tiempo real sin el requisito de muestreo, interrupción celular, y el análisis de cromatografía de gases común¹⁰.

La levadura en ciernes suele tener un tamaño de entre 3 y 8 m. La proporción de células que se encuentran en estado de maduración a la vez, como se describe con el índice en ciernes (BI), proporciona información sobre la vitalidad del crecimiento^11,12, e incluso una relación con la secreción de proteína recombinante¹³. Con la ayuda de ISM, las células de levadura en ciernes y no en ciernes (células con y sin brote) se distinguieron^14. Las condiciones de estrés también pueden conducir a una variación más amplia del tamaño de la célula dentro de una población de levadura, como se ha demostrado recientemente en los cultivos de reducción de escala, en los que las condiciones de los cultivos de lotes alimentados con nutrientes limitados a gran escala fueron imitadas³.

Por lo tanto, ISM tiene el potencial de monitorear la vitalidad del crecimiento y la formación de productos a nivel de una sola célula durante todas las etapas de un bioproceso para la identificación de condiciones óptimas de cultivo, o con el propósito de control del proceso. Los métodos descritos aquí se centran en aplicaciones microbianas con células individuales, pero también son aplicables a partículas más grandes como células humanas y animales, aglomerados celulares y pellets de organismos filamentosos.

Protocol

NOTA: Los siguientes pasos son necesarios para adaptar los parámetros a las respectivas condiciones de microorganismo y cultivo. El ajuste de la configuración de la sonda dura unos 20 minutos para un usuario experimentado. En el manual de la sonda correspondiente de SOPAT GmbH se proporciona una descripción detallada de las herramientas y los pasos. En general, se necesitan las herramientas que se presentan en el siguiente protocolo: (i) Controlador de sonda para ajustes de sonda y adquisición de imágenes; …

Representative Results

La detección del tamaño de la célula en cultivos de levadura con el ISM y la detección automatizada de imágenes para distinguir entre células en ciernes y no en ciernes se llevó a cabo con éxito. Tanto la intensidad del estescopio como la elección de la brecha de medición tienen un rango de tolerancia, en el que la identificación de partículas no se ve afectada. Por ejemplo, las células de S. cerevisiae se midieron con varias intensidades de estroboscopio dentro de u…

Discussion

El ISM presentado aquí con los mismos o muy similares dispositivos se utilizó para medir la dinámica morfológica de hongos, microalgas y células de levadura, lo que permitió la determinación de la actividad de crecimiento, y en el caso de las algas, la acumulación de productos intracelulares. El sensor no tiene piezas móviles y es directamente aplicable en cualquier biorreactor de tanque agitado estándar, ya sea a través de un puerto estándar o en un by-pass esterilizable. Dado que la levadura es mucho más p…

Materials

Sensor MM 2.1 – MFC	SOPAT GmbH, Germany	n.a.	Inline Monocular Microscopic probe Version 2.1 with a Mirco Flow Cell
Sofware version v1R.003.0092	SOPAT GmbH, Germany	n.a.
Thickness gauge	n.n.		It can be any supplier, DIN 2275:2014-03
Ethanol 70%	n.n.		It can be any supplier
SOPAT manual Version 2.0.5	SOPAT GmbH, Germany
Optical lense paper	VWR	470150-460
Fiji, ImageJ	open source
50 mL conical centrifuge tubes			It can be any supplier