Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

I Vivo Nanovector levering av en hjerte-spesifikke MicroRNA-svamp

Published: June 15, 2018 doi: 10.3791/57845
Automatic Translation
1, 2, 2
1Princess Margaret Cancer Centre, University of Toronto, 2Department of Pathology, Department of Cardiology, Johns Hopkins University

Summary

Vev-spesifikke microRNA hemming er en teknologi som er underutviklet i feltet microRNA. Her beskriver vi en protokoll for vellykket hemme miR-181 microRNA familien i myoblast celler fra hjertet. Nanovector teknologi brukes til å levere en microRNA svamp som viser betydelig i vivo cardio-spesifikke miR-181 med familien hemming.

Abstract

MicroRNA (miRNA) er liten ikke-koding RNA som hemmer post-transcriptional budbringer RNA (mRNA) uttrykk. Menneskelige sykdommer som kreft og kardiovaskulær sykdom, har blitt vist å aktivere vev og/eller cellen-spesifikke miRNA uttrykk forbundet med sykdomsprogresjon. Hemming av miRNA uttrykk tilbyr muligheter for en terapeutisk intervensjon. Tradisjonelle tilnærminger å hemme miRNAs, ansette antagomir oligonucleotides, påvirker imidlertid bestemte miRNA funksjoner ved globale levering. Her presenterer vi en protokoll for cardio-spesifikke i vivo hemming av miR-181 familien i en rotte modell. En miRNA-svamp konstruksjon er utformet for å inkludere 10 gjentatte miR-181 bindende sekvenser. Cardio-spesifikke α-MHC selskapet er klonet i pEGFP ryggraden å kjøre cardio-spesifikke miR-181 miRNA-svamp uttrykket. Hvis du vil opprette en stabil celle er uttrykke miR-181-svamp, myoblast H9c2 celler transfekterte med den α-MHC-EGFP-miR-181-sponge konstruere og sortert etter fluorescens-aktivert celle sortering (FACs) i GFP positivt H9c2 celler som er kultivert med neomycin (G418). Etter stabil vekst i neomycin, monoklonale celle populasjoner er etablert av ekstra FACs og enkelt celle kloning. De resulterende myoblast H9c2-miR-181-svamp-GFP cellene exhibit tap av funksjon av miR-181 familiemedlemmer som vurdert gjennom økt uttrykk for miR-181 målet proteiner og sammenlignet H9c2 celler uttrykke en scramble fungerer ikke svamp. I tillegg utvikle vi en nanovector for systemisk levering av miR-181-svamp Konstruer av complexing positivt ladet liposomal nanopartikler og negativt ladet miR-181-svamp plasmider. I vivo avbildning av GFP avslører at flere hale blodåre injeksjoner av en nanovector over en tre-ukers periode, kan fremme en betydelig uttrykk for miR-181-svamp på cardio-spesifikk måte. Viktigere, er tap av miR-181 funksjonen observert i hjertet tissue men ikke i nyre eller leveren. MiRNA-svamp er en kraftig metode å hemme vev-spesifikke miRNA uttrykk. Kjører miRNA-svamp uttrykket fra en vev-spesifikke promoter gir spesifisitet for miRNA hemming, som kan være begrenset til en målrettet organ eller vev. Videre tillater kombinerer nanovector og miRNA-svamp teknologi en effektiv levering og vev-spesifikke miRNA hemming i vivo.

Introduction

De siste to tiårene, har det vært mange studier som har pekt på betydelig rollen som miRNAs i menneskelig sykdom. Resultatene fra en stor mengde litteratur viser unektelig betydningen av miRNAs i patofysiologien av sykdommer som kreft1 og hjerte-og karsykdommer2,3,4,5. For eksempel er miR-21 upregulated i mange kreftformer, som resulterer i en økt celle syklus og celle spredning6. I hepatitt C infeksjoner, miR-122 spiller en viktig rolle i replikering av virus7, og det har vist at hemming av miR-122 reduserer Virusmengden8. Hjerte-hypertrofi, miR-212/132 er upregulated i hjertet og er involvert i patologisk fenotypen9. Åpenbare betydningen av downregulation eller funksjonelle hemming av en upregulated miRNA antyder muligheter for terapeutisk utnytte miRNA biologi i nesten alle sykdommer.

Fire miR-181 familiemedlemmer, miR-181a/b/c/d, finnes i tre genomisk steder i det menneskelige genomet. Intronic regionen med et ikke-koding RNA vert (MIR181A1-HG) koder klyngen av miR-181-a/b-1. Intronic regionen av NR6A1 genet koder til miR-181-a/b-2. MiR-181-c/d klyngen ligger i en uncharacterized utskrift på kromosom 19. Alle miR-181 familiemedlemmer deler samme "frø" sekvens, og alle fire miR-181 familiemedlemmer kan potensielt regulere samme mRNA mål.

Vi3,4 og andre10 har understreket viktigheten av miR-181 familiemedlemmer under sluttstadiet hjertesvikt. Vi har også anerkjent at en miR - 181c oppregulering oppstår under patologiske forhold knyttet til en økt risiko for hjertesykdom, som type II diabetes, fedme og aldring3,4,5. Det har blitt postulert at overuttrykte av miR - 181c fører oksidativt stress som fører til hjerte-dysfunksjon4.

Flere grupper har antydet at miRNA finnes i mitokondrier11,12,13,14, men vi var de første til å demonstrere at miR - 181 c er avledet fra kjernefysiske genomet, behandlet, og senere translocated til mitokondrier i RISC3. Videre har vi oppdaget en lav uttrykk for miR-181a og miR-181b i mitokondrie rommet av hjertet5. Viktigere, har vi funnet at miR - 181c represses mt-COX1 mRNA uttrykket, og dermed demonstrere at miRNAs delta i mitokondrie genet regulering og endre mitokondrie funksjonen3,4.

Denne artikkelen beskriver metodene som kreves for å utforme en miRNA-svamp å slå ned hele miR-181 familien i cardiomyocytes. Videre skissere vi en protokoll for programmet i vivo av miR-181-svampen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen av Johns Hopkins University.

1. svamp Design

  1. MicroRNA binding 3' UTR
    Merk: A miRNA-funksjonene gjennom spesifikke base paring interaksjoner med delvis komplementære områder i 3 uoversatt regionen (UTR) av sine mål mRNAs (for en omfattende gjennomgang, se byttehandel)15.
    1. Utforme hemmere av miRNA uttrykket som oligonucleotides som inneholder betydelige komplementaritet miRNA-sekvensen. Beslaglegge en miRNA i en oligonucleotide komplekse gjennom omfattende base sammenkobling blokkere funksjonen miRNA.
  2. Utformingen av en miRNA svamp
    1. Utforme tandemly plassert delvis komplementære miRNA sekvenser med en kul der normalt kløyvde av Argonaute 2. Bule er plassert nukleotider 9-12 av modne miRNA sekvensen hindre at RNA forstyrrelser type cleavage og nedbrytning av svamp.
    2. Eventuelt kan du utforme lokkefugl målet sekvensen binde til alle miR-181 familiemedlemmer. På en eksamen og sammenligning av miR-181 familie miRNA sekvenser, finne en felles sekvens på 5'-siden av bule som inneholder 8 påfølgende nukleotider, eller finne en felles for alle 4 miR-181 familiemedlemmer på 3-side av bule av en ekstra 8 påfølgende nukleotider. Disse 2 sekvensene representerer de venstre og høyre halvdel bindende områdene, henholdsvis.
      Merk: Lokkefugl sekvensen er en tandem rekke de venstre og høyre halvdel bindende områdene atskilt med en GGA for avstand. Koble sammen 5'-end sekvensen og 3-side sekvensen (beskrevet i trinn 1.2.2) med en GGA spacer designet for å skape bule når herdet til en miRNA (som beskrevet i trinn 1.2.1). Gjenta denne 1 miRNA binding området 10 x i den endelige miR-svamp konstruere.
  3. Andre miRNA svamp hensyn
    Merk: For å klone svamp sekvensen i mottakerens uttrykk vektor, begrensning nuclease anerkjennelse områder må inkluderes i hver ende av sekvensen. En i sili fordøyelsen analyse bør brukes til å bekrefte uspesifisert spalting av svamp sekvensen av valgt begrensning enzymer og andre begrensning enzymer i nedstrøms kloning programmer.
    1. Legge til en dobbel stopp codon (TAA TAA) etter 5'-den syntetiske 3' UTR, slik at miR-181-svamp sekvensen ikke er del av koding rekkefølgen for en forbedret grønne fluorescerende protein (EGFP).
  4. Syntese av svampen DNA for kloning
    1. Bruk en DNA-synthesizer eller ansette en kommersielt tilgjengelig kilde å syntetisere den endelige miRNA svamp sekvensen med begrensning nuclease anerkjennelse nettsteder i stedet for kloning. Svampen leveres på en plasmider som kan inneholde valgbar markører for en forsterkning i bakterier. Videre svampen kan forsterkes av en polymerasekjedereaksjons (PCR) for kloning eller bare droppet ut donor vektoren bruker begrensningen områdene beskrevet i trinn 1.3 (også se trinn 3.1).

2. kloning mottaker vektor med en vev-spesifikke Promoter

Merk: Bruk pEGFP-C1 vektoren som mottaker vektoren for uttrykket kassetten av miRNA svampen. PEGFP-C1 vektoren inneholder pynteborder lesing for en EGFP drevet av en cytomegalovirus (CMV) promoter. CMV selskapet er constitutively aktiv i pattedyrceller. Hvis en vev-spesifikke promoter, kan CMV arrangøren fjernes av fordøyelse av AseI og NheI enzymer (se trinn 2.1). Plasmider inneholder en omfattende flere kloning området (MCS) og kanamycin (Kan) neomycin (G418) markører for et utvalg i bakterier og en stabil uttrykk i pattedyrceller, henholdsvis.

  1. Fjerne CMV promoter fra pEGFP-C1
    1. Gjøre 50 μL av fordøyelsen reaksjon som inneholder 1 x kommersielt tilgjengelig digest buffer foreslått av produksjon av begrensning enzymer brukes, 5 μg av plasmider DNA (i vann) og 5 μL hver av AseI og NheI enzymer. Legge til alle komponentene i et microcentrifuge rør og bland dem forsiktig ved å sveipe det. Spin røret for 10 s i en microcentrifuge å samle reaksjonen nederst. Inkuber reaksjonen i et vannbad 37 ° C i 15 min.
    2. Rense den fordøyde linearisert plasmider. Legg til 5 x reaksjon volumet av kolonnen bindende buffer (en proprietær blanding av riktig bindende bufferen for produksjon av DNA rensing kolonnene brukes) og rense reaksjon med en kolonne for rensing av DNA som beskrevet av produsenten. Elute med 25 μL elueringsbufferen (vann) lagt nøye til midten av kolonnen.
    3. Gel rense den fordøyde plasmider på 0,5% agarose gel som følger: legge til 5 μL lasting buffer (50% glyserol-3 x lasting fargestoff) til den eluted plasmider. Legg hele utvalget i 1 på 0,5% agarose gel. Inkluderer en egen fil med 500 ng av uncut vektor. Kjøre den i 30-40 minutter før et tilstrekkelig skille mellom kutt og uklippet plasmider er oppnådd.
    4. Rense linearisert plasmider som følger: visualisere DNA i agarose gel på en UV lys boksen. Med en ren barberblad, nøye avgiftsdirektoratet bandet tilsvarer den lineære plasmider.
      Merk: Den lineære plasmider bør kjøre lavere enn den uklippet plasmider og vises som et enkelt band på omtrent 4,2 kb. Forbrukeravgift CMV Promotøren vil vises som et lys band på ca 500 nukleotider (nt).
    5. Ekstra DNA fra gel stykke ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig utstyr og elute DNA fra kolonnen med 25 μL vann.
  2. Kloning en hjerte-spesifikke promoter i pEGFP-C1
    Merk: Alpha-myosin tunge kjede (α-MHC) selskapet er tidligere preget og viste til direkte robust nivåer av hjerte-begrenset uttrykk som beskrevet i de følgende Molkentin, Jobe og Markham16. De neste avsnittene beskriver hvordan du forsterke arrangøren av vektoren for kloning.
    1. Klone α-MHC arrangøren mellom elementer +420 til-2934 i forhold til startwebstedet transkripsjon i p40 plasmider16 av første utforme PCR primere som flanken denne regionen og deretter plasmider som en mal for PCR. Forsterke regionen promoter bruker PCR primere beskrevet tidligere5. Revers PCR primere inneholder sekvenser av overlappingen til fordøyd ender pEGFP-C1 (trinn 2.1) å tillate i-Fusion regissert kloning. Håndboken i-Fusion en omfattende forklaring av primer for In-Fusion kloning. Primer sekvenser finnes i tabell 1.
    2. Forberede en 50 μL PCR reaksjon, som inneholder 1 μM hver primer og 10 ng av DNA. Legge til en passende mengde PCR enzym og dNTPs avhengig av produksjon av PCR reagensene valgt. Utføre PCR på standard DNA sykling blokk. Utføre en 3 min 98 ° C denaturing trinn, etterfulgt av 35 sykluser av denaturing, annealing og utvidelse for 5, 30 og 120 s hver, henholdsvis. Ta med filtypen siste 10 min på 72 ° C.
    3. Rydd PCR og gel utvinning. Ved ferdigstillelse av PCR syklus, legge til 5 x reaksjon volumet av kolonnen bindende bufferen PCR reaksjonen og rense det DNA rensing kolonnen som beskrevet av produsenten. Elute blandingen med 25 μL elueringsbufferen (vann) lagt nøye til midten av kolonnen.
      1. Tilsett 5 μL av laste buffer [50% glyserol (3 x) lasting fargestoff] til elut plasmider. Legg hele utvalget i 1 på 1% agarose gel. Kjøre det i 30-40 min; visualisere og avgiftsdirektoratet PCR produktet som beskrevet ovenfor (trinn 2.1.5).
    4. Ligate α-MHC selskapet med pEGFP-C1 slik: Legg 10 μL ligation reaksjonen som inneholder 1 x vanlig ligatur buffer, 2 μL renset PCR og 1 μL linearisert vektor. Utfør hemorroider ved 50 ° C i 15 min og deretter avkjøles den på is.
    5. Utføre en bakteriell transformasjon som følger: transfect 50 μL av kompetente celler med 2,5 μL-Fusion ligation blanding ved å legge til komponenter. Hvile i Eppendorf rør på is 20 min, sette den i et vannbad 42 ° C til 40 s og deretter sted røret på is 2 min.
      1. Etter transformasjon, tilsett 350 μL av SOC media og vokse celler ved 37 ° C i 45 min. Plate 200 μL utvekst løsning på LB plater med Kan. utføre en koloni PCR å identifisere Kan motstandsdyktig celler som inneholder α-MHC promoter hemorroider.
        Merk: Screening primere var ment å PCR over ligation krysset.
    6. Utvid PCR positiv kloner i LB-Kan buljong og plasmider renset med standard mini prep plasmider rensing protokoller som beskrevet av produsenten.

3. kloning svamp

  1. Fordøye mottaker vektoren
    1. Gjøre α-MHC-pEGFP plasmider lineær for kloning med EcoRI og KpnI, og rense gel som beskrevet ovenfor (trinn 2.1).
  2. PCR forsterke og fordøye svampen DNA
    1. Bruk miR-181-svamp og tilsvarende 284-nt lange forbundets frakt vektorer som mal for PCR. Forsterke regionen svamp bruker beskrevet tidligere PCR primere5. Merk at revers PCR primere inneholder begrensning enzym sekvenser å tillate ligation til α-MHC-pEGFP-C1. Utføre PCR som beskrevet ovenfor (trinn 2.2.2). Rense PCR produktene før fordøyelsen som beskrevet (trinn 2.2.3) og elut dem med vann for fordøyelsen. Primer sekvenser, se tabell 1.
    2. Fordøye svampen DNA for hemorroider. En 50 μL fordøyelsen reaksjon inneholder 1 x digest buffer, gel-renset PCR reaksjonen fra trinn 3.2.1 og 5 μL av både EcoRI og KpnI enzymer. Legge til alle komponentene i et microcentrifuge rør og bland dem forsiktig ved å sveipe det. Spin røret for 10 s i en microcentrifuge å samle reaksjonen nederst. Inkuber reaksjonen i et vannbad 37 ° C i 15 min.
    3. Rense fordøyd PCR svampen bruker en PCR oppryddingen kolonne som beskrevet tidligere (trinn 2.2.1).
  3. Ligate miR-181-svamp i α-MHC-pEGFP-C1 vektor
    1. Definer en 21 μL ligation reaksjon som inneholder 1 x ligation buffer, 3 μL fordøyd og renset miR-181-svamp PCR, 1 μL linearisert α-MHC-pEGFP-C1 vektor, 1 x DNA buffer og 1 μL DNA ligase. Utføre hemorroider ved romtemperatur for 5 min og deretter plassere den på is.
    2. Transformere 50 μL av XL1-blå kompetent celler med 2 μL av hemorroider. Bruk transformasjon og plating protokoller som beskrevet ovenfor (trinn 2.2.5). Utføre en koloni PCR å identifisere Kan resistente bakterier som inneholder riktig α-MHC-pEGFP-miR-181-sponge rekkefølge. Utforme screening primere for PCR over ligation krysset. Se tabell 1 for primer sekvenser.
    3. Forsterke og sekvens vektoren. Utvid PCR positiv kloner i LB-Kan buljong og plasmider renset med standard mini prep plasmider rensing protokoller. Utføre en DNA-sekvenser for å kontrollere plasmider uttrykke de ønskede DNA-sekvensene.

4. generasjon stabil H9c2 miR-181-svamp uttrykke celler

  1. Vekst og vedlikehold av H9c2 celler
    1. Kultur i H9c2 celler i Dulbeccos endret Eagle's Medium (DMEM) inneholder fosterets bovin serum (FBS) til en siste konsentrasjon på 10%. Sub kultur cellene ved hjelp av standardprotokoller og vokse dem på 37 ° C i 5% karbondioksid.
  2. Hva og utvalg av H9c2 α-MHC-pEGFP-C1-miR-181-sponge uttrykke celler
    1. Utføre en electroporation av H9c2 celler for de beste resultatene. Transfect rotten myoblasts (H9c2) med en scramble svamp (en 284-nt lange scramble sekvens som erstatter miR-181-svamp-sekvensen) eller den α-MHC-pEGFP-miR-181-sponge konstruksjonen med en electroporator.
      1. Kort, transfect 4 x 10-5 celler med 2 μg av plasmider DNA (i 5 µL av H2O) og 100 µL av en løsning som er kompatibel med electroporation enheten. Bruk et electroporation program for DS-120 til transfect H9c2 cellene.
      2. Inkuber transfekterte cellene i cuvette i 10 min ved romtemperatur. Legg til 500 µL av DMEM direkte til cuvette. Forsiktig overføre totalt cuvette innholdet til et godt av en 6-vel plate.
    2. Velg for GFP positive cellene etter 48 timer etter transfection av FACs. Plate bare GFP-uttrykt cellene i en 6-vel plate med et tillegg av neomycin (G418) (400ng/mL) til fullstendig vekst media.
      Merk: Før G418 utvalget, en kill kurve bør opprettes for å bestemme mengden av neomycin kreves for valg. For H9c2 celler, 400 ng/mL G418 resulterte i en cirka 80% dødelighet på ikke-plasmider transfekterte H9c2 celler etter 24 h og ble ansett å være ønsket arbeider konsentrasjonen av G418 for disse cellene. Cellen linjen ble betraktet som stabile etter vekst ble opprettholdt i G418 16 dager.
    3. Utføre FACs sorteringen av G418 stabile cellene med uttrykk for GFP som en markør for en svamp positiv utvalg. Frø 5-10 celler i hver brønn av en 96-brønns plate av flyt-sortering. Utvid monoklonale cellene fra 96-brønns platen til 24-vel plater over flere passasjer. Bruk fryser bestander av celler fra passasje 3 (P3) celler som utgangspunkt for etterfølgende eksperimenter.
    4. Utfør alle celle-linje-baserte eksperimenter med lav-passasjen celler mellom P5 og P10.

5. syntese og rensing av svamp-nanopartikler (miR-181-svamp nanopartikler)

  1. Forberede den liposomal nanopartikler smelte kationisk amphiphile (DOTAP) og co lipider, kolesterol og DSPE-PEG-OMe, i 5:5:0.1 mM forholdet, henholdsvis i en blanding av kloroform og metanol i et hetteglass.
  2. Fjerne organisk løsemiddel på 44-45 ° C, under et vakuum ved hjelp av en roterende fordamperen, etterfulgt av en skånsom flyt av fukt-fri nitrogen. Holde den gjenværende tørkede filmen av lipid under høyvakuum 8 h.
  3. Forbered en blanding ved å legge til 5% glukose vakuum-tørket lipid filmen. La den over natten for å la denne blandingen til hydrat filmen. Vortex ampullen i 2 til 3 minutter ved romtemperatur for å produsere multilamellar blemmer med en sporadisk riste i en 45 ° C vannbad.
    1. Sonicate multilamellar blemmer å forberede små unilamellar blemmer i en isbadet i 3-4 min til klarhet kan observeres, en 100% driftssyklus og 25 W utgangseffekt.
  4. Bland en scramble sekvens eller en miR-181-svamp sekvens klonet i pEGFP(α-MHC) vektorer og liposome 1:3 gratis forhold for å danne den nanovector4.
    Merk: En elektrostatisk kompleks av positivt ladet liposomal nanopartikler og negativt ladet plasmider DNA er kjent som en nanovector.

6. systemisk levering av svamp-nanopartikler og validering av i Vivo effekter

  1. Systemisk levering av svamp-nanopartikler i rotter
    1. Bruk Sprague-Dawley (SD) rotter. Injisere rotter intravenøst med miR-181-svamp nanovector eller scramble nanovector gjennom halen åre. Bruke SD hannrotter, som er ca 200 g i kroppsvekt.
    2. Utfør hale blodåre injeksjon benytter en dose av 4 mg nanovector/kg kroppsvekt og gjenta dette med en diett av 6 hale blodåre injeksjoner over 2 uker. Etter gjentatte nanovector levering, gir en 1-ukers periode (dager 15-21) uttrykk for vektor i vivo.
    3. Bekreft optimalisering av imaging GFP signalet før, under og etter nanovector levering. Analysere GFP signalet av tomographic bildebehandling programvare, som genererer semi kvantitative data.
  2. Validering av i vivo miR-181 hemming av miR-181-svamp
    1. Utføre western blot for å demonstrere uttrykk for en funksjonell miR-181-svamp i hjertet vev.
      Merk: For denne studien, mt-COX1 uttrykket ble undersøkt.
  3. Funksjonell konsekvenser i vivo miR-181-svamp uttrykk i hjertet
    1. Utføre en todimensjonal, M-modus og Doppler echocardiography under og etter nanovector levering å analysere hjertefunksjon og morfologiske endringer. For en bedre skanning kapasitet i gnager hjerter, kan du bruke en ultralyd systemet utstyrt med en 15 MHz lineær array svinger.
    2. Anestesi kan påvirke den cardiac contractility; derfor utføre levering av miR-181-svamp nanovector eller scramble nanovector til dyr som er bevisst og uten noen bedøvende reagens under echocardiography prosessen. Se Das, et al. 4 for videre avklaring.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I stabilt transfekterte pEGFP-miR-181-svamp-uttrykke H9c2 cellene (fra trinn 4.2), var uttrykk for hele miR-181 familien (miR 181a, miR 181b, miR - 181c og miR - 181d) moderat redusert i forhold til pEGFP-kryptert-uttrykke H9c2 celler. MiR-181-svamp fungerer som en konkurransedyktig hemmer av hele miR-181 familien, så vi forventet at uttrykket av miR - 181c mitokondrie målet genet, mt-COX1, vil øke. Western blot data tyder på at mt-COX1 uttrykket ble økt i pEGFP-miR-181-svamp-uttrykke H9c2 cellene sammenlignet med pEGFP-scramble-uttrykt H9c2 cellene. I tillegg er ingen uttrykk endringer for mt-COX2 eller mt-COX3 oppdaget via immunoblot i pEGFP-miR-181-svamp-uttrykke H9c2 cellene. Vi brukte α-tubulin som kontrollen normalisering for immunoblotting analyse. GFP signalene ble hovedsakelig observert i lever og nyre opp til 2 uker etter systemisk levering av miR-svamp nanovector (figur 1A). Men var uttrykket GFP betydelig høyere i hjertet tissue etter 3 uker miR-181-svamp nanovector levering (figur 1A og 1B). Av notatet var det en GFP-signal oppdaget i leveren vev i noen dyr 3 uker etter systemisk levering; men var det ingen funksjonell effekter av miR-181-svamp i leveren på det tidspunktet.

Western blot viste en betydelig økning i mt-COX1 uttrykket i miR-181-svamp nanovector-injisert rotter sammenlignet scramble nanovector gruppene (figur 2). Høyere mt-COX1 antyder det er en lavere miR - 181c uttrykk i hjertet etter 3 uker med miR-181-svamp nanovector levering, som mt-COX1 er direkte målet for miR - 181c. Vi brukte α-tubulin som kontrollen normalisering for immunoblots.

Echocardiography viste ingen endring i cardiac funksjonen til miR-181-svamp nanovector-injisert rottene før, under og etter behandling diett, sammenlignet med gruppen scramble nanovector dyr.

Figure 1
Figur 1. I vivo analyse av nanovector levering av miR-181-svampen. (A) dette panelet viser optimalisert 3 ukers behandling protokollene med 6 intravenøs injeksjoner gjennom halen åre. Gul fargelegging i epifluorescence bildet viser uttrykk for pEGFP vektoren. Den maksimale intensiteten av gul fargelegging er observert på uken 3 punkt. (B) α-MHC promoter rekkefølgen pEGFP vektoren uttrykker selektivt miR-181-svamp eller kryptert sekvensen i hjertet på dag 21. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. Validering av effekten av miR-181-svamp nanovector på miR - 181c uttrykk. Dette er western blot analyse av mt-COX1 uttrykket i hjertet lysates pEGFP-scramble og pEGFP-miR-181-svamp nanovector-injisert rotter. Hele-hjertet homogenates ble undersøkt med angitte antistoffer. Vi brukte α-tubulin som en lasting. Bandet-densitometry vises i stolpediagrammet nedenfor. Student t-test ble utført, og standard feilverdi ble tegnet i stolpediagrammet som feilfelt. p < 0,05 vs pEGFP-scramble gruppe. n = 4.

Primer navn Sekvens TM Notater Bruk Mål
SAM3-1F ATGCATTAGTTATTAATGCTT
GACACACTTGACAATTTCT		 58,4 Rotte MHC arrangøren å klone i EGFP PCR MHC arrangøren
SAM3-2R GACCGGTAGCGCTAGCTG
ACTCACTGGGAGATTGCTT		 59,8 Rotte MHC arrangøren å klone i EGFP PCR MHC arrangøren
SAM3-3F CGAACGACCTACACCGAACT 64 Skjermen EGFP-F Kolonien PCR Positiv promoter kloner
SAM3-4R CGCTAGTCCTTGACCCTCTG 63.9 Skjermen MHC-R Kolonien PCR Positiv promoter kloner
SAM5-1F CCTGTCTCCAACACACAAGC 59.3 Sekvensen MHC arrangøren Sekvensering MHC arrangøren
SAM5-2R CAGACTGCAGGGCTGGTT 60 Sekvensen MHC arrangøren Sekvensering MHC arrangøren

Tabell 1. Primer sekvenser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne artikkelen beskrives design og syntese av miRNA-svampen og vist hvordan vev-spesifikke uttrykk for svamp er et kraftig verktøy for å hemme vev-spesifikke miRNA familie uttrykk.

Vi har vist at en miR-181 familie målretting svamp kan klones i et uttrykk plasmider med en hjerte-spesifikke promoter. Plasmider effektivt kan pakkes inn i en nanovector partikkel for levering i vitro og i vivo med electroporation eller en hale blodåre injeksjon, henholdsvis (figur 1). MiR-181 svampen kan hemme en hjerte-spesifikke uttrykk av miR-181 familien og kan påvirke uttrykket av miR-181 målet gener (figur 2). GFP i plasmider er en fordel, som kan visualisere levering og profilen for expression av nanovector uten å ofre dyr.

Kort, en miRNA-svamp består av en rekke miRNA antisense sekvenser plassert etter en reporter genet som fungerer som en lokkefugl miRNA målrette mRNA. Naturlig har forekommende miRNA-svamper blitt funnet å være endogenously uttrykt i planter og dyreceller så lenge ikke-koding RNAs (lncRNAs)17. Studien, har vi benyttet en svamp tilnærming for å hemme hele miR-181 familien i hjertet. Selv om miR-181-svamp tilnærming er en fysiologisk relevante metode for å downregulate miR-181 familien i kulturperler celler, kan i vivo bruk av miR-181-svamper være skadelig. For eksempel har flere studier vist en beskyttende rolle miR-181a og miR-181b i forskjellige cellen/vev typer18,19,20. Derfor skal miR-181-svamp uttrykket være rettet spesielt til hjertet vev.

Små oligonucleotides har vist seg for å blokkere funksjonen miRNA gjennom annealing å modne miRNA guide strand og hindre en riktig lasting i RNA-indusert stanse komplekset (RISC). Et problem med denne tilnærmingen er at oligonucleotides har levert i en mette dose nok til å blokkere mobilnettet bassenger av eldre miRNAs. Oligonucleotides er også lider av utfordringer som involverer transport over mobilnettet membraner og en generell stabilitet i molekylet. Genialt, har det vært vist at et exogenously medfølgende miRNA mål kan fungere som en lokkefugl for sine beslektet miRNA21. I kraft av flere bindende områder bundet sammen i en pseudo 3' UTR konstruere, lokkefugl målet, eller miRNA-svamp, er stabilt arbeide interaktivt med sine mål miRNAs og beslaglegge miRNA i microribonucleoprotein komplekser (miRNPs), dermed effektivt forhindrer funksjonen miRNA. Den såkalte "miRNA-svampen" er en effektiv anti-følelse teknologi som kan effektivt downregulate miRNA både i vitro og i vivo. Anvendelsen av en miRNA-svamp kan derfor brukes til å studere miRNA tap-av-funksjon fenotyper.

Forestillingen om at RNA-interferens (RNAi) kan føre til en ny klasse av therapeutics fanget oppmerksomheten til mange etterforskere snart etter oppdaget. Innen anvendt RNAi therapeutics har flyttet raskt fra lab til sengen. For tiden miRNA therapeutics er en av de raskt voksende terapeutisk intervensjonene i onkologi og er i fase 1 kliniske studier. Antisense oligonucleotides, eller antagomirs, er en av de mest brukte miRNA hemmende tilnærmingene. Ma et al. 22 brukes miR-10b antagomir, både i vitro og vivo, å slå upregulated miR-10b i en solid svulst.

I vivo, effektiv silencing av upregulated miRNAs krever en kjemisk endring av antagomirs å forbedre forpliktende tilhørighet, biostability og farmakokinetiske egenskapene. For å øke duplex smelter temperatur (Tm) og forbedre nuclease motstand av antagomirs, kan kjemiske modifikasjoner utføres, for eksempel 2 '-O-metyl (2 '-O-Me) og 2 '-O-methoxyethyl (2 '-MOE) 2 '-fluoro bisyklisk-låst nukleinsyre ( LNA)23,24,25,26,27,28,29,30,31. For en bedre effektivitet i vivo -levering, kan antagomir endres av phosphorothioate (PS) sammenhengen, som har økt nuclease motstand28. I tillegg forbedre PS ryggraden endringer også bindingen til plasma proteiner reduserer urin utskillelse. Dermed viser PS-modifisert antagomirs en betydelig forbedring av farmakokinetiske egenskapene, tilrettelegge deres systemiske levering32. Det har også vist at peptid nukleinsyre (PNA) eller morpholino oligomers, designet for å målrette en bestemt miRNA, kan brukes å studere miRNA tap-av-funksjon fenotyper33,34,35, 36 , 37 , 38 , 39. Polylysine-konjugerte og hydrogenion-kompleksbundet PNA antagomirs effektivt hemmer miRNA fungerer både i vitro og vivo36,37,38, 39. til tross for nylige fremskritt, en effektiv og vev-spesifikke levering miRNA-derivater er fortsatt en utfordring. Disse inkluderer potensialet for off-målet effekter, utløser medfødte immunreaksjoner og, viktigst, få en bestemt levering til cellene målrettet organer /.

Dessuten miRNA uttrykk nivåene variere avhengig av cellen og vev skriver du inn40. Videre kan miRNA uttrykket økes eller senkes i sykdom. Konsekvensen av endrede miRNA uttrykk og effekten på mobilnettet og vev funksjon med svamp-hemmet miRNA uttrykk må være godkjent og bestemt empirisk. Omfattende prekliniske studier i dyresykdommer modeller for å finne det optimale nivået på hemming for en gitt miRNA mål.

Interessant, utstillinger miR - 181c miRNA subcellular compartmentalization3,4,5. Spesielt som forventet, er miR-181s kodet i kjernen og som lang-pri-miRNA utskrifter som er behandlet i cytoplasma av dicing maskiner og innlemmet i RISC. Men i motsetning til kanoniske miRNAs som fungerer i cytoplasma, translocates modne form av miR - 181c i mitokondrier og funksjoner i regulering av mitokondrie-spesifikke gener3. Vi har vist at miR-181-svampen kan binde skjemaet modne av miR - 181c i cytoplasmatiske fraksjonen, dermed hindre translokasjon til mitokondrier. Derfor kan en oppregulering av mt-COX1 observeres i mitokondrier under vilkår av en downregulation av miR - 181c uttrykket.

Vi har rapportert metodikken må utforme en miRNA-svamp å slå ned uttrykk for alle miRNA og skissert en protokoll for programmet i vivo av miRNA-svampen. Vev-spesifikke miRNA hemming er en mindre utviklede teknikk i feltet miRNA. Betydningen av downregulation eller funksjonelle hemming av upregulated miRNAs i menneskelig sykdom tyder på at det kan være mulig å utnytte miRNA biologi for terapeutisk intervensjon.

Denne studien markert en strategi for å senke en miRNA, som kan brukes med hell i en vev-spesifikk måte i vivo. MiRNA-svampene benytte antisense rekkefølgen av miRNA "frø" sekvensen. Derfor miRNA-svamper kan downregulate alle miRNAs med samme "frø" sekvens, nemlig, hele miRNA familien. I denne studien, vi har observert en betydelig downregulation av hele miR-181 familien (miR 181a, miR 181b, miR - 181c og miR - 181d) med uttrykk for miR-181-svamp, både i vitro og i vivo. Hvis en familiemedlem gir beskyttelse mens et familiemedlem har skadevirkninger innenfor samme orgel, vil bruker miRNA-svamp teknologi ikke være den ideelle tilnærmingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Anthony K. L. Leung avdeling for biokjemi og molekylærbiologi, Bloomberg School of Public Health, Johns Hopkins University for hans teknisk hjelpe med å utforme den miR-181-svamp konstruere. Vi takker også Polina Sysa-Shah og Kathleen Gabrielson Institutt for molekylær og komparative Pathobiology, Johns Hopkins medisinske institusjoner for deres teknisk assistanse av i vivo -tenkelig miRNA-svamp levering.

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra NIH, HL39752 (til Charles Steenbergen) og en forsker Development Grant fra American Heart Association 14SDG18890049 (til Samarjit Das). Rotte cardio-spesifikke selskapet ble sjenerøst gitt av Jeffery D. Molkentin ved Cincinnati Children's Hospital.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pEGFP-C1 vector Addgene 6084-1
In-fusion Clontech 121416
QIAprep Miniprep Qiagen 27104
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
miR-181-sponge synthesis Introgen GeneArt custome made
PCR primers Integrated DNA Technologies custome
EcoRI enzymes New Endland Biolabs R0101S
KpnI enzymes New Endland Biolabs R0142S
Rapid DNA Ligation Kit Sigma-Aldrich 11635379001
H9c2 cells ATCC CRL-1446
DMEM Media Thermo Fisher Scientific 11965092
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 10082139
Nucleofector 2b Device Lonza AAB-1001
Nucleofector Kits for H9c2 (2-1) Lonza VCA-1005
G418, Geneticin Thermo Fisher Scientific 11811023
FACSAria II Flow cytometer BD Bioscience 644832
Branson 450 sonifier Marshall Scientific EDP 100-214-239
The Xenogen IVIS Spectrum optical imaging device Caliper Life Sciences
Anti-MTCO1 antibody Abcam ab14705
α-tubulin antibody Abcam ab7291
Sequoia C256 ultrasound system Siemens

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hammond, S. M. microRNA detection comes of age. Nat Methods. 3 (1), 12-13 (2006).
  2. van Rooij, E., Olson, E. N. MicroRNAs: powerful new regulators of heart disease and provocative therapeutic targets. The Journal of Clinical Investigation. 117 (9), 2369-2376 (2007).
  3. Das, S., et al. Nuclear miRNA regulates the mitochondrial genome in the heart. Circulation Research. 110 (12), 1596-1603 (2012).
  4. Das, S., et al. miR-181c regulates the mitochondrial genome, bioenergetics, and propensity for heart failure in vivo. PLoS One. 9 (5), e96820 (2014).
  5. Das, S., et al. Divergent effects of miR-181 family members on myocardial function through protective cytosolic and detrimental mitochondrial microRNA targets. Journal of the American Heart Association. 6 (3), e004694 (2017).
  6. Sicard, F., Gayral, M., Lulka, H., Buscail, L., Cordelier, P. Targeting miR-21 for the therapy of pancreatic cancer. Molecular Therapy. 21 (5), 986-994 (2013).
  7. Jopling, C. L., Yi, M., Lancaster, A. M., Lemon, S. M., Sarnow, P. Modulation of hepatitis C virus RNA abundance by a liver-specific microRNA. Science. 309 (5740), 1577-1581 (2005).
  8. Lanford, R. E., et al. Therapeutic silencing of microRNA-122 in primates with chronic hepatitis C virus infection. Science. 327 (5962), 198-201 (2010).
  9. Ucar, A., et al. The miRNA-212/132 family regulates both cardiac hypertrophy and cardiomyocyte autophagy. Nature Communications. 3, 1078 (2012).
  10. Zhu, X., et al. Identification of micro-RNA networks in end-stage heart failure because of dilated cardiomyopathy. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (9), 1173-1187 (2013).
  11. Bandiera, S., et al. Nuclear outsourcing of RNA interference components to human mitochondria. PLoS One. 6 (6), e20746 (2011).
  12. Barrey, E., et al. Pre-microRNA and mature microRNA in human mitochondria. PLoS One. 6 (5), e20220 (2011).
  13. Bian, Z., et al. Identification of mouse liver mitochondria-associated miRNAs and their potential biological functions. Cell Research. 20 (9), 1076-1078 (2010).
  14. Kren, B. T., et al. MicroRNAs identified in highly purified liver-derived mitochondria may play a role in apoptosis. RNA Biology. 6 (1), 65-72 (2009).
  15. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
  16. Molkentin, J. D., Jobe, S. M., Markham, B. E. Alpha-myosin heavy chain gene regulation: delineation and characterization of the cardiac muscle-specific enhancer and muscle-specific promoter. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 28 (6), 1211-1225 (1996).
  17. Poliseno, L., et al. A coding-independent function of gene and pseudogene mRNAs regulates tumour biology. Nature. 465 (7301), 1033-1038 (2010).
  18. Henao-Mejia, J., et al. The microRNA miR-181 is a critical cellular metabolic rheostat essential for NKT cell ontogenesis and lymphocyte development and homeostasis. Immunity. 38 (5), 984-997 (2013).
  19. Williams, A., Henao-Mejia, J., Harman, C. C., Flavell, R. A. miR-181 and metabolic regulation in the immune system. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 78, 223-230 (2013).
  20. Hori, D., et al. miR-181b regulates vascular stiffness age dependently in part by regulating TGF-beta signaling. PLoS One. 12 (3), e0174108 (2017).
  21. Ebert, M. S., Sharp, P. A. MicroRNA sponges: progress and possibilities. RNA. 16 (11), 2043-2050 (2010).
  22. Ma, L., et al. Therapeutic silencing of miR-10b inhibits metastasis in a mouse mammary tumor model. Nature Biotechnology. 28 (4), 341-347 (2010).
  23. Davis, S., Lollo, B., Freier, S., Esau, C. Improved targeting of miRNA with antisense oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 34 (8), 2294-2304 (2006).
  24. Davis, S., et al. Potent inhibition of microRNA in vivo without degradation. Nucleic Acids Research. 37 (1), 70-77 (2009).
  25. Elmen, J., et al. LNA-mediated microRNA silencing in non-human primates. Nature. 452 (7189), 896-899 (2008).
  26. Esau, C. C. Inhibition of microRNA with antisense oligonucleotides. Methods. 44 (1), 55-60 (2008).
  27. Stenvang, J., Kauppinen, S. MicroRNAs as targets for antisense-based therapeutics. Expert Opinion on Biological Therapy. 8 (1), 59-81 (2008).
  28. Lennox, K. A., Behlke, M. A. A direct comparison of anti-microRNA oligonucleotide potency. Pharmaceutical Research. 27 (9), 1788-1799 (2010).
  29. Lennox, K. A., Behlke, M. A. Chemical modification and design of anti-miRNA oligonucleotides. Gene Therapy. 18 (12), 1111-1120 (2011).
  30. van Rooij, E., Olson, E. N. MicroRNA therapeutics for cardiovascular disease: opportunities and obstacles. Nature Reviews. Drug Discovery. 11 (11), 860-872 (2012).
  31. Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3 (1), 1 (2012).
  32. Levin, A. A. A review of the issues in the pharmacokinetics and toxicology of phosphorothioate antisense oligonucleotides. Biochimica et Biophysica Acta. 1489 (1), 69-84 (1999).
  33. Flynt, A. S., Li, N., Thatcher, E. J., Solnica-Krezel, L., Patton, J. G. Zebrafish miR-214 modulates Hedgehog signaling to specify muscle cell fate. Nature Genetics. 39 (2), 259-263 (2007).
  34. Kloosterman, W. P., Lagendijk, A. K., Ketting, R. F., Moulton, J. D., Plasterk, R. H. Targeted inhibition of miRNA maturation with morpholinos reveals a role for miR-375 in pancreatic islet development. PLoS Biology. 5 (8), e203 (2007).
  35. Martello, G., et al. MicroRNA control of Nodal signalling. Nature. 449 (7159), 183-188 (2007).
  36. Fabani, M. M., Gait, M. J. miR-122 targeting with LNA/2'-O-methyl oligonucleotide mixmers, peptide nucleic acids (PNA), and PNA-peptide conjugates. RNA. 14 (2), 336-346 (2008).
  37. Fabani, M. M., et al. Efficient inhibition of miR-155 function in vivo by peptide nucleic acids. Nucleic Acids Research. 38 (13), 4466-4475 (2010).
  38. Babar, I. A., et al. Nanoparticle-based therapy in an in vivo microRNA-155 (miR-155)-dependent mouse model of lymphoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), E1695-E1704 (2012).
  39. Torres, A. G., et al. Chemical structure requirements and cellular targeting of microRNA-122 by peptide nucleic acids anti-miRs. Nucleic Acids Research. 40 (5), 2152-2167 (2012).
  40. Kent, O. A., McCall, M. N., Cornish, T. C., Halushka, M. K. Lessons from miR-143/145: the importance of cell-type localization of miRNAs. Nucleic Acids Research. 42 (12), 7528-7538 (2014).

Tags

Biologi problemet 136 MicroRNA miRNA miRNA-svamp miRNA hemming hydrogenion nanovector miR-181 hjertet mitokondrie miRNA
<em>I Vivo</em> Nanovector levering av en hjerte-spesifikke MicroRNA-svamp
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kent, O. A., Steenbergen, C., Das,… More

Kent, O. A., Steenbergen, C., Das, S. In Vivo Nanovector Delivery of a Heart-specific MicroRNA-sponge. J. Vis. Exp. (136), e57845, doi:10.3791/57845 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter