In situ Microscopie voor real-time bepaling van eencellige morfologie in bioprocessen
Summary
Een foto-optisch in situ microscopie apparaat is ontwikkeld om de grootte van afzonderlijke cellen direct in de celsuspensie te bewaken. De real-time meting wordt uitgevoerd door de foto-optische steriliseerbare sonde te koppelen aan een geautomatiseerde beeldanalyse. Morfologische veranderingen verschijnen met afhankelijkheid van de groei toestand en de teeltomstandigheden.
Abstract
In-situ monitoring in microbiële bioprocessen is meestal beperkt tot chemische en fysische eigenschappen van het medium (bijv.pH-waarde en de concentratie opgeloste zuurstof). Niettemin, de morfologie van cellen kan een geschikte indicator voor optimale omstandigheden, omdat het verandert met afhankelijkheid van de groei toestand, product accumulatie en cel stress. Bovendien biedt de eencellige distributie niet alleen informatie over de teelt condities, maar ook over de heterogeniteit van de populatie. Om dergelijke informatie te verkrijgen, werd een foto-optisch in situ microscopie apparaat1 ontwikkeld om de bewaking van de eencellige grootte distributie rechtstreeks in de celsuspensie in bioreactoren mogelijk te maken. Een geautomatiseerde beeldanalyse is gekoppeld aan de microscopie op basis van een Neural Network-model, dat is getraind met afbeeldingen met een gebruiker aantekeningen. Verschillende parameters, die worden opgedaan met de opnamen van de Microscoop, zijn gecorreleerd aan het proces van relevante kenmerken van de cellen, zoals hun metabole activiteit. Tot nu toe werd de gepresenteerde in situ microscopie sonde serie toegepast om de korrelgrootte te meten bij de suspensies van filamenteuze schimmels. Het werd gebruikt om de eencellige grootte in de microalgen teelt te onderscheiden en te relateren aan lipide accumulatie. De vorm van cellulaire deeltjes was gerelateerd aan ontluikende in gist culturen. De microscopie analyse kan over het algemeen in drie stappen worden opgesplitst: (i) beeld verwerving, (II) deeltjes identificatie, en (III) gegevensanalyse, respectievelijk. Alle stappen moeten worden aangepast aan het organisme, en daarom is specifieke geannoleerde informatie vereist om betrouwbare resultaten te bereiken. De mogelijkheid om veranderingen in celmorfologie direct in lijn of op lijn te monitoren (in een by-pass) maakt real-time waarden mogelijk voor bewaking en controle, zowel in procesontwikkeling als op productieschaal. Als de off line gegevens correleert met de real-time gegevens, worden de huidige vervelende off line metingen met onbekende invloeden op de celgrootte onnodig.
Introduction
Morfologische kenmerken van cellen zijn vaak gerelateerd aan de fysiologische toestand, een verbinding tussen vorm en functie bestaat voor veel toepassingen. De morfologie van een enkele cel wordt beïnvloed door de toestand van de groei, de leeftijd van de cel, osmotische en andere potentiële celspanningen of product accumulatie. Morfologische veranderingen van cellen zijn vaak een maatstaf voor de groei vitaliteit van een cultuur. Intracellulaire product synthese, lipide accumulatie in algen en inclusie lichaam vorming in bacteriën, onder andere, zijn gerelateerd aan de celgrootte ook. Celagglomeratie kan een andere factor zijn die het waard is om te onderzoeken, zoals onlangs samengevat2.
Populatie heterogeneities kunnen worden gekwantificeerd op basis van morfologische kenmerken van individuele cellen. Studies toonden aan dat heterogeniteit binnen een cultuur significant zou kunnen zijn, bijvoorbeeldbij grootschalige productieomstandigheden3 de totale opbrengst kan worden beïnvloed door een lage prestatie van subpopulaties4.
Gewoonlijk wordt de beoordeling van morfologische kenmerken van cellen uitgevoerd door manuele bemonstering of met een door-Pass-stroom kamer gekoppeld aan een foto-optisch apparaat. Dit leidt tot verschillende beperkingen: de beperkte hoeveelheid verworven gegevens kan nauwelijks statistisch betrouwbare metingen leveren; de tijdsvertraging tussen de bemonstering en de toegankelijkheid van de resultaten kan te lang zijn in vergelijking met de dynamiek van het proces; en belangrijkste, de bemonsteringsprocedure (locatie van de bemonsteringspoort, voor behandeling van het monster vóór de meting, ongunstige omstandigheden in de bemonstering of bypass buis) kan een partijdige fout veroorzaken, omdat de voorbeeldprocedure zelf al van invloed kan zijn op de cel Morfologie. Ten slotte bestaat er altijd een hoog risico op verontreiniging tijdens de bemonstering of in by-pass-oplossingen, als deze niet steriliseerbaar zijn.
De toepassing van in-situ microscopie (ISM) kan verschillende van deze problemen omzeilen. Als cellen automatisch worden gedetecteerd, kan een juiste identificatie van hun morfologische kenmerken worden onderzocht5. Tot nu toe waren de belangrijkste beperkingen van deze methode (i) de evaluatietijd van beelden, die te lang was voor in-situ toepassingen, en (II) de slechte resolutie van beelden, vooral bij hoge celdichtheid. Hoewel eerste oplossingen van ISM omvatte mechanische bemonstering, verdunning van de sonde, of waren beperkt tot een by-pass systeem6,7, verdere benaderingen maken het vastleggen van de cel schorsing rechtstreeks8.
Recente vooruitgang in ISM zorgt voor de in-lijn of on- Line bewaking van cellen op één celbasis, die de verspreiding van morfologische parameters in real-time rechtstreeks in celsuspensies bij aanzienlijk hoge celconcentraties verschaft. Door middel van off line analyses van de belangrijkste parameters van de cellen, kunnen correlaties worden geïdentificeerd met informatie die wordt verstrekt door de gekoppelde geautomatiseerde celdetectie en ism. Vervolgens worden nieuwe soft-sensor ontwerpen bereikt, waarbij een onmeetbaar parameter wordt geschat met de eencellige morfologie.
In dit rapport wordt het ISM uitgevoerd door een fotooptische sonde te koppelen aan een geautomatiseerde beeldanalyse. Het ISM bestaat uit een sensor sonde met één staaf die het mogelijk maakt om beelden binnen een bekende Focus range in een instelbare meet kloof te vangen met een CCD-camera met hoge resolutie [MM-Ho = CCD GT2750 (2750×2200) en MM 2,1 = CMOS G507c (2464×2056)]. De flitslicht verlichting wordt uitgevoerd door transmissie. Daarom is het licht afkomstig van de tegenoverliggende kant van de camera9 en kan de intensiteit ervan worden aangepast. Cellen passeren continu door deze kloof met de vloeistofstroom. Daarom wordt een representatieve steekproefpopulatie verkregen. De sonde kan direct aan de bioreactor worden gemonteerd, zodat deze in de celsuspensie terechtkomt, of kan worden gebruikt in een doorgang gesterseerbaar. De sensor shell is aangesloten op het systeem voorafgaand aan sterilisatie, de optische onderdelen worden daarna in de shell gemonteerd.
Tot nu, relevante industriële micro-organismen, bijvoorbeeld, filamenteeuze schimmels (diameter tot meer dan 200 μm), de heterotrofe microalg Crypthecodinium cohnii (gemiddelde celdiameter van 20 μm), en de gist Saccharomyces cerevisiae (gemiddelde celdiameter van 5 μm), werden onderzocht met deze of soortgelijke apparaten, die binnenkort wordt beschreven.
Filamenteuze schimmels hebben de neiging om pellets te vormen onder bepaalde teeltomstandigheden. Deze zijn van een grootte van maximaal enkele honderden μm. De schimmeldraden van de schimmelcellen ontwikkelen verschillende lengtes in afhankelijkheid van de hydrodynamische spanning in de vloeistoffase. Dit heeft een invloed op de metabole en groei activiteit, substraat opname en product release. ISM werd toegepast om de korrelgrootte verdeling en de breedte van zones van lagere dichtheid van de biomassa aan de randen van de pellets (eigen niet-gepubliceerde gegevens) te identificeren.
De grootte van C. cohnii verandert tussen 15 en 26 μm wanneer cellen accumuleren het meervoudig onverzadigde vetzuur Docosahexaeenzuur (DHA) onder stikstof beperking. Dit biotechnologische DHA-productieproces bestaat uit twee delen, de groeifase, waarin cellen zich delen en kleiner worden, en de productiefase, waarin cellen het product accumuleren en dus groter worden. Daarom werd de celgrootte gebruikt om de processtatus te bepalen, waarbij ofwel groei of DHA-productie gunstig was. Ten slotte is een correlatie tussen de celgrootte en de DHA-inhoud gevonden. In dit geval maakt ISM het mogelijk om de accumulatie van intracellulaire DHA in real time te bewaken zonder de vereiste van bemonstering, celverstoring en de gemeenschappelijke gaschromatografie-analyse10.
Ontluikende gist is meestal van een grootte tussen 3 en 8 μm. Het aandeel van cellen in de rijpings toestand op een tijdstip, zoals beschreven met de ontluikende index (BI), verschaft informatie over de groei vitaliteit11,12, en zelfs een relatie met recombinant eiwit secretie is bewezen13. Met behulp van ISM werden ontluikende en niet-ontluikende gistcellen (cellen met en zonder knop)14onderscheiden. Stress omstandigheden kunnen ook leiden tot een bredere variatie van de celgrootte binnen een gist populatie, zoals onlangs weergegeven in Scale-down cultivaties, waarin de voorwaarden van grootschalige nutriënt-beperkte fed-batch cultivaties werden geïmiteerd3.
Daarom heeft ISM het potentieel om de groei vitaliteit en product vorming op één celniveau te monitoren tijdens alle stadia van een Bioprocess voor de identificatie van optimale kweek condities, of voor het doel van procesbeheersing. De hier beschreven methoden zijn gericht op microbiële toepassingen met enkelvoudige cellen, maar zijn ook toepasbaar op grotere deeltjes zoals menselijke en dierlijke cellen, celagglomeraten en pellets van filamenteuze organismen.
Protocol
Representative Results
Discussion
ISM zoals hier gepresenteerd met dezelfde of zeer soortgelijke apparaten werd gebruikt voor het meten van de morfologische dynamiek van schimmels, microalgen, en gistcellen, die de bepaling van de groei activiteit mogelijk, en in het geval van algen, intracellulaire product accumulatie. De sensor heeft geen beweegbare onderdelen en is rechtstreeks toepasbaar in elke standaard geroerd tank bioreactor, hetzij via een standaard poort of in een steriliseerbare by-pass. Omdat gist veel kleiner is dan algen, vereiste de afname…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs zijn dankbaar voor de steun van het Duitse federale ministerie van economie en energie binnen het kader van ZIM-koop, project “Smart process inspectie”, Grant No. ZF 4184201CR5.
Materials
| Sensor MM 2.1 – MFC | SOPAT GmbH, Germany | n.a. | Inline Monocular Microscopic probe Version 2.1 with a Mirco Flow Cell |
| Sofware version v1R.003.0092 | SOPAT GmbH, Germany | n.a. | |
| Thickness gauge | n.n. | It can be any supplier, DIN 2275:2014-03 | |
| Ethanol 70% | n.n. | It can be any supplier | |
| SOPAT manual Version 2.0.5 | SOPAT GmbH, Germany | ||
| Optical lense paper | VWR | 470150-460 | |
| Fiji, ImageJ | open source | ||
| 50 mL conical centrifuge tubes | It can be any supplier |
References
- Maaß, S., Rojahn, J., Hänsch, R., Kraume, M. Automated drop detection using image analysis for online particle size monitoring in multiphase systems. Computers & Chemical Engineering. 45, 27-37 (2012).
- Lemoine, A., Delvigne, F., Bockisch, A., Neubauer, P., Junne, S. Tools for the determination of population heterogeneity caused by inhomogeneous cultivation conditions. Journal of biotechnology. 251, 84-93 (2017).
- Marbà-Ardébol, A. M., Bockisch, A., Neubauer, P., Junne, S. Sterol synthesis and cell size distribution under oscillatory growth conditions in Saccharomyces cerevisiae scale-down cultivations. Yeast. 35 (2), 213-223 (2017).
- Xiao, Y., Bowen, C. H., Liu, D., Zhang, F. Exploiting nongenetic cell-to-cell variation for enhanced biosynthesis. Nature chemical biology. 12 (5), 339-344 (2016).
- Beutel, S., Henkel, S. In situ sensor techniques in modern bioprocess monitoring. Applied microbiology and biotechnology. 91 (6), 1493 (2011).
- Belini, V. L., Wiedemann, P., Suhr, H. In situ microscopy: A perspective for industrial bioethanol production monitoring. Journal of microbiological methods. 93 (3), 224-232 (2013).
- Havlik, I., et al. Monitoring of microalgal cultivations with on-line, flow-through microscopy. Algal Research. 2 (3), 253-257 (2013).
- Suhr, H., Herkommer, A. M. In situ microscopy using adjustment-free optics. Journal of biomedical optics. 20 (11), 116007 (2015).
- Panckow, R. P., Reinecke, L., Cuellar, M. C., Maaß, S. Photo-Optical In-Situ Measurement of Drop Size Distributions: Applications in Research and Industry. Oil Gas Sci. Technol. – Rev. IFP Energies. 72 (3), 14 (2017).
- Marbà-Ardébol, A. -. M., Emmerich, J., Neubauer, P., Junne, S. Single-cell-based monitoring of fatty acid accumulation in Crypthecodinium cohnii with three-dimensional holographic and in situ microscopy. Process Biochemistry. 52, 223-232 (2017).
- Porro, D., Vai, M., Vanoni, M., Alberghina, L., Hatzis, C. Analysis and modeling of growing budding yeast populations at the single cell level. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 75 (2), 114-120 (2009).
- Brauer, M. J., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Molecular biology of the cell. 19 (1), 352-367 (2008).
- Puxbaum, V., Gasser, B., Mattanovich, D. The bud tip is the cellular hot spot of protein secretion in yeasts. Applied microbiology and biotechnology. 100 (18), 8159-8168 (2016).
- Marbà-Ardébol, A. M., Emmerich, J., Neubauer, P., Junne, S. Vol. P2. Prozessmesstechnik. , 222-225 (2017).
- Marbà-Ardébol, A. -. M., Emmerich, J., Muthig, M., Neubauer, P., Junne, S. Real-time monitoring of the budding index in Saccharomyces cerevisiae batch cultivations with in situ microscopy. Microbial cell factories. 17 (1), 73 (2018).
- Marquard, D., Schneider-Barthold, C., Düsterloh, S., Scheper, T., Lindner, P. Online monitoring of cell concentration in high cell density Escherichia coli cultivations using in situ Microscopy. Journal of biotechnology. 259, 83-85 (2017).
- Marquard, D., et al. In situ microscopy for online monitoring of cell concentration in Pichia pastoris cultivations. Journal of biotechnology. 234, 90-98 (2016).
- Camisard, V., Brienne, J., Baussart, H., Hammann, J., Suhr, H. Inline characterization of cell concentration and cell volume in agitated bioreactors using in situ microscopy: application to volume variation induced by osmotic stress. Biotechnology and bioengineering. 78 (1), 73-80 (2002).
- Böhm, A., Ücker, A., Jäger, T., Ronneberger, O., Falk, T. ISOODL: Instance segmentation of overlapping biological objects using deep learning. , 1225-1229 (2018).
- Davey, H. M. Life, Death, and In-Between: Meanings and Methods in Microbiology. Applied and environmental microbiology. 77 (16), 5571-5576 (2011).
- Lodolo, E. J., Kock, J. L., Axcell, B. C., Brooks, M. The yeast Saccharomyces cerevisiae-the main character in beer brewing. FEMS yeast research. 8 (7), 1018-1036 (2008).
- Albertin, W., et al. Population size drives industrial Saccharomyces cerevisiae. alcoholic fermentation and is under genetic control. Applied and environmental microbiology. 77 (8), 2772-2784 (2011).
- Gomes, J., Chopda, V. R., Rathore, A. S. Integrating systems analysis and control for implementing process analytical technology in bioprocess development. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 90 (4), 583-589 (2015).
