Em Situ Microscopia para determinação em tempo real da morfologia unicelular em bioprocessos

Summary

Um dispositivo de microscopia in situ foto-óptico foi desenvolvido para monitorar o tamanho de células individuais diretamente na suspensão celular. A medição em tempo real é conduzida aparando a sonda esterilizável foto-óptica a uma análise de imagem automatizada. Mudanças morfológicas aparecem com dependência do estado de crescimento e das condições de cultivo.

Abstract

O monitoramento in situ em bioprocessos microbianos é restrito principalmente a propriedades químicas e físicas do meio(por exemplo,valor do pH e concentração de oxigênio dissolvido). No entanto, a morfologia das células pode ser um indicador adequado para condições ideais, uma vez que muda com a dependência do estado de crescimento, acumulação de produtos e estresse celular. Além disso, a distribuição de tamanho unicelular fornece não apenas informações sobre as condições de cultivo, mas também sobre a heterogeneidade populacional. Para obter tais informações, foi desenvolvido um dispositivo de microscopia in situ foto-óptica¹ para permitir o monitoramento da distribuição de tamanho unicelular diretamente na suspensão celular em biorreatores. Uma análise de imagem automatizada é acoplada à microscopia baseada em um modelo neural da rede, que seja treinado com imagens usuário-anotadas. Vários parâmetros, que são obtidos a partir das capturas do microscópio, estão correlacionados ao processo de características relevantes das células, como sua atividade metabólica. Até agora, a série apresentada da ponta de prova da microscopia do in situ foi aplicada para medir o tamanho da pelota em suspensões filamentous dos fungos. Foi usado para distinguir o tamanho unicelular no cultivo de microalgas e relacioná-lo ao acúmulo de lipídios. A forma de partículas celulares foi relacionada ao brotamento em culturas do fermento. A análise da microscopia pode ser geralmente dividida em três etapas: (i) aquisição de imagem, (ii) identificação de partículas e (iii) análise de dados, respectivamente. Todas as etapas devem ser adaptadas ao organismo e, portanto, são necessárias informações anotadas específicas para alcançar resultados confiáveis. A capacidade de monitorar as mudanças na morfologia celular diretamente em linha ou on-line (em um desvio) permite valores em tempo real para monitoramento e controle, no desenvolvimento de processos, bem como na escala de produção. Se os dados off-line se correlacionarem com os dados em tempo real, as medições off-line tediosas atuais com influências desconhecidas no tamanho da célula se tornam desnecessárias.

Introduction

Características morfológicas das células são muitas vezes relacionadas ao estado fisiológico, uma conexão entre forma e função existe para muitas aplicações. A morfologia de uma única célula é influenciada pelo estado de crescimento, idade da célula, estresses ómóticos e outras células potenciais ou acúmulo de produtos. As mudanças morfológicas das células são muitas vezes uma medida da vitalidade do crescimento de uma cultura. Síntese de produtos intracelulares, acúmulo de lipídios em algas e formação corporal de inclusão em bactérias, entre outras, estão relacionados com o tamanho celular também. Aglomeração celular pode ser outro fator que vale a pena investigar como resumido recentemente².

As heterogeneidades populacionais podem ser quantificadas com base em características morfológicas das células individuais. Estudos mostraram que a heterogeneidade dentro de uma cultura pode ser significativa, por exemplo,condições de produção em larga escala³ o rendimento global pode ser afetado por um baixo desempenho de subpopulações⁴.

Normalmente, a avaliação das características morfológicas das células é realizada por amostragem manual ou com uma câmara de fluxo de passagem acoplada a um dispositivo foto-óptico. Isso leva a várias restrições: a quantidade limitada de dados adquiridos dificilmente pode fornecer medições estatisticamente confiáveis; o atraso de tempo entre a amostragem e a acessibilidade dos resultados pode ser muito longo em comparação com a dinâmica do processo; e mais importante, o procedimento de amostragem (localização da porta de amostragem, pré-tratamento da amostra antes da medição, condições desfavoráveis no tubo de amostragem ou bypass) pode desencadear um erro tendencioso, pois o procedimento de amostra em si já pode afetar a célula Morfologia. Finalmente, existe sempre um alto risco de contaminação durante a amostragem ou em soluções de passagem suplementar, se eles não são esterilizáveis no lugar.

A aplicação da microscopia in situ (ISM) pode contornar vários desses problemas. Se as células forem detectadas automaticamente, uma identificação correta de suas características morfológicas pode ser pesquisada^5. Até agora, as principais limitações deste método eram (i) o tempo de avaliação das imagens, que era muito longa para aplicações in situ, e (ii) a má resolução de imagens, especialmente em altas densidades celulares. Embora as primeiras soluções do ISM incluíssem amostragem mecânica, diluição da sonda, ou foram restritas a um sistema de passagem suplementar^6,7,outras abordagens permitem a captura da suspensão celular diretamente⁸.

Os recentes avanços no ISM permitem o monitoramento em linha ou on-line das células em uma base unicelular, o que fornece a distribuição de parâmetros morfológicos em tempo real diretamente em suspensões celulares em concentrações de células consideravelmente altas. Através de análises off-line dos parâmetros-chave das células, correlações com informações fornecidas pela detecção automatizada de células acoplada e ISM podem ser identificadas. Em seguida, novos projetos de sensores macios são alcançados, nos quais um parâmetro incomensurável é estimado com a morfologia unicelular.

Neste relatório, o ISM é conduzido acoplásse uma sonda foto-óptica a uma análise de imagem automatizada. O ISM consiste em uma sonda de sensor de haste única que permite a captura de imagens dentro de uma faixa de foco conhecida em uma lacuna de medição ajustável com uma câmera CCD de alta resolução [MM-Ho = CCD GT2750 (2750×2200) e MM 2.1 = CMOS G507c (2464×2056)]. A iluminação da luz flash é conduzida pela transmissão. Portanto, a luz se origina do lado oposto da câmera⁹ e sua intensidade pode ser ajustada. As células passam continuamente por essa lacuna com o fluxo líquido. Assim, uma população representativa da amostra é obtida. A sonda pode ser montada diretamente para o biorreator para que ele atinja a suspensão celular, ou pode ser usado em um desvio estéril. A casca do sensor é conectada ao sistema antes da esterilização, as peças ópticas são montadas mais tarde no escudo.

Até agora, os microorganismos industriais relevantes, por exemplo,fungos filamentosos (diâmetro de até mais de 200 μm), as microalgas heterotróficas Crypthecodinium cohnii (diâmetro médio celular de 20 μm), e o fermento Saccharomyces cerevisiae (diâmetro médio celular de 5 μm), foram investigados com este ou dispositivos similares, o que é mal descrito.

Fungos filamentosos tendem a formar pelotas certas condições de cultivo. Estes são de um tamanho de até várias centenas de μm. A híha das células fúngicas desenvolve diferentes comprimentos na dependência do estresse hidrodinâmico na fase de fluido. Isso tem uma influência sobre a atividade metabólica e de crescimento, captação de substratos e liberação de produtos. O ISM foi aplicado para identificar a distribuição do tamanho da pelota e a largura das zonas de menor densidade de biomassa nas bordas das pelotas (dados não publicados próprios).

O tamanho de C. cohnii altera entre 15 e 26 μm quando as células acumulam o ácido graxo poliinsaturado ácido graxo ácido docosahexaenóico (DHA) limitação de nitrogênio. Este processo de produção de DHA biotecnológico consiste em duas partes, a fase de crescimento, em que as células se dividem e se tornam menores, e a fase de produção, na qual as células acumulam o produto e, assim, tornam-se maiores. Portanto, o tamanho da célula foi usado para determinar o estado do processo, no qual o crescimento ou a produção de DHA foram favoráveis. Finalmente, uma correlação entre o tamanho da célula e o conteúdo dha foi encontrada. Neste caso, o ISM permite monitorar o acúmulo intracelular de DHA em tempo real sem a exigência de amostragem, interrupção celular e a análise de cromatografia a gás comum^10.

O fermento de brotamento é geralmente de um tamanho entre 3 e 8 μm. A proporção de células que estão no estado de maturação de cada vez, conforme descrito com o índice de brotamento (BI), fornece informações sobre a vitalidade de crescimento^11,12, e até mesmo uma relação com a secreção de proteína recombinante foi comprovada¹³. Com a ajuda do ISM, as células de levedura em ascensão e não brotamento (células com e sem um broto) foram distinguidas¹⁴. As condições de estresse também podem levar a uma variação mais ampla do tamanho da célula dentro de uma população de levedura, como recentemente mostrado em cultivos em escala para baixo, em que as condições de cultivos em lote alimentado em grande escala limitados por nutrientes foram imitadas^3.

Portanto, o ISM tem o potencial de monitorar a vitalidade do crescimento e a formação de produtos em um nível unicelular durante todas as etapas de um bioprocesso para a identificação de condições ideais de cultivo, ou para fins de controle de processos. Os métodos descritos aqui estão focados em aplicações microbianas com células únicas, mas também são aplicáveis a partículas maiores, como células humanas e animais, aglomeradas celulares e pelotas de organismos filamentosos.

Protocol

NOTA: Os seguintes passos são necessários para adaptar os parâmetros às respectivas condições de microrganismos e cultura. O ajuste das configurações da sonda dura cerca de 20 min para um usuário experiente. Uma descrição detalhada das ferramentas e etapas é dada no manual correspondente da ponta de prova de SOPAT GmbH. Em geral, são necessárias as ferramentas que são apresentadas no seguinte protocolo: (i) Controlador de sonda para ajustes de sonda e aquisição de imagem; (ii) Fiji (ImageJ)<…

Representative Results

A detecção do tamanho da pilha em culturas do fermento com o ISM e a deteção automatizada da imagem para distinguir entre pilhas de brotamento e non-budding foi conduzida com sucesso. Tanto a intensidade do stroboscope quanto a escolha da lacuna de medição têm uma gama de tolerância, na qual a identificação de partículas não é afetada. Por exemplo, as células de S. cerevisiae foram medidas com várias intensidades de estóscópio dentro de uma faixa de variação de…

Discussion

O ISM apresentado aqui com os mesmos ou dispositivos muito semelhantes foi usado para medir a dinâmica morfológica de fungos, microalgas e células de levedura, o que possibilitou a determinação da atividade de crescimento e, em caso de algas, acúmulo de produtos intracelulares. O sensor não tem peças móveis e é diretamente aplicável em qualquer biorreator de tanque mexido padrão, seja através de uma porta padrão ou em um desvio estéril. Desde que o fermento é muito menor do que algas, a redução no taman…

Materials

Sensor MM 2.1 – MFC	SOPAT GmbH, Germany	n.a.	Inline Monocular Microscopic probe Version 2.1 with a Mirco Flow Cell
Sofware version v1R.003.0092	SOPAT GmbH, Germany	n.a.
Thickness gauge	n.n.		It can be any supplier, DIN 2275:2014-03
Ethanol 70%	n.n.		It can be any supplier
SOPAT manual Version 2.0.5	SOPAT GmbH, Germany
Optical lense paper	VWR	470150-460
Fiji, ImageJ	open source
50 mL conical centrifuge tubes			It can be any supplier