Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

في فيفو نانوفيكتور إيصال اسفنجة ميكرورنا الخاصة بالقلب

Published: June 15, 2018 doi: 10.3791/57845
Automatic Translation
1, 2, 2
1Princess Margaret Cancer Centre, University of Toronto, 2Department of Pathology, Department of Cardiology, Johns Hopkins University

Summary

تثبيط microRNA الأنسجة على حدة هي تكنولوجيا التي متخلفة في ميدان ميكرورنا. هنا، نحن وصف بروتوكول لتمنع الأسرة microRNA مير-181 في خلايا ميوبلاست بنجاح من القلب. تستخدم تكنولوجيا نانوفيكتور لتسليم ميكرورنا الأسفنج الذي يوضح هامة في فيفو الخاصة بأمراض القلب مير-181 الأسرة تثبيط.

Abstract

ميكرورنا (ميرنا) الصغيرة غير الترميز الجيش الملكي النيبالي الذي يحول دون التعبير بوستترانسكريبشونال رسول من الحمض النووي الريبي (مرناً). الأمراض التي تصيب الإنسان، مثل السرطان وأمراض القلب والأوعية الدموية، أظهرت لتنشيط الأنسجة و/أو التعبير ميرنا الخلية المحددة المرتبطة بتطور المرض. تثبيط التعبير ميرنا يوفر إمكانيات تدخل علاجي. بيد أن النهج التقليدي تمنع ميرناس، توظيف النوكليوتيد أنتاجومير، تؤثر على مهام محددة ميرنا عند التسليم العالمية. وهنا، نقدم بروتوكول لتثبيط القلب على حدة في فيفو الأسرة مير-181 في نموذج الفئران. بناء ميرنا-الأسفنج يهدف إلى تشمل 10 ربط مكافحة مير-181 المتكررة متواليات. هو استنساخ المروج الخاصة بأمراض القلب α-MHC إلى العمود الفقري بيجفب محرك التعبير الخاصة بأمراض القلب مير-181 ميرنا-الأسفنج. لإنشاء خلية مستقرة transfected مع بناء α-MHC-EGFP-miR-181-sponge خط معربا عن مير-181-الأسفنج، ميوبلاست H9c2 الخلايا ومفروزة حسب الأسفار تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) في التجارة والنقل الإيجابي H9c2 الخلايا التي تستزرع مع النيوميسين (G418). في أعقاب النمو المستقر في النيوميسين، تحدد السكان خلية [مونوكلونل] إضافية نظام مراقبة الأصول الميدانية واستنساخ خلية مفردة. الخلايا H9c2-مير-181-الأسفنج-التجارة والنقل ميوبلاست الناتجة عن معرض فقدان وظيفة مير-181 أفراد الأسرة كما قيمت من خلال التعبير زيادة البروتينات المستهدفة مير-181 ومقارنة مع الخلايا H9c2 الإعراب عن الأسفنج تدافع غير وظيفية. وبالإضافة إلى ذلك، علينا تطوير نانوفيكتور لتقديم منهجية بناء مير-181-الأسفنج قبل إلى إيجابيا يحمل جسيمات نانوية الاسمافرون واتهم سلبا والبلازميدات مير-181-الأسفنج. في فيفو تصوير للتجارة والنقل يكشف عن أن حقن الوريد ذيل متعددة من نانوفيكتور على مدى فترة ثلاثة أسابيع قادرة على تعزيز تعبير عن مير-181-الأسفنج بشكل كبير بطريقة خاصة بأمراض القلب. الأهم من ذلك، لوحظ فقدان وظيفة مير-181 في أنسجة القلب ولكن ليس في الكلي أو الكبد. ميرنا-الأسفنج وسيلة قوية تمنع التعبير ميرنا الأنسجة على حدة. يقود التعبير ميرنا-الأسفنج من مروج الأنسجة على حدة ويوفر خصوصية لتثبيط ميرنا، الذي يمكن أن يقتصر على جهاز أو الأنسجة المستهدفة. وعلاوة على ذلك، الجمع بين التكنولوجيات نانوفيكتور والإسفنج ميرنا تصاريح الإنجاز الفعال وميرنا الأنسجة على حدة تثبيط في فيفو.

Introduction

على مدى العقدين الماضيين، كانت هناك العديد من الدراسات التي أشارت إلى أهمية دور ميرناس في الأمراض التي تصيب البشر. وتبين النتائج من مجموعة كبيرة من المؤلفات لا ينكر أهمية ميرناس في الفسيولوجيا المرضية للأمراض، مثل1 من السرطان وأمراض القلب والأوعية الدموية2،3،،من45. على سبيل المثال، مير-21 أوبريجولاتيد في العديد من أنواع السرطان، أدى زيادة دورة الخلية والخلية انتشار6. عدوى التهاب الكبد الوبائي، مير-122 دوراً هاما في النسخ المتماثل من فيروس7، وقد ثبت أن تثبيط مير-122 إنقاص الحمولة الفيروسية8. في تضخم القلب، مير-212/132 أوبريجولاتيد في القلب وهو يشارك في النمط الظاهري المرضية9. الأهمية الواضحة downregulation أو تثبيط الوظيفية ميرنا upregulated يشير إلى الفرص لاستغلال علاجية بيولوجيا ميرنا في تقريبا جميع الأمراض.

تم العثور على أربعة أفراد الأسرة مير-181، مير-181a/ب/ج/د، في ثلاثة مواقع الجينوم في الجينوم البشري. ترميز المنطقة إينترونيك الجينات المضيفة الحمض النووي الريبي غير الترميز (MIR181A1-HG) الكتلة مير-181--ب-1. ترميز المنطقة إينترونيك من الجينات NR6A1 مير-181-/ب-2. الكتلة مير-181-c/d يقع في نسخة أونتشاراكتيريزيد على كروموسوم 19. مشاركة جميع أفراد الأسرة مير-181 نفس تسلسل "البذور" ويمكن أن يحتمل أن تنظم جميع أفراد الأسرة الأربعة مير-181 نفس الأهداف مرناً.

نحن3،4 وغيرها10 أبرزت أهمية مير-181 أفراد الأسرة أثناء فشل القلب نهاية مرحلة. وقد اعترفنا أيضا أن upregulation مير-181 ج يحدث تحت الظروف المرضية المرتبطة زيادة خطر الإصابة بأمراض القلب، مثل النوع الثاني من السكري والسمنة والشيخوخة3،،من45. وقد تم افترض أن overexpression من مير-181 ج يسبب الأكسدة مما يؤدي إلى الخلل في القلب4.

العديد من المجموعات قد اقترح أن ميرنا موجودة في الميتوكوندريا11،12،،من1314، إلا أننا كنا الأول من إثبات أن 181 ج-مير مشتق من الجينوم النووي، معالجة، و وفي وقت لاحق ذوبانها إلى الميتوكوندريا في ال RISC3. وعلاوة على ذلك، اكتشفنا تعبير منخفضة مير-181a و 181b مير في حجرة المتقدرية القلب5. الأهم من ذلك، وجدنا أن 181 ج-مير تقمع التعبير مرناً COX1 طن متري، مدللة بذلك على أن ميرناس المشاركة في تنظيم الجينات mitochondrial وتغيير الوظيفة المتقدرية3،4.

تتناول هذه المقالة المنهجية اللازمة لتصميم ميرنا اسفنجة نهدم أسرة مير-181 في cardiomyocytes. وعلاوة على ذلك، فإننا مخطط بروتوكول للتطبيق في فيفو مير-181-الأسفنج.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وافق جميع الإجراءات التجريبية برعاية الحيوان المؤسسية ولجنة جامعة جونز هوبكنز في الاستخدام.

1-الأسفنج التصميم

  1. ميكرورنا ملزمة 3 ' UTR
    ملاحظة: A ميرنا وظائف عن طريق التفاعلات الأقران قاعدة محددة مع مواقع مكملة جزئيا في 3 ' غير مترجمة المنطقة (UTR) مرناس المستهدف به (لإجراء استعراض شامل، انظر Bartel)15.
    1. تصميم مثبطات التعبير ميرنا النوكليوتيد التي تحتوي على التكامل الكبير لتسلسل ميرنا. تنحية ميرنا في اليغنوكليوتيد معقدة عن طريق إقران قاعدة واسعة لمنع الدالة ميرنا.
  2. تصميم الأسفنج ميرنا
    1. تانديملي صفت تصميم تسلسل ميرنا جزئيا مكملة تشمل انتفاخ في الموضع المشقوق عادة من 2 أرجوناوتي. يتم وضع الإنتفاخ في النيوكليوتيدات 9-12 من تسلسل ميرنا ناضجة لمنع أي تدخل الجيش الملكي النيبالي نوع الانقسام والتدهور من الأسفنج.
    2. إذا رغبت في ذلك، تصميم التسلسل شرك المستهدفة لربط جميع أفراد الأسرة مير-181. بناء على دراسة ومقارنة التسلسلات ميرنا الأسرة مير-181، إيجاد تسلسل مشتركة في 5 '--الجانب الثغرة التي تحتوي على 8 النيوكليوتيدات متتالية، أو إيجاد تسلسل مشتركة بين جميع أفراد الأسرة 4 مير-181 3' جانب من الإنتفاخ 8 إضافية النيوكليوتيدات على التوالي. وتمثل هذه التسلسلات 2 مواقع الربط النصف الأيسر والأيمن، على التوالي.
      ملاحظة: تسلسل شرك صفيف جنبا إلى جنب لمواقع الربط النصف الأيسر والأيمن مفصولة بفاصل GGA. الربط بين التسلسل 5 '-نهاية وتسلسل 3'--الجانب (كما هو موضح في الخطوة 1.2.2) مع فاصل GGA تهدف إلى خلق الإنتفاخ عند تعتيق لميرنا (كما هو موضح في الخطوة 1.2.1). كرر هذا الموقع ملزم ميرنا 1 10 x في بناء النهائي مير-الأسفنج.
  3. اعتبارات أخرى الأسفنج ميرنا
    ملاحظة: من أجل استنساخ تسلسل الأسفنج في ناقلات التعبير المستفيدة، يجب أن يكون تقييد نوكلاس الاعتراف بالمواقع المضمنة في كل نهاية من التسلسل. تحليل هضم في السيليكون ينبغي أن تستخدمها لتأكيد الانقسام غير محددة في التسلسل الأسفنج إنزيمات التقييد الذي تم اختياره وانزيمات التقييد الأخرى المستخدمة في تطبيقات الاستنساخ المتلقين للمعلومات.
    1. إضافة كودون وقف مزدوجة (ﻷعمالهم ﻷعمالهم) في 5 '-نهاية الاصطناعية 3' UTR، مثل أن تسلسل مير-181-الأسفنج ليس جزءا من التسلسل الترميز من أجل تعزيز بروتين فلورية خضراء (اجفب).
  4. توليف للاسفنج الحمض النووي لاستنساخ
    1. استخدام المزج الحمض النووي أو تستخدم مصدر متاح تجارياً لتجميع تسلسل الأسفنج ميرنا النهائي مع تقييد نوكلاس الاعتراف بالمواقع للاستنساخ. يتم شحنها الأسفنج على بلازميد التي يمكن أن تحتوي على علامات الاختيار لتضخيم في البكتيريا. علاوة على ذلك، يمكن تضخيمه عن طريق البلمرة المتسلسل (PCR) لاستنساخ الأسفنج أو ببساطة تسربوا الموجه المانحة استخدام مواقع التقييد هو موضح في الخطوة 1، 3 (انظر أيضا الخطوة 3.1).

2-استنساخ متجهة المستفيدة تشمل مروج الأنسجة على حدة

ملاحظة: استخدام ناقل بيجفب-C1 كناقل المتلقية للكاسيت التعبير من الأسفنج ميرنا. ناقل بيجفب-C1 يحتوي على إطار قراءة اجفب دافع مروج الفيروس المضخم للخلايا (CMV). مروج CMV نشطاً مؤثرا في خلايا الثدييات. إذا كان مطلوباً مروج الأنسجة على حدة، يمكن إزالة المروج CMV بهضم الإنزيمات AseI وني (راجع الخطوة 2، 1). بلازميد يحتوي على واسعة متعددة الاستنساخ موقع (MCS) فضلا عن كاناميسين (أساسه) وعلامات النيوميسين (G418) لتحديد في البكتيريا وتعبير مستقر في خلايا الثدييات، على التوالي.

  1. إزالة المروج CMV من بيجفب-C1
    1. جعل 50 ميكروليتر من رد فعل الهضم يحتوي على 1 × العازلة هضم المتاحة تجارياً اقترح بتصنيع إنزيمات تقييد استخدامها، 5 ميكروغرام من بلازميد الحمض النووي (في المياه)، وميكروليتر 5 كل من الإنزيمات AseI وني. إضافة كافة مكونات إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي ومزجها بلطف بالتحريك هو. تدور أنبوب لمدة 10 ق في ميكروسينتريفوجي لجمع ردود فعل في الجزء السفلي. تبني رد الفعل في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    2. تنقية بلازميد خطية هضمها. إضافة 5 × حجم المخزن المؤقت لربط العمود (مزيج ملكية من المخزن المؤقت ملزم المناسبة لتصنيع الأعمدة تنقية الحمض النووي المستخدمة) رد فعل وتنقية رد فعل مع عمود تنقية الحمض النووي كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة. الوت مع 25 ميكروليتر من شطف المخزن المؤقت (المياه) أضيف بعناية إلى مركز العمود.
    3. هلام تنقية بلازميد هضمها على 0.5% [اغروس] هلام كما يلي: إضافة 5 ميكروليتر من تحميل المخزن المؤقت (50% والغليسيرول-3 × تحميل صبغ) إلى بلازميد التيد. تحميل نموذج كامل في 1 جيدا على 0.5% [اغروس] هلام. وتشمل أي ممر منفصل مع 500 نانوغرام ناقل غير المصقول. تشغيله لمدة 30-40 دقيقة حتى يتحقق فصل بين والبلازميدات قص وتقطيعه.
    4. تنقية بلازميد خطية على النحو التالي: تصور الحمض النووي في [اغروس] هلام على مربع ضوء الأشعة فوق البنفسجية. مع شفرة حلاقة نظيفة، بعناية المكوس الفرقة تناظر بلازميد الخطي.
      ملاحظة: بلازميد الخطي ينبغي تشغيل أقل من بلازميد تقطيعه وستظهر كعصابة واحدة في حوالي 4.2 كيلوبايت. مروج CMV قصت ستظهر كفاتح في حوالي 500 النيوكليوتيدات (nt).
    5. استخراج الحمض النووي من جل شريحة باستخدام مجموعة أدوات متوفرة تجارياً والوت الحمض النووي من العمود مع 25 ميكروليتر من المياه.
  2. الاستنساخ مروج القلب على حدة في بيجفب-C1
    ملاحظة: مروج السلسلة الثقيلة الميوسين ألفا (α-MHC) تم سابقا تتميز وتوجيه مستويات قوية التعبير مقيدة بالقلب كما هو موضح في مولكينتين وجوبي ماركهام التالية16. تصف المقاطع التالية كيفية تضخيم المروج للناقل للاستنساخ.
    1. استنساخ المروج α-MHC بين عناصر +420 إلى-2934 بالنسبة للموقع ابدأ النسخ إلى بلازميد p4016 بأول تصميم كبسولة تفجير بكر أن الجناح هذه المنطقة، ومن ثم بلازميد كقالب لبكر. تضخيم منطقة المروج باستخدام PCR سبق وصفها كبسولة تفجير5. إلى الأمام وعكس [بكر] كبسولة تفجير تحتوي على تسلسلات التداخل إلى نهايات هضمها بيجفب-C1 (الخطوة 2، 1) للسماح باستنساخ الموجهة في الانصهار. راجع الدليل في الانصهار للحصول على توضيح شامل للتصميم التمهيدي للانصهار في الاستنساخ. تم العثور على تسلسل التمهيدي في الجدول 1.
    2. إعداد رد بكر 50 ميكروليتر، الذي يحتوي على 1 ميكرومتر كل التمهيدي و 10 نانوغرام قالب الحمض النووي. إضافة قدر مناسب من إنزيم بكر ودنتبس اعتماداً على تصنيع الكواشف PCR المختار. إجراء PCR على كتلة الحمض النووي ركوب قياسية. أداء 98 درجة مئوية يشوه خطوة، تليها دورات 35 من يشوه، والصلب، وملحق ل 5 و 30، و 120 دقيقة 3 s كل منهما، على التوالي. يتضمن ملحق نهائي من 10 دقيقة عند 72 درجة مئوية.
    3. تنظيف استخراج بكر وجل. عند انتهاء دورة PCR، إضافة 5 × حجم المخزن المؤقت ربط عمود رد فعل إلى رد فعل بكر وتنقية أنه مع عمود تنقية الحمض النووي كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة. الوت المخلوط مع 25 ميكروليتر من شطف المخزن المؤقت (المياه) أضيف بعناية إلى مركز العمود.
      1. إضافة 5 ميكروليتر من تحميل المخزن المؤقت [50% والغليسيرول (3 x) تحميل صبغ] إلى بلازميد التيد. تحميل نموذج كامل في 1 في 1% [اغروس] هلام. تشغيله لمدة 30-40 دقيقة؛ تصور والمكوس المنتج بكر كما هو موضح أعلاه (الخطوة 2.1.5).
    4. اضطر المروج α-MHC مع بيجفب-C1 كما يلي: إضافة رد فعل ربط 10 ميكروليتر الذي يحتوي على 1 × المخزن المؤقت لربط المتاحة تجارياً، 2 ميكروليتر من بكر المنقي وميكروليتر 1 ناقل خطية. القيام ربط عند 50 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة وتبرد ثم أنه على الجليد.
    5. إجراء تحول البكتيري كما يلي: ترانسفيكت 50 ميكروليتر من "الخلايا المختصة" مع ميكروليتر 2.5-الانصهار ربط المزيج بإضافة المكونات. الراحة في ايبندورف الأنبوبة على الجليد مدة 20 دقيقة، وضعه في حمام مائي 42 درجة مئوية 40 ثانية، والمكان ثم الأنبوبة على الجليد لمدة 2 دقيقة.
      1. بعد التحويل، وإضافة 350 ميكروليتر من وسائل الإعلام في شركة نفط الجنوب وتنمو خلايا في 37 درجة مئوية ميكروليتر 45 دقيقة 200 لوحة من ثمرة حل في ألواح رطل مع "أداء شخص" مستعمرة PCR لتحديد مقاومة كان الخلايا التي تحتوي على ربط المروج α-MHC.
        ملاحظة: صممت الإشعال الفرز إلى بكر عبر تقاطع عملية ربط.
    6. قم بتوسيع المستنسخين PCR إيجابيا في مرق أساسه رطل ووالبلازميدات تنقية استخدام بروتوكولات تنقية بلازميد الإعدادية المصغرة القياسية كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة.

3-استنساخ الاسفنجة

  1. هضم ناقلات المستفيدة
    1. عمل بلازميد α-MHC-بيجفب الخطي للاستنساخ مع اكوري وكبني، وتنقية الجل كما هو موضح أعلاه (الخطوة 2، 1).
  2. [بكر] تضخيم وهضم الأسفنج الحمض النووي
    1. استخدام التدافع 284-nt-منذ فترة طويلة مير-181-الأسفنج والمقابلة لبكر شحن ناقلات كالقالب. تضخيم المنطقة الأسفنج باستخدام وصفه سابقا [بكر] كبسولة تفجير5. علما أن الأمام وعكس [بكر] كبسولة تفجير تحتوي على تسلسلات إنزيم التقييد تسمح بربط إلى α-MHC-بيجفب-C1. تنفيذ بكر كما هو موضح أعلاه (الخطوة 2.2.2). تنقية منتجات PCR قبل الهضم كما وصف (الخطوة 2.2.3) والتيد لهم مع الماء الهضم. للحصول على تسلسلات التمهيدي، راجع الجدول 1-
    2. هضم الأسفنج الحمض النووي لربط. يتضمن رد فعل هضم 50 ميكروليتر 1 × هضم المخزن المؤقت ورد بكر جل تنقيته من الخطوة 3.2.1 5 ميكروليتر من الإنزيمات اكوري وكبني. إضافة كافة مكونات إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي ومزجها بلطف بالتحريك هو. تدور أنبوب لمدة 10 ق في ميكروسينتريفوجي لجمع ردود فعل في الجزء السفلي. تبني رد الفعل في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    3. تنقية هضمها PCR الأسفنج باستخدام عمود تنظيف بكر كما هو موضح سابقا (الخطوة 2.2.1).
  3. سد مير-181-الأسفنج إلى ناقل α-MHC-بيجفب-C1
    1. إعداد رد فعل ربط ميكروليتر 21 الذي يحتوي على المخزن المؤقت لربط x 1، 3 ميكروليتر من هضمها وتنقيته بكر مير-181-الأسفنج وميكروليتر 1 خطية α-MHC-بيجفب-C1 ناقل العازلة الحمض الخلوي الصبغي x 1 1 ميكروليتر من ليجاسى الحمض النووي. القيام عملية ربط في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق وثم وضعه على الجليد.
    2. تحويل 50 ميكروليتر من الخلايا المختصة XL1-أزرق مع 2 ميكروليتر من مزيج ربط. استخدام التحويل وتصفيح البروتوكولات كما هو موضح أعلاه (الخطوة 2.2.5). أداء مستعمرة PCR لتحديد أساسه مقاومة البكتيريا التي تحتوي على تسلسل α-MHC-pEGFP-miR-181-sponge الصحيح. تصميم كبسولة تفجير الفحص لبكر عبر تقاطع عملية ربط. انظر الجدول 1 لمتواليات التمهيدي.
    3. تضخيم وتسلسل الناقل. قم بتوسيع المستنسخين PCR إيجابيا في مرق أساسه رطل ووالبلازميدات تنقية استخدام بروتوكولات تنقية بلازميد الإعدادية المصغرة القياسية. إجراء تسلسل الحمض النووي التحقق من بلازميد معربا عن تسلسل الحمض النووي المطلوب.

4-جيل H9c2 مستقرة مير-181-الأسفنج "معربا عن" الخلايا

  1. النمو والمحافظة على خلايا H9c2
    1. الثقافة H9c2 الخلايا في المتوسطة (دميم "تعديل النسر" دولبيكو) التي تحتوي على مصل بقرى الجنين (FBS) بتركيز نهائي 10%. الثقافة الفرعية الخلايا باستخدام البروتوكولات القياسية وتنمو لهم في 37 درجة مئوية في 5% ثاني أكسيد الكربون.
  2. تعداء واختيار H9c2 α-MHC-pEGFP-C1-miR-181-sponge الإعراب عن الخلايا
    1. نفذ انهانسر خلايا H9c2 الحصول على أفضل النتائج. ترانسفيكت الفئران ميوبلاستس (H9c2) مع اسفنجة تدافع (تسلسل يتبارى 284-nt-لونغ الذي يحل محل مير-181-الأسفنج-التسلسل) أو في بناء α-MHC-pEGFP-miR-181-sponge مع اليكتروبوراتور.
      1. باختصار، ترانسفيكت 4 × 10-5 خلايا مع 2 ميكروغرام من بلازميد الحمض النووي (في 5 ميليلتر من ح2س) و 100 ميليلتر للتوصل إلى حل متوافق مع الجهاز انهانسر. باستخدام برنامج انهانسر س-120 للخلايا H9c2 ترانسفيكت.
      2. احتضان transfected خلايا ومبومو لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إضافة 500 ميليلتر من دميم ومبومو مباشرة. بلطف نقل المحتوى ومبومو المجموع إلى بئر للوحة 6-جيدا.
    2. حدد الخلايا إيجابية بروتينات فلورية خضراء بعد تعداء بعد 48 ساعة من نظام مراقبة الأصول الميدانية. لوحة الخلايا فقط أعربت عن التجارة والنقل في لوحة 6-جيدا مع إضافة النيوميسين (G418) (400ng/mL) إلى وسائط النمو الكامل.
      ملاحظة: قبل اختيار G418، ينبغي إنشاء منحنى قتل لتحديد مقدار النيوميسين المطلوبة للتحديد. للخلايا H9c2، 400 نانوغرام/مل من G418 أدى معدل الوفيات حوالي 80% من غير بلازميد transfected الخلايا H9c2 بعد 24 ساعة، واعتبر أن تركيز العمل المطلوب من G418 لهذه الخلايا. واعتبر خط الخلية مستقرة بعد أن استمر النمو في G418 لمدة 16 يوما.
    3. تنفيذ نظام مراقبة الأصول الميدانية فرز الخلايا G418 مستقرة باستخدام التعبير عن التجارة والنقل كعلامة لتحديد إيجابي الأسفنج. البذور 5-10 خلايا في كل من لوحة 96-جيدا جيدا بفرز التدفق. توسيع نطاق الخلايا [مونوكلونل] من لوحة 96-جيدا للوحات 24-جيدا على مدى عدة مقاطع. استخدام الثلاجة مخزون الخلايا من مرور 3 (P3) الخلايا كنقطة انطلاق للتجارب اللاحقة.
    4. إجراء جميع التجارب المستندة إلى خط الخلية مع خلايا المرور منخفضة بين P5 و P10.

5-تجميع وتنقية من الأسفنج-جسيمات نانوية (مير-181-الأسفنج جسيمات نانوية)

  1. إعداد جسيمات نانوية الاسمافرون بتذويب الأيوني أمفيفيلي (دوتاب) والمشارك الدهون والكولسترول ودسب-شماعة-OMe، في نسبة مم 5:5:0.1، على التوالي، في خليط من كلوروفورم والميثانول في قنينة زجاج.
  2. إزالة المذيبات العضوية في 44-45 درجة مئوية، وتحت فراغ باستخدام مبخر دوارة، تليها لطيف تدفق النيتروجين خالية من الرطوبة. يبقى الفيلم المجففة المتبقية من الدهون تحت فراغ عالية ح 8.
  3. إعداد خليط بإضافة الجلوكوز 5% للفيلم المجففة فراغ الدهن. ترك بين عشية وضحاها للسماح لهذا الخليط هيدرات الفيلم. دوامة القنينة لمدة 2 إلى 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة من أجل إنتاج الحويصلات مولتيلاميلار مع تهز عرضية في حمام مائي 45 درجة مئوية.
    1. Sonicate الحويصلات مولتيلاميلار لإعداد الحويصلات أونيلاميلار الصغيرة في حمام الثلج لمدة 3-4 دقيقة حتى يمكن ملاحظة الوضوح، في حلقة عمل 100% و 25 ث إنتاج الطاقة.
  4. مزيج يتبارى تسلسل أو تسلسل مير-181-الأسفنج المستنسخة في ناقلات pEGFP(α-MHC) والحويصليه على أساس نسبة 1:3 تهمة تشكيل نانوفيكتور4.
    ملاحظة: مجمع كهرباء من جسيمات نانوية الاسمافرون مشحونة بشكل إيجابي ومشحونة سلبا على بلازميد الحمض النووي المعروف نانوفيكتور.

6-منهجية إيصال جسيمات نانوية الأسفنج والتحقق من آثار في فيفو

  1. تسليم النظامية من الأسفنج-جسيمات نانوية في الفئران
    1. استخدام الفئران سبراغ داولي (SD). حقن الفئران عن طريق الوريد مع نانوفيكتور مير-181-الأسفنج أو التدافع نانوفيكتور عن طريق الوريد الذيل. استخدام SD ذكور الفئران، وحوالي 200 جرام في وزن الجسم.
    2. إجراء حقن الوريد ذيل باستخدام جرعة 4 ملغ نانوفيكتور/كغ من وزن الجسم، وكرر هذه العملية باستخدام نظام 6 حقن الوريد الذيل أكثر من 2 أسابيع. وعقب تسليم نانوفيكتور المتكررة، يسمح بفترة مدتها أسبوع واحد (أيام 15-21) للتعبير عن المتجهات فيفو.
    3. تأكيد التحسين بالتصوير إشارة بروتينات فلورية خضراء قبل وأثناء وبعد الولادة نانوفيكتور. تحليل الإشارات بروتينات فلورية خضراء ببرامج التصوير تمجربهك، الذي يقوم بإنشاء بيانات شبه كمي.
  2. التحقق من الصحة في فيفو إعاقة مير-181 من مير-181-الاسفنجة
    1. أداء لطخة غربية بغية التدليل على التعبير عن مير-181-الأسفنج الوظيفية في أنسجة القلب.
      ملاحظة: لهذه الدراسة، تم فحص التعبير COX1 طن متري.
  3. الآثار الفنية في فيفو التعبير مير-181-الأسفنج في قلب
    1. القيام تخطيط صدى القلب ثنائي الأبعاد ووضع M ودوبلر أثناء وبعد الولادة نانوفيكتور لتحليل وظيفة القلب والتغييرات الشكلية. قدرة أفضل من مسح في قلوب القوارض، تستخدم نظام الموجات فوق الصوتية مزودة بمحول صفيف خطي 15 ميغاهيرتز.
    2. وقد تؤثر التخدير contractility القلب؛ لذلك، إجراء تسليم مير-181-الأسفنج نانوفيكتور أو نانوفيكتور التدافع إلى الحيوانات التي واعية ودون أي كاشف مخدر أثناء عملية تخطيط صدى القلب. يرجى الاطلاع على داس، وآخرون. 4 لمزيد من التوضيح.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في transfected ستابلي بيجفب-مير-181-الأسفنج-الإعراب عن H9c2 الخلايا (من الخطوة 4، 2)، انخفضت التعبير عن أسرة مير-181 (مير-181a، 181b مير، مير-181 ج ومير-181 د) كان معتدلاً بالنسبة إلى الخلايا H9c2 بيجفب-تدافعت-الإعراب عن. مير-181-الأسفنج بمثابة مثبط تنافسي لأسرة مير-181، حيث أننا نتوقع أن التعبير مير-181 ج المتقدرية استهداف الجين، mt-COX1، من شأنه أن يزيد. البيانات لطخة غربية تشير إلى أن التعبير COX1 طن متري قد زادت في الخلايا H9c2 بيجفب-مير-181-الأسفنج-الإعراب عن مقارنة بالخلايا H9c2 أعرب عن التدافع بيجفب. بالإضافة إلى ذلك، أية تغييرات التعبير ل COX2 مليون طن أو طن متري-COX3 تم تم الكشف عنها عن طريق إيمونوبلوت في الخلايا H9c2 بيجفب-مير-181-الأسفنج--وإذ يعرب عن. كنا α-tubulin كعنصر التحكم التطبيع لتحليل إيمونوبلوتينج. أساسا لوحظت إشارات التجارة والنقل في الكبد والكلى يصل إلى تسليم نانوفيكتور مير-الأسفنج (الشكل 1A) النظامية بعد أسبوعين. ومع ذلك، كان تعبير بروتينات فلورية خضراء أعلى بكثير في أنسجة القلب بعد 3 أسابيع الولادة نانوفيكتور مير-181-الأسفنج (الشكل 1A و 1B). من المذكرة، كان هناك إشارة بروتينات فلورية خضراء المكتشفة في نسيج الكبد في بعض الحيوانات 3 أسابيع بعد الولادة النظامية؛ غير أنه كانت هناك أية تأثيرات وظيفية من مير-181-الأسفنج في الكبد في تلك المرحلة الزمنية.

لطخة غربية أظهرت زيادة كبيرة في التعبير COX1 طن متري في الفئران حقن نانوفيكتور مير-181-الأسفنج مقارنة بالمجموعات التي يتبارى نانوفيكتور (الشكل 2). وتقترح COX1 طن متري أعلى هناك تعبير مير-181 ج أقل في القلب بعد 3 أسابيع الولادة نانوفيكتور مير-181-الأسفنج، كما COX1 طن متري هو الهدف المباشر مير-181 ج. كنا α-tubulin كعنصر التحكم التطبيع إيمونوبلوتس.

تخطيط صدى القلب أظهر أي تغيير في وظيفة القلب من الفئران حقن نانوفيكتور مير-181-الأسفنج قبل وأثناء وفي نهاية نظام العلاج، مقارنة بمجموعة نانوفيكتور التدافع للحيوانات.

Figure 1
رقم 1- في فيفو تحليل لتسليم نانوفيكتور مير-181-الأسفنج. (أ) هذا الفريق يظهر البروتوكولات الأمثل 3 أسابيع العلاج مع الحقن الوريدي 6 عن طريق الوريد الذيل. التلوين الأصفر في الصورة ابيفلوريسسينسي يوضح التعبير عن المتجهات بيجفب. ويلاحظ كثافة الحد الأقصى للتلوين الأصفر في الأسبوع 3 الوقت نقطة. بشكل انتقائي يعرب تسلسل المروج (ب) α-MHC في ناقلات بيجفب مير-181-الأسفنج أو تسلسل المجمعة في القلب في يوم 21. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2. التحقق من صحة أثر نانوفيكتور مير-181-الأسفنج على التعبير مير-181 ج. هذا هو تحليل لطخة غربية للتعبير COX1 طن متري في ليساتيس القلب التي تم الحصول عليها من التدافع بيجفب وبيجفب-مير-181-الأسفنج نانوفيكتور حقن الفئران. تم سبر كل قلب هوموجيناتيس مع الأجسام المضادة المشار إليها. ونحن α-tubulin عنصر تحكم تحميل. ويرد باند-قياس كثافة في شريط الرسم البياني أدناه. الطالب t-كان إجراء الاختبار، وكان رسم الخطأ القياسي في رسم بياني شريطي كأشرطة الخطأ. ف < 0.05 مقابل مجموعة بيجفب-التدافع. n = 4.

اسم الدليل التسلسل الخرائط المواضيعية وتلاحظ استخدام الهدف
SAM3-1F أتجكاتاجتاتاتجكت
جاكاكاكتجاكاتتكت		 58.4 مروج الفئران MHC لاستنساخ في اجفب بكر مروج MHC
SAM3-2R جاككجتاجكجكتاجكتج
أكتكاكتججاجاتجكت		 59.8 مروج الفئران MHC لاستنساخ في اجفب بكر مروج MHC
SAM3-3F كجاكجاككتاكاككجاكت 64 شاشة اجفب-F مستعمرة [بكر] استنساخ المروج الإيجابية
SAM3 4R كجكتاجتككتجاكككتكتج 63.9 شاشة MHC-R مستعمرة [بكر] استنساخ المروج الإيجابية
SAM5-1F ككتجتكتككاكاكاكاجك 59.3 مروج تسلسل MHC التسلسل مروج MHC
SAM5 2R كاجاكتجكاججكتجت 60 مروج تسلسل MHC التسلسل مروج MHC

الجدول 1. تسلسلات التمهيدي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هذه المقالة وصف التصميم وتوليف اسفنجة ميرنا وأظهر كيفية التعبير الخاصة بالانسجة من الأسفنج أداة قوية تمنع التعبير الأسرة ميرنا الأنسجة على حدة.

لقد أظهرنا أن يمكن استنساخ عائلة مير-181 استهداف الأسفنج إلى تعبير بلازميد مع مروج القلب على حدة. يمكن تعبئتها بلازميد كفاءة في جسيمات نانوفيكتور للتسليم على حد سواء في المختبر و في فيفو استخدام انهانسر أو حقن الوريد ذيل، على التوالي (الشكل 1). يمكن أن تمنع تعبير الخاصة بالقلب للأسرة مير-181 الأسفنج مير-181 ويمكن أن تؤثر على الجينات المستهدفة مير-181 (الشكل 2). بروتينات فلورية خضراء في بلازميد هي ميزة إضافية، التي يمكن تصور التسليم والتعبير بصورة نانوفيكتور دون التضحية بالحيوانات.

بإيجاز، اسفنجة ميرنا يتكون من سلسلة من تسلسلات العقاقير ميرنا بعد جين مراسل أن الأفعال كميرنا شرك استهداف مرناً. وبطبيعة الحال وجدت الأسفنج ميرنا التي تحدث التعبير عن اندوجينوسلي في النباتات والخلايا الحيوانية كفترة طويلة غير الترميز الكشف (لنكرناس)17. في هذه الدراسة، ونحن قد استخدمت نهجاً الأسفنج لتمنع أسرة مير-181 في القلب. على الرغم من أن النهج مير-181-الأسفنج أسلوب فسيولوجيا ذات صلة إلى دوونريجولاتي الأسرة مير-181 في الخلايا المستزرعة، طلبا في فيفو مير-181-الأسفنج يمكن أن تكون ضارة. على سبيل المثال، أظهرت العديد من الدراسات بدور حماية مير-181a و 181b مير في الخلية/أنسجة مختلفة الأنواع18،،من1920. ولذلك، ينبغي أن توجه التعبير مير-181-الأسفنج على وجه التحديد لانسجة القلب.

أظهرت لمنع الدالة ميرنا عن طريق الصلب إلى حبلا دليل ميرنا ناضجة النوكليوتيد الصغيرة ومنع تحميل سليم في مجمع إسكات المستحثة بالحمض النووي الريبي (RISC). مشكلة المقترنة مع هذا النهج أن النوكليوتيد التي ستلقى في تشبع جرعة كافية لمنع تجمعات خلوية من ميرناس ناضجة. النوكليوتيد تعاني أيضا من التحديات التي تشمل النقل عبر الأغشية الخلوية، واستقرار عام للجزيء. مبدع، قد تبين أن هدفا ميرنا مناشئ الموفر يمكن أن تعمل كشرك لما ميرنا المشابهة21. حكم عدة مواقع الربط المربوطة معا إلى زائفة 3 ' UTR بناء، الهدف شرك، أو ميرنا-الأسفنج، قادرة على التفاعل مع ميرناس هدف ستابلي وتنحية ميرنا في مجمعات ميكروريبونوكليوبروتين (ميرنبس)، وبالتالي فعالية منع الدالة ميرنا. ما يسمى "ميرنا-الأسفنج" عبارة عن تقنية إحساس بمكافحة فعالة، الذي يمكن كفاءة ميرنا دوونريجولاتي في المختبر و في فيفوعلى حد سواء. ولذلك، يمكن استخدام تطبيق اسفنجة ميرنا لدراسة ميرنا خسارة للدالة تعمل.

الفكرة القائلة بأن تدخل الجيش الملكي النيبالي ([رني]) يمكن أن يؤدي إلى فئة جديدة من العلاجات جذبت اهتمام العديد من المحققين فور اكتشافه. ميدان تطبيق [رني] المداواة انتقلت بسرعة كبيرة من مختبر إلى السرير. في الوقت الحاضر، المداواة ميرنا هو واحد من التدخلات العلاجية السريعة النمو في علم الأورام، وهو حاليا في مرحلة التجارب السريرية 1. النوكليوتيد العقاقير، أو أنتاجوميرس، واحدة من الأساليب الأكثر استخداماً ميرنا المثبطة. ماجستير et al. 22 تستخدم أنتاجومير مير-10b، على حد سواء في المختبر و في فيفو، لإسكات أوبريجولاتيد مير-10b في الأورام صلبة.

في فيفو، يتطلب كفاءة تكميم أفواه ميرناس أوبريجولاتيد تعديل أنتاجوميرس تحسين تقارب ملزم، وبيوستابيليتي، وخصائص الحرائك الدوائية كيميائية. زيادة الاتجاه ذوبان درجة الحرارة (Tm) وتحسين مقاومة نوكلياسي أنتاجوميرس، يمكن إجراء التعديلات الكيميائية، مثل 2 '-O-ميثيل (2'-O-لي) و 2 '2'-O-ميثوكسييثيل (2 '-وزارة التربية والتعليم)-مخفضات (تربين مؤمن الحمض النووي LNA)23،24،25،26،27،،من2829،،من3031. لكفاءة أفضل للتسليم في فيفو ، يمكن تعديل أنتاجومير بالروابط فوسفوروثيواتي (PS)، التي زادت المقاومة نوكلاس28. بالإضافة إلى ذلك، ملاحظة: العمود الفقري التعديلات أيضا إلى تعزيز الربط لبروتينات البلازما تقليل الإفراز البولي. وهكذا، تظهر أنتاجوميرس تعديل PS تحسنا كبيرا من خصائص الحرائك الدوائية، تيسير على تسليم الجهازية32. وقد ثبت أيضا أن استخدام الحمض النووي الببتيد (السلطة الفلسطينية) أو ليغومرات morpholino، مصممة لاستهداف ميرنا محددة، يمكن استخدامها لدراسة ميرنا خسارة للدالة تعمل33،34،35، 36 , 37 , 38 , 39-كفاءة تمنع نانوحبيبات الرصاصية ومترافق بوليليسيني أنتاجوميرس السلطة الوطنية الفلسطينية ميرنا تعمل على حد سواء في المختبر و في فيفو36،،من3738، 39-على الرغم من التقدم الذي أحرز مؤخرا، تنفيذ الفعال والأنسجة على حدة من مشتقات ميرنا لا يزال يمثل تحديا. وتشمل هذه إمكانات الآثار خارج الهدف، تسبب الاستجابات المناعية الفطرية، والأهم من ذلك، الحصول على تسليم محددة في خلايا الأجهزة/الأنسجة المستهدفة.

بالإضافة إلى ذلك، مستويات التعبير ميرنا تختلف اختلافاً كبيرا تبعاً للخلية والأنسجة اكتب40. وعلاوة على ذلك، يمكن زيادة التعبير ميرنا أو إنقاصه في المرض. نتيجة تعبير ميرنا تغيير وتأثير على وظيفة الخلايا والأنسجة ومع التعبير أعاق اسفنجة ميرنا يحتاج إلى التحقق من صحتها ويحدد تجريبيا. الدراسات الإكلينيكية واسعة النطاق في نماذج الأمراض الحيوانية مطلوبة لتحديد المستوى الأمثل لتثبيط لهدف معين ميرنا.

من المثير للاهتمام، ميرنا مير-181 ج معارض تجزئة سوبسيلولار3،،من45. على وجه التحديد، كما هو متوقع، مير-181s المشفرة في النواة ونسخها كمحاضر منذ فترة طويلة-pri-ميرنا التي يتم معالجتها في السيتوبلازم بواسطة الآلات ديسينغ وتدمج RISC. بيد على عكس المتعارف عليه ميرناس التي تعمل في السيتوبلازم، translocates النموذج ناضجة من 181 ج-مير في الميتوكوندريا ووظائفها في تنظيم جينات الميتوكوندريا محددة3. لقد أظهرنا أن مير-181-الأسفنج يمكن ربط النموذج ناضجة من 181 ج-مير في الكسر هيولى، وبالتالي منع إزفاء إلى الميتوكوندريا. ونتيجة لذلك، يمكن ملاحظة أوبريجوليشن طن متري-COX1 في الميتوكوندريا في ظل ظروف downregulation التعبير مير-181 ج.

ولقد ذكرت المنهجية اللازمة لتصميم ميرنا اسفنجة نهدم التعبير عن أي ميرنا والمبينة على بروتوكول للتطبيق في فيفو ميرنا-الأسفنج. تثبيط ميرنا الأنسجة على حدة حاليا أسلوب متخلفة في مجال ميرنا. أهمية downregulation أو تثبيط وظيفي من ميرناس أوبريجولاتيد في الأمراض البشرية يوحي بأنه قد يكون من الممكن استغلال الأحياء ميرنا للتدخل العلاجي.

وأبرزت هذه الدراسة استراتيجية لخفض ميرنا، التي يمكن أن تستخدم بنجاح في طريقة محددة الأنسجة فيفو. ميرنا-الأسفنج الاستفادة من العقاقير تسلسل تسلسل "البذور" ميرنا. ولذلك، يمكن ميرنا-الأسفنج دوونريجولاتي كل من ميرناس التي تشترك في نفس "البذور" التسلسل، أي، ميرنا كامل الأسرة. في هذه الدراسة، وقد لاحظنا من downregulation كبيرة من أسرة مير-181 (مير-181a، 181b مير، مير-181 ج ومير-181 د) مع التعبير عن مير-181-الأسفنج، على حد سواء في المختبر و في فيفو. إذا كان أحد أفراد الأسرة يمنح الحماية بينما آخر من أفراد الأسرة له آثار ضارة داخل الجهاز نفسه، لن يكون باستخدام تكنولوجيا الأسفنج ميرنا النهج المثالي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

ونحن نشكر أنتوني ليونغ ل. ك. قسم الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية، كلية بلومبرغ للصحة العامة، جامعة جونز هوبكنز لبلده التقنية المساعدة في تصميم بناء مير-181-الأسفنج. ونشكر أيضا بولينا سيسا-شاه وكاثلين جابريلسون إدارة الجزيئية و "النسبية بل"، مؤسسات جونز هوبكنز الطبية الخاصة بالمساعدة التقنية بالتصوير في فيفو إيصال اسفنجة ميرنا.

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة، HL39752 (لتشارلز ستينبرجين) ومنحة تنمية عالم من 14SDG18890049 "جمعية القلب الأمريكية" (إلى Das سامارجيت). مروج خاصة بالقلب الفئران قدمت سخاء "جيفري د مولكينتين" في مستشفى سينسيناتي "الأطفال".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pEGFP-C1 vector Addgene 6084-1
In-fusion Clontech 121416
QIAprep Miniprep Qiagen 27104
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
miR-181-sponge synthesis Introgen GeneArt custome made
PCR primers Integrated DNA Technologies custome
EcoRI enzymes New Endland Biolabs R0101S
KpnI enzymes New Endland Biolabs R0142S
Rapid DNA Ligation Kit Sigma-Aldrich 11635379001
H9c2 cells ATCC CRL-1446
DMEM Media Thermo Fisher Scientific 11965092
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 10082139
Nucleofector 2b Device Lonza AAB-1001
Nucleofector Kits for H9c2 (2-1) Lonza VCA-1005
G418, Geneticin Thermo Fisher Scientific 11811023
FACSAria II Flow cytometer BD Bioscience 644832
Branson 450 sonifier Marshall Scientific EDP 100-214-239
The Xenogen IVIS Spectrum optical imaging device Caliper Life Sciences
Anti-MTCO1 antibody Abcam ab14705
α-tubulin antibody Abcam ab7291
Sequoia C256 ultrasound system Siemens

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hammond, S. M. microRNA detection comes of age. Nat Methods. 3 (1), 12-13 (2006).
  2. van Rooij, E., Olson, E. N. MicroRNAs: powerful new regulators of heart disease and provocative therapeutic targets. The Journal of Clinical Investigation. 117 (9), 2369-2376 (2007).
  3. Das, S., et al. Nuclear miRNA regulates the mitochondrial genome in the heart. Circulation Research. 110 (12), 1596-1603 (2012).
  4. Das, S., et al. miR-181c regulates the mitochondrial genome, bioenergetics, and propensity for heart failure in vivo. PLoS One. 9 (5), e96820 (2014).
  5. Das, S., et al. Divergent effects of miR-181 family members on myocardial function through protective cytosolic and detrimental mitochondrial microRNA targets. Journal of the American Heart Association. 6 (3), e004694 (2017).
  6. Sicard, F., Gayral, M., Lulka, H., Buscail, L., Cordelier, P. Targeting miR-21 for the therapy of pancreatic cancer. Molecular Therapy. 21 (5), 986-994 (2013).
  7. Jopling, C. L., Yi, M., Lancaster, A. M., Lemon, S. M., Sarnow, P. Modulation of hepatitis C virus RNA abundance by a liver-specific microRNA. Science. 309 (5740), 1577-1581 (2005).
  8. Lanford, R. E., et al. Therapeutic silencing of microRNA-122 in primates with chronic hepatitis C virus infection. Science. 327 (5962), 198-201 (2010).
  9. Ucar, A., et al. The miRNA-212/132 family regulates both cardiac hypertrophy and cardiomyocyte autophagy. Nature Communications. 3, 1078 (2012).
  10. Zhu, X., et al. Identification of micro-RNA networks in end-stage heart failure because of dilated cardiomyopathy. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (9), 1173-1187 (2013).
  11. Bandiera, S., et al. Nuclear outsourcing of RNA interference components to human mitochondria. PLoS One. 6 (6), e20746 (2011).
  12. Barrey, E., et al. Pre-microRNA and mature microRNA in human mitochondria. PLoS One. 6 (5), e20220 (2011).
  13. Bian, Z., et al. Identification of mouse liver mitochondria-associated miRNAs and their potential biological functions. Cell Research. 20 (9), 1076-1078 (2010).
  14. Kren, B. T., et al. MicroRNAs identified in highly purified liver-derived mitochondria may play a role in apoptosis. RNA Biology. 6 (1), 65-72 (2009).
  15. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
  16. Molkentin, J. D., Jobe, S. M., Markham, B. E. Alpha-myosin heavy chain gene regulation: delineation and characterization of the cardiac muscle-specific enhancer and muscle-specific promoter. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 28 (6), 1211-1225 (1996).
  17. Poliseno, L., et al. A coding-independent function of gene and pseudogene mRNAs regulates tumour biology. Nature. 465 (7301), 1033-1038 (2010).
  18. Henao-Mejia, J., et al. The microRNA miR-181 is a critical cellular metabolic rheostat essential for NKT cell ontogenesis and lymphocyte development and homeostasis. Immunity. 38 (5), 984-997 (2013).
  19. Williams, A., Henao-Mejia, J., Harman, C. C., Flavell, R. A. miR-181 and metabolic regulation in the immune system. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 78, 223-230 (2013).
  20. Hori, D., et al. miR-181b regulates vascular stiffness age dependently in part by regulating TGF-beta signaling. PLoS One. 12 (3), e0174108 (2017).
  21. Ebert, M. S., Sharp, P. A. MicroRNA sponges: progress and possibilities. RNA. 16 (11), 2043-2050 (2010).
  22. Ma, L., et al. Therapeutic silencing of miR-10b inhibits metastasis in a mouse mammary tumor model. Nature Biotechnology. 28 (4), 341-347 (2010).
  23. Davis, S., Lollo, B., Freier, S., Esau, C. Improved targeting of miRNA with antisense oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 34 (8), 2294-2304 (2006).
  24. Davis, S., et al. Potent inhibition of microRNA in vivo without degradation. Nucleic Acids Research. 37 (1), 70-77 (2009).
  25. Elmen, J., et al. LNA-mediated microRNA silencing in non-human primates. Nature. 452 (7189), 896-899 (2008).
  26. Esau, C. C. Inhibition of microRNA with antisense oligonucleotides. Methods. 44 (1), 55-60 (2008).
  27. Stenvang, J., Kauppinen, S. MicroRNAs as targets for antisense-based therapeutics. Expert Opinion on Biological Therapy. 8 (1), 59-81 (2008).
  28. Lennox, K. A., Behlke, M. A. A direct comparison of anti-microRNA oligonucleotide potency. Pharmaceutical Research. 27 (9), 1788-1799 (2010).
  29. Lennox, K. A., Behlke, M. A. Chemical modification and design of anti-miRNA oligonucleotides. Gene Therapy. 18 (12), 1111-1120 (2011).
  30. van Rooij, E., Olson, E. N. MicroRNA therapeutics for cardiovascular disease: opportunities and obstacles. Nature Reviews. Drug Discovery. 11 (11), 860-872 (2012).
  31. Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3 (1), 1 (2012).
  32. Levin, A. A. A review of the issues in the pharmacokinetics and toxicology of phosphorothioate antisense oligonucleotides. Biochimica et Biophysica Acta. 1489 (1), 69-84 (1999).
  33. Flynt, A. S., Li, N., Thatcher, E. J., Solnica-Krezel, L., Patton, J. G. Zebrafish miR-214 modulates Hedgehog signaling to specify muscle cell fate. Nature Genetics. 39 (2), 259-263 (2007).
  34. Kloosterman, W. P., Lagendijk, A. K., Ketting, R. F., Moulton, J. D., Plasterk, R. H. Targeted inhibition of miRNA maturation with morpholinos reveals a role for miR-375 in pancreatic islet development. PLoS Biology. 5 (8), e203 (2007).
  35. Martello, G., et al. MicroRNA control of Nodal signalling. Nature. 449 (7159), 183-188 (2007).
  36. Fabani, M. M., Gait, M. J. miR-122 targeting with LNA/2'-O-methyl oligonucleotide mixmers, peptide nucleic acids (PNA), and PNA-peptide conjugates. RNA. 14 (2), 336-346 (2008).
  37. Fabani, M. M., et al. Efficient inhibition of miR-155 function in vivo by peptide nucleic acids. Nucleic Acids Research. 38 (13), 4466-4475 (2010).
  38. Babar, I. A., et al. Nanoparticle-based therapy in an in vivo microRNA-155 (miR-155)-dependent mouse model of lymphoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), E1695-E1704 (2012).
  39. Torres, A. G., et al. Chemical structure requirements and cellular targeting of microRNA-122 by peptide nucleic acids anti-miRs. Nucleic Acids Research. 40 (5), 2152-2167 (2012).
  40. Kent, O. A., McCall, M. N., Cornish, T. C., Halushka, M. K. Lessons from miR-143/145: the importance of cell-type localization of miRNAs. Nucleic Acids Research. 42 (12), 7528-7538 (2014).

Tags

علم الأحياء، 136 قضية، MicroRNA، ميرنا، اسفنجة ميرنا، وتثبيط ميرنا، نانوحبيبات، نانوفيكتور، مير-181، القلب، ميرنا المتقدرية
<em>في فيفو</em> نانوفيكتور إيصال اسفنجة ميكرورنا الخاصة بالقلب
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kent, O. A., Steenbergen, C., Das,… More

Kent, O. A., Steenbergen, C., Das, S. In Vivo Nanovector Delivery of a Heart-specific MicroRNA-sponge. J. Vis. Exp. (136), e57845, doi:10.3791/57845 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter