Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

В естественных условиях Nanovector поставка сердца конкретных микроРНК Губка

Published: June 15, 2018 doi: 10.3791/57845
Automatic Translation
1, 2, 2
1Princess Margaret Cancer Centre, University of Toronto, 2Department of Pathology, Department of Cardiology, Johns Hopkins University

Summary

Ингибирование ткани конкретных микроРНК — это технология, развита в поле микроРНК. Здесь мы описываем протокол успешно подавляют микроРНК miR-181 семьи в myoblast клетки от сердца. Nanovector технология используется для доставки микроРНК Губка, которая демонстрирует значительный в vivo кардио конкретных мир-181 семьи ингибирование.

Abstract

МикроРНК (miRNA) небольшой некодирующих РНК, которая препятствует выражение post-transcriptional матричная РНК (мРНК). Заболеваний человека, таких как рак и сердечно-сосудистых заболеваний, было показано, чтобы активировать ткани или клетки конкретных Мирна выражение, связанное с прогрессирования заболевания. Ингибирование Мирна выражения предлагает возможности для терапевтического вмешательства. Однако традиционные подходы к препятствовать адаптивной, используя antagomir олигонуклеотиды, влияют на функции конкретных Мирна после глобальной доставки. Здесь мы представляем протокол для ингибирования кардио конкретных в естественных условиях , мир-181 семьи в мышиной модели. Мирна Губка конструкция предназначена для включают 10 повторной привязки miR-181 последовательности. Кардио конкретных α-MHC промоутер клонируется в pEGFP позвоночника диск кардио конкретных мир-181 Мирна Губка выражение. Для создания стабильного ячейки линии выражая мир-181-Губка, myoblast H9c2 клетки являются transfected с α-MHC-EGFP-miR-181-sponge конструкцией и отсортированных по активации флуоресценции клеток, сортируя (FACs) в GFP положительные H9c2 клетки, которые культивировали с неомицин (G418). После стабильный рост в неомицин моноклональных клеточных популяций устанавливаются дополнительные СУИМ и одноклеточного клонирования. Результате клетки myoblast H9c2-мир-181-Губка GFP экспонат потеря функции членов семьи мир-181, как оценивать через увеличение выражение мир-181 целевых белков и по сравнению с H9c2 клеток, выражая схватка нефункциональные губкой. Кроме того мы разрабатываем nanovector для системных доставки построим мир-181-Губка, комплексообразующие положительно заряженных липосомальных наночастиц и отрицательно заряженные мир-181-Губка плазмид. В естественных условиях изображений GFP показывает, что множественные инъекции хвост вен nanovector в течение трех недель способны содействовать значительным проявлением мир-181-Губка в кардио конкретным образом. Важно отметить, что потеря функции мир-181 наблюдается в тканях сердца, но не в функции почек или печени. Мирна Губка-это мощный метод для подавления Мирна ткани конкретного выражения. Вождение Мирна Губка выражение из ткани конкретной промоутера обеспечивает специфичности для ингибирования Мирна, которые могут ограничиваться целевых органа или ткани. Кроме того сочетание nanovector и Мирна Губка технологий позволяет эффективной доставки и ткани конкретных Мирна ингибирование в естественных условиях.

Introduction

За последние два десятилетия были многочисленные исследования, которые указали на важную роль адаптивной в болезни человека. Выводы из большого количества литературы демонстрируют бесспорную важность интерферирующим в патофизиологии таких заболеваний, как рак1 и сердечно-сосудистых заболеваний2,3,4,5. К примеру мир-21-upregulated во многих раках, что приводит к увеличению клеток и клеточного цикла распространения6. В инфекции гепатита С мир-122 играет важную роль в репликации вируса7, и было показано, что ингибирование мир-122 снижает вирусную нагрузку8. В гипертрофии сердца мир-212/132-upregulated в самом сердце и участвует в патологический фенотип9. Очевидное значение Даунрегуляция или функциональной ингибитирование upregulated miRNA предлагает возможности для терапевтически эксплуатации Мирна биологии в практически всех заболеваний.

Четыре члена семьи мир-181, мир 181a/b/c/d, находятся в трех местах геномной в геноме человека. Intronic региона некодирующих хост гена РНК (MIR181A1-HG) кодирует кластер мир-181-a/b-1. Intronic область NR6A1 ген кодирует мир-181-a/b-2. Мир-181-c/d кластер расположен в uncharacterized транскрипт на хромосоме 19. Все члены семьи мир-181 поделиться той же последовательности «семян» и все четыре члена семьи мир-181 потенциально может регулировать же мРНК-мишеней.

Мы3,4 и другие10 высветили важность мир-181 членов семьи в течение последней стадии сердечной недостаточности. Мы также признали, что мир - 181c upregulation происходит в патологических условиях, связанных с повышенным риском сердечно-сосудистых заболеваний, например диабета II типа, ожирение и старения3,4,5. Постулируется, что гиперэкспрессия мир - 181c вызывает оксидативного стресса, что приводит к дисфункции сердца4.

Несколько групп предложили что Мирна существуют в митохондриях11,12,13,14, но мы были первыми, чтобы продемонстрировать, что мир - 181 c является производным от ядерного генома, обрабатываются, и впоследствии арестовано митохондрий в RISC3. Кроме того мы обнаружили выражение низкий мир 181a и мир 181b в отсеке митохондриальной сердца5. Важно отметить, что мы нашли что мир - 181 c подавляет выражение mRNA mt-COX1, так, продемонстрировав тем самым интерферирующим участвуют в регуляции митохондриальных генов и изменить функции митохондрий3,4.

Эта статья обсуждает методологии, необходимых для разработки Мирна губкой, чтобы постучать вниз весь мир-181 семьи в кардиомиоцитов. Кроме того мы приводим протокол для применения в естественных условиях мир-181-Губка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все экспериментальные процедуры были утверждены институциональный уход животных и использование комитета университета Джона Хопкинса.

1. Губка дизайн

  1. МикроРНК, привязка 3' УТР
    Примечание: A Мирна функций посредством конкретных базовых спаривания взаимодействия с частично дополнительных сайтов в 3' непереведенные регионе (утр) своей целевой мРНК (всеобъемлющий обзор см. Бартель)15.
    1. Дизайн ингибиторы Мирна выражение как олигонуклеотиды, которые содержат значительную взаимодополняемость в последовательности Мирна. Секвестр микроРНК в олигонуклеотида комплекс через обширные низкопробный спаривать блокировать функцию Мирна.
  2. Дизайн Губка Мирна
    1. Дизайн tandemly выстроил частично взаимодополняющих Мирна последовательности включать выпуклость на позиции обычно расщепляется Argonaute 2. Выпуклость позиционируется в нуклеотиды 9-12 Зрелые Мирна последовательности для предотвращения любого типа расщепление РНК интерференции и деградации губки.
    2. При желании, Дизайн манок последовательности целевого объекта для привязки к всем членам семьи мир-181. После изучения и сравнения последовательностей семьи микроРНК miR-181 найти общую последовательность на 5'-стороне выпуклости, содержащий 8 последовательных нуклеотидов, или найти последовательность общих для всех 4 членов семьи мир-181 на 3'-стороне выпуклости еще 8 последовательных нуклеотидов. Эти 2 последовательности представляют левой и правой половины привязки сайтов, соответственно.
      Примечание: Манок последовательность является массивом тандем левой и правой половины привязки сайтов, разделенных GGA spacer. Связать вместе 5'-конец последовательности и 3'-стороне последовательности (описано в шаге 1.2.2) с распоркой GGA, предназначенных для создания в Арденнах, когда отжигом в микроРНК (как описано в шаге 1.2.1). Повторите этот 1 сайт связывания Мирна 10 x в окончательный мир Губка конструкции.
  3. Другие соображения Губка Мирна
    Примечание: Для того чтобы клонировать последовательности Губка в вектор получателя выражение, ограничение нуклеиназы признание сайтов должен быть включен на каждом конце последовательности. В silico пищеварение анализ должен использоваться для подтверждения неспецифической расщепления Губка последовательности выбранной энзимов ограничения и другие ограничения ферментов, используемых в нисходящие приложения клонирования.
    1. Добавьте двойной стоп-кодон (TAA TAA) в 5'-конце синтетических 3' УТР, таким образом, что мир-181-Губка последовательность не является частью последовательности кодирования для расширенной зеленого флуоресцентного белка (EGFP).
  4. Синтез ДНК Губка для клонирования
    1. Использовать синтезатор ДНК или нанимать коммерчески доступных источник синтезировать последовательности Губка окончательный Мирна с ограничением нуклеиназы признание сайтов в месте для клонирования. Губка поставляется на плазмиды, которые могут содержать выбираемых маркеры для амплификации в бактериях. Кроме того, Губка может быть усугубляется полимеразной цепной реакции (ПЦР) для клонирования или просто бросил доноров вектор с использованием места ограничения, описанные в шаге 1.3 (см. также, шаг 3.1).

2. клонирование получателя вектор включить ткани конкретной промоутера

Примечание: Используйте pEGFP-C1 вектор как получателя вектор для выражения кассету Мирна губки. PEGFP-C1 вектор содержит рамка чтения для EGFP, движимый промоутера цитомегаловирусом (CMV). Промоутер ЦМВ конститутивно активных в mammalian клетках. Если требуется ткани конкретной промоутера, промоутер ЦМВ могут быть удалены пищеварение AseI и NheI ферментов (см. шаг 2.1). Плазмида содержит обширное несколько клонирования сайт (MCS) а также канамицин (Кан) и неомицин (G418) маркеры для отбора в бактериях и стабильной выражение в mammalian клетках, соответственно.

  1. Удаление ЦМВ промоутер из pEGFP-C1
    1. Сделайте 50 мкл реакции пищеварение, содержащие 1 x коммерчески доступных дайджест буфера, предложенные производство ферментов ограничение используется, 5 мкг плазмидной ДНК (в воде) и 5 мкл AseI и NheI ферментов. Добавить все компоненты пробки microcentrifuge и осторожно перемешать, стряхивая его. Спиновые трубки для 10 s в microcentrifuge собирать реакции на дне. Инкубируйте реакции в ванну воды 37 ° C 15 мин.
    2. Очищайте переваривается линеаризованного плазмиды. Добавить 5 x реакции объем буфера привязки столбцов (собственности смесь соответствующую привязку буфера для изготовления ДНК очистки столбцов используется) и очистить реакции со столбцом очистки ДНК как описано заводом-изготовителем. Элюировать с 25 мкл буфера (вода) тщательно добавил к центру столбца.
    3. Гель Очистить переваривается плазмида на 0,5% агарозном геле следующим: добавить 5 мкл загрузки буфера (50% глицерина-3 x загрузки краситель) к eluted плазмиды. Загрузите весь пример 1 хорошо на 0,5% агарозном геле. Включить отдельную Лейн с 500 нг режиссерский вектора. Запустите его для 30-40 мин., пока не будет достигнуто надлежащее разделение подрезанных и неподрезанных плазмид.
    4. Очистить линеаризованного плазмида следующим: визуализировать ДНК в агарозном геле на коробке УФ света. С чистым лезвием тщательно акцизных группы, соответствующий линейных плазмид.
      Примечание: Линейных плазмид следует запустить ниже, чем режиссерский плазмида и будет отображаться как одной полосы на приблизительно 4,2 kb. Подакцизным ЦМВ промоутер будет отображаться как светло-полоса на приблизительно 500 нуклеотидов (nt).
    5. Извлечь ДНК из фрагментов геля, использование коммерчески доступных комплект и элюировать ДНК из столбца с 25 мкл воды.
  2. Клонирование сердца конкретной промоутера в pEGFP-C1
    Примечание: Промоутер альфа миозина тяжелых цепей (α-MHC) был ранее характеризуется и продемонстрировал прямой надежного уровня сердца ограничено выражение, как описано в следующих Molkentin, Jobe и Markham16. В следующей разделах как усилить промоутер вектора для клонирования.
    1. Клонировать α-MHC промоутер между элементами + 420 до-2934 по отношению к транскрипции стартовый сайт в плазмиду p4016 первых проектирование праймеры PCR которые фланге этот регион, а затем плазмида как шаблон для ПЦР. Усилить промоутер региона с помощью ПЦР праймеры ранее описанных5. Вперед и обратного PCR праймеры содержат последовательности дублирования в переваривается концы pEGFP-C1 (шаг 2.1) чтобы разрешить клонирование-фьюжн направлен. Обратитесь к руководству по In-Fusion всеобъемлющее объяснение конструкции праймера для клонирования в-фьюжн. Грунтовка последовательности находятся в таблице 1.
    2. Подготовить реакции PCR 50 мкл, который содержит 1 мкм каждого праймера и 10 ng шаблона ДНК. Добавьте соответствующее количество фермента ПЦР и дНТФ в зависимости от изготовления ПЦР реактивы выбран. Выполняйте ПЦР на стандартный блок Велоспорт ДНК. Выполните 3 min 98 ° C денатурации шаг, после 35 циклов денатурации, отжиг и расширение для 5, 30 и 120 s, соответственно. Включать окончательное расширение 10 мин при 72 ° C.
    3. Очистьте вверх добычи ПЦР и гель. По завершении цикла PCR добавить 5 x реакции объем буфера привязки столбцов к реакции PCR и очистить его со столбцом очистки ДНК как описано заводом-изготовителем. Элюировать смесь с 25 мкл буфера (вода) тщательно добавил к центру столбца.
      1. Добавьте 5 мкл загрузки буфера [50% глицерина (3 x) Загрузка краситель] eluted плазмиды. Загрузите весь пример 1 хорошо на гель агарозы 1%. Запустите его для 30-40 мин; Визуализация и акцизных ПЦР продукта, как описано выше (шаг 2.1.5).
    4. Перевязать α-MHC промоутер с pEGFP-C1 следующим: добавить реакции перешнуровки 10 мкл, содержащие 1 x коммерчески доступных лигирование буфер, 2 мкл очищенный ПЦР и 1 мкл линеаризованного вектора. Выполняют лигирование при 50 ° C за 15 мин и затем охладить его на льду.
    5. Выполните бактериальной трансформации следующим: transfect 50 мкл компетентных клеток с 2,5 мкл-Fusion лигирование смеси путем добавления компонентов. Отдых Eppendorf трубки на льду для 20 минут, положить его в ванну воды 42 ° C для 40 s, а затем место трубку на льду на 2 мин.
      1. После преобразования добавить 350 мкл SOC СМИ и расти клеток при 37 ° C для 45 мин плита 200 мкл раствора нарост на ФУНТ пластин с Kan. выполняют колонии ПЦР для выявления Кан устойчивостью клетки, которые содержат α-MHC промоутер перевязки.
        Примечание: Скрининг грунтовки были разработаны для ПЦР на стыке перевязки.
    6. Разверните ПЦР позитивные клонов в LB-Кан бульон и плазмиды, очищенной с помощью стандартных мини-готовит протоколы очищения плазмиды, как описано изготовителем.

3. клонирование Губка

  1. Дайджест получателя вектор
    1. Сделать плазмида α-MHC-pEGFP линейный для клонирования с EcoRI и KpnI и очищение геля, как описано выше (шаг 2.1).
  2. PCR усиливает и дайджест Губка ДНК
    1. Используйте мир-181-Губка и соответствующий 284-nt долго карабкаться, Доставка векторов как шаблон для ПЦР. Усилить регионе губкой, используя ранее описанные ПЦР праймеры5. Обратите внимание, что прямого и обратного PCR праймеры содержат последовательности энзима ограничения позволяют перевязка в α-MHC-pEGFP-C1. Выполните ПЦР, как описано выше (шаг 2.2.2). Очищайте продукты PCR до пищеварение, как описал (шаг 2.2.3) и этого eluted их с водой для пищеварения. Для грунтовки последовательностей, см. Таблица 1.
    2. Дайджест Губка ДНК для перевязки. Реакция пищеварение 50 мкл содержит 1 x дайджест буфер, реакция PCR гель очищенная от шага 3.2.1 и 5 мкл EcoRI и KpnI ферментов. Добавить все компоненты пробки microcentrifuge и осторожно перемешать, стряхивая его. Спиновые трубки для 10 s в microcentrifuge собирать реакции на дне. Инкубируйте реакции в ванну воды 37 ° C 15 мин.
    3. Очищайте переваривается ПЦР губки с помощью ПЦР очистки столбца, как описано выше (шаг 2.2.1).
  3. Перевязать мир-181-Губка в вектор α-MHC-pEGFP-C1
    1. 21 реакции перешнуровки мкл, который содержит 1 x лигирование буфер, 3 мкл переваривается и очищенного мир-181-Губка ПЦР, 1 мкл линеаризованного вектора α-MHC-pEGFP-C1, 1 x буфер ДНК и ДНК лигаза 1 мкл. Выполняют лигирование при комнатной температуре на 5 мин и затем поместите его на льду.
    2. Трансформировать 50 мкл компетентных клеток XL1-синий с 2 мкл лигирование смеси. Используйте преобразование и покрытие протоколы, как описано выше (шаг 2.2.5). Выполните колонии ПЦР для выявления Кан резистентных бактерий, которые содержат правильную последовательность α-MHC-pEGFP-miR-181-sponge. Дизайн, скрининг праймеры PCR через перекрестка перевязки. В таблице 1 приведена последовательностей праймера.
    3. Усилить и последовательности вектор. Разверните ПЦР позитивные клонов в LB-Кан бульон и плазмиды, очищенной с помощью стандартных мини-готовит протоколы очищения плазмиды. Выполните секвенирования ДНК для проверки выражения желаемого последовательностей ДНК плазмиды.

4. поколение стабильной H9c2 мир-181-Губка выражая клеток

  1. Роста и поддержания H9c2 клеток
    1. Культура H9c2 клетки в средних Дульбекко изменение орла (DMEM), содержащие плода бычьим сывороточным (ФБС) до конечной концентрации 10%. Югу культуре клетки, с помощью стандартных протоколов и расти их при 37 ° C в 5% углекислого газа.
  2. Трансфекция и подбор H9c2 α-MHC-pEGFP-C1-miR-181-sponge, выражая клетки
    1. Выполните электропорации H9c2 клеток для достижения наилучших результатов. Transfect крыса сомитов (H9c2) с губкой схватка (284-nt долго карабкаться последовательность, которая заменяет мир-181-Губка последовательность) или α-MHC-pEGFP-miR-181-sponge конструкции с electroporator.
      1. Кратко, transfect 4 x 10-5 клеток с 2 мкг плазмидной ДНК (в 5 мкл H2O) и 100 мкл раствора совместимы с устройством электропорации. Используйте программу электропорации DS-120 для transfect H9c2 клетки.
      2. Инкубируйте transfected клеток в кювет для 10 мин при комнатной температуре. Добавьте 500 мкл DMEM непосредственно в кювет. Аккуратно перенести содержимое всего кювет хорошо 6-ну плиты.
    2. Выберите для GFP позитивных клеток после 48 ч после трансфекции, СУИМ. Пластина только клетки выразили ГПУП в 6-ну плиту с добавлением неомицин (G418) (400ng/мл) в полный рост СМИ.
      Примечание: До G418 выбора, убить кривой следует определить количество неомицин, необходимых для отбора. Для H9c2 клеток, 400 нг/мл G418 привело к приблизительно 80% смертность не плазмида transfected клеток H9c2 после 24 ч и считалось желаемой рабочей концентрации G418 для этих клеток. Линии клетки считался стабильной после того, как рост поддерживался в G418 на 16 дней.
    3. Выполнение сортировки СУИМ стабильной клеток G418, с помощью выражения гена GFP как маркер для Губка позитивного выбора. Семена 5-10 клеток в каждой скважине 96-луночных плиты сортировки потока. Разверните моноклональных клетки от 96-луночных пластины пластины 24-Ну за несколько проходов. Использование запасов морозильник клеток от прохода 3 клетки (P3) как отправной точкой для последующих экспериментов.
    4. Выполните все на основе клеток линия эксперименты с низким проход клетки между P5 и P10.

5. Синтез и очистки губки-наночастиц (мир-181-Губка наночастиц)

  1. Подготовьте липосомальных наночастиц, растворяя катионного Амфифильность (DOTAP) и Сопредседатель липидов, холестерина и DSPE-PEG-OMe, в соотношении 5:5:0.1 мм, соответственно, в смесь хлороформ и метанола в стеклянный флакон.
  2. Удаление органических растворителей в 44-45 ° C, под вакуумом с помощью роторный испаритель, а затем нежный поток свободной влаги азота. Держите оставшиеся едкого липидов под высоким вакуумом для 8 h.
  3. Приготовить смесь, добавив 5% глюкозы к фильму вакуум сушеные липидов. Оставьте его на ночь разрешить эту смесь гидрата фильм. Вихрь флакон для 2-3 мин при комнатной температуре для того чтобы произвести multilamellar пузырьки с случайные тряски в водяной бане 45 ° C.
    1. Sonicate multilamellar везикулы подготовить мелких однослойных везикул в ледяной ванне для 3-4 минут до ясности можно наблюдать, на 100% рабочий цикл и 25 Вт выходная мощность.
  4. Смешайте схватка последовательности или последовательности мир-181-Губка, клонированные в pEGFP(α-MHC) векторов и липосомами на основе соотношения 1:3 бесплатно сформировать nanovector4.
    Примечание: Электростатический комплекс положительно заряженных липосомальных наночастиц и отрицательно заряженные плазмидной ДНК известен как nanovector.

6. Системные поставки Губка наночастиц и проверки в Vivo эффектов

  1. Системные поставки Губка-наночастиц в крыс
    1. Используйте крысах Sprague-Dawley (SD). Вводить внутривенно крыс с nanovector мир-181-Губка или карабкаться nanovector через Вену хвост. Использование SD самцов крыс, которые являются около 200 г веса тела.
    2. Выполнение инъекции Вену хвост, с использованием в дозе 4 мг, nanovector/кг веса тела и повторить это, используя режим 6 инъекции Вену хвост более 2 недель. После неоднократных nanovector доставки позволяют 1-недельный период (15-21 дней) для выражения вектор в естественных условиях.
    3. Подтвердите оптимизацию изображений GFP сигнала до, во время и после родов nanovector. Анализировать сигнал GFP томографических изображений программное обеспечение, которое генерирует полу количественных данных.
  2. Проверка в естественных условиях мир-181 ингибирования мир-181-Губка
    1. Выполните западную помарку для того чтобы продемонстрировать выражение функциональных мир-181-губкой в ткани сердца.
      Примечание: Для этого исследования, было рассмотрено выражение mt-COX1, так.
  3. Функциональные последствия в естественных условиях мир-181-Губка выражение в самом сердце
    1. Выполните двухмерный, M-режим и Допплер эхокардиографии, во время и после родов nanovector для анализа функции сердца и морфологические изменения. Для лучше сканирования потенциала в сердцах грызунов используйте ультразвуковую систему с датчика линейного массива 15 МГц.
    2. Анестезия может повлиять сократимости сердца; Таким образом выполните доставку мир-181-Губка nanovector или nanovector схватка для животных, которые сознательно и без каких-либо анестезии реагента во время процесса эхокардиографии. Пожалуйста, смотрите Дас, и др. 4 для дальнейших разъяснений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В стабильно transfected pEGFP мир-181-Губка выражая H9c2 клеток (от шага 4.2) выражение всей семьи мир-181 (мир 181a, мир 181b, мир - 181c и мир - 181d) умеренно снизился по отношению к pEGFP яичница выражая H9c2 клеток. Мир-181-Губка служит конкурентный ингибитор весь мир-181 семьи, поэтому мы полагали, что выражение из мир - 181c митохондриальной целевых генов, mt-COX1, так, увеличится. Западная помарка данные показывают, что выражение mt-COX1, так было увеличено в pEGFP мир-181-Губка выражая H9c2 клеток, по сравнению с pEGFP схватка выраженные H9c2 клеток. Кроме того изменения не выражение для МТ COX2 или mt-COX3 были обнаружены через immunoblot в клетках H9c2 pEGFP мир-181-Губка выражая. Мы использовали α-тубулина как нормализация управления для immunoblotting анализа. GFP сигналы главным образом наблюдались в печени и почек до 2 недель после системного доставка мир Губка nanovector (рис. 1A). Однако экспрессия гена GFP был значительно выше в ткани сердца после 3 недель мир-181-Губка nanovector доставки (рис. 1A и 1B). Следует отметить был сигнал GFP, обнаруженных в ткани печени в некоторых животных 3 недели после системные поставки; Однако были не функциональные последствия мир-181-Губка в печени в тот момент времени.

Западная помарка, показали значительное увеличение в выражении mt-COX1, так в nanovector вводят крыс мир-181-Губка, по сравнению с группами nanovector схватка (рис. 2). Выше mt-COX1, так предполагает, что существует нижний мир - 181 c выражение в самом сердце после 3 недель мир-181-Губка nanovector доставки, как mt-COX1, так является прямой мишенью для мир - 181 c. Мы использовали α-тубулина как нормализация управления для иммуноблотов.

Эхокардиография показали никаких изменений в функции сердца крыс вводят nanovector мир-181-Губка до, во время и в конце лечения, по сравнению с группой nanovector схватка животных.

Figure 1
Рис. 1. В естественных условиях анализ nanovector доставку мир-181-Губка. (A) Эта панель показывает оптимизированный 3-недельного лечения протоколы с 6 внутривенные инъекции через Вену хвост. Желтой окраски в изображении эпифлуоресцентного демонстрирует выражение pEGFP вектора. 3 время точки на недели наблюдается максимальная интенсивность желтой окраски. (B) α-MHC промоутер последовательности в векторе pEGFP выборочно выражает мир-181-Губка или омлет последовательность в самом сердце на 21 день. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2. Проверка воздействия мир-181-Губка nanovector на мир - 181c выражение. Это Западный анализ помаркой выражения mt-COX1, так в сердце лизатов, полученные от pEGFP схватка и pEGFP мир-181-Губка nanovector вводили крысам. Целом сердце гомогенатах были зондируемой с указанных антител. Мы использовали α-тубулина как элемент управления загрузки. Группа денситометрия показано в графе бар ниже. Студента t-тест был проведен, и стандартная ошибка было изобразить в гистограмме как погрешностей. p < 0,05 против pEGFP схватка группы. n = 4.

Грунтовка имя Последовательность TM Примечания Использование Цель
SAM3-1F ATGCATTAGTTATTAATGCTT
GACACACTTGACAATTTCT		 58,4 Крыса MHC промоутер для клонирования в EGFP PCR MHC промоутер
SAM3-2R GACCGGTAGCGCTAGCTG
ACTCACTGGGAGATTGCTT		 59,8 Крыса MHC промоутер для клонирования в EGFP PCR MHC промоутер
SAM3-3Ф CGAACGACCTACACCGAACT 64 Экран EGFP-F Колония PCR Позитивные промоутер клоны
SAM3-4R CGCTAGTCCTTGACCCTCTG 63.9 Экран MHC-R Колония PCR Позитивные промоутер клоны
SAM5-1F CCTGTCTCCAACACACAAGC 59,3 Промоутер последовательности MHC Виртуализация MHC промоутер
SAM5-2R CAGACTGCAGGGCTGGTT 60 Промоутер последовательности MHC Виртуализация MHC промоутер

Таблица 1. Грунтовка последовательности.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Эта статья описал дизайн и синтез губкой Мирна и продемонстрировал, как ткани конкретным выражением Губка является мощным инструментом для ингибирования ткани специфические Мирна семьи выражение.

Мы продемонстрировали, что мир-181 семьи против Губка можно клонировать в выражение плазмиду с сердца конкретной промоутера. Плазмиды могут быть эффективно упакованы в nanovector частиц для доставки как in vitro , так и в естественных условиях с помощью электропорации или инъекции Вену хвост, соответственно (рис. 1). Мир-181 Губка может препятствовать сердца конкретного выражения мир-181 семьи и может повлиять на выражение генов-мишеней мир-181 (рис. 2). Гена GFP в плазмиду является дополнительным преимуществом, которые можно визуализировать доставки и выражение профиль nanovector без ущерба для животных.

Вкратце Мирна Губка состоит из серии Мирна антисмысловых последовательностей после Репортер ген, что действует как приманка Мирна целевой мРНК. Естественно происходя Мирна губки были найдены эндогенно выражаться в растениях и животных клеток как долго кодирования РНК (lncRNAs)17. В настоящем исследовании мы использовали подход Губка для ингибирования весь мир-181 семьи в самом сердце. Хотя мир-181-Губка подход является физиологически соответствующий метод с помощью мир-181 семьи в культивируемых клеток, в естественных условиях применение мир-181-губки может быть пагубным. Например несколько исследований продемонстрировали защитную роль мир 181a и мир 181b в разных клеток/тканей типа18,19,20. Таким образом мир-181-Губка выражения должны быть направлены конкретно на ткани сердца.

Небольшие олигонуклеотиды продемонстрировали блокировать функцию Мирна путем отжига в strand пожилые Мирна руководство и предотвратить загрузку в РНК-комплекс (RISC). Проблема, связанная с этим подходом, что олигонуклеотиды должны доставляться в насыщения доза достаточна, чтобы поглощать сотовой бассейны зрелых адаптивной. Олигонуклеотиды также страдают от проблем, связанных с транспорта через клеточные мембраны и общей стабильности молекулы. Гениально было показано, что конечный объект экзогенно предоставленного Мирна может выступать в качестве приманкой для своих родственных Мирна21. В силу нескольких сайтов связывания, привязал вместе в псевдо 3' УТР конструкцию, манок целевой или Мирна Губка, способен стабильно взаимодействовать с его целевой адаптивной и секвестр микроРНК в microribonucleoprotein комплексов (miRNPs), таким образом эффективно предотвращение функция микроРНК. Так называемый «Мирна Губка» является эффективной анти смысл технологии, которые могут эффективно помощью микроРНК в пробирке и в естественных условиях. Таким образом применение Мирна Губка может использоваться для изучения Мирна потери функции фенотипов.

В том, что РНК-интерференции (RNAi) может привести к новому классу терапии привлекли внимание многих детективов вскоре после его открытия. Поле прикладной RNAi терапии очень быстро перешел от лаборатории постели. В настоящее время Мирна терапия является одним из быстро растущих терапевтических вмешательств в онкологии и в настоящее время в фазе 1 клинических испытаний. Антисмысловые олигонуклеотиды, или antagomirs, являются одним из наиболее широко используемых Мирна ингибирующее подходов. Ма и др. 22 используется antagomir мир 10b, как in vitro , так и в естественных условиях, чтобы заставить замолчать upregulated мир 10b в твердой опухоли.

В естественных условиях, эффективного подавления upregulated интерферирующим требует химическая модификация antagomirs улучшить сродство, биостойкость и фармакокинетические свойства. Для увеличения дуплекс плавления температура (Tm) и улучшить нуклеиназы сопротивление antagomirs, могут выполняться химические изменения, например 2′-O-метил (2′-O-Me), 2′-O-метоксиэтиловый (2′ МО) 2′ фтор и бициклических заблокирован нуклеиновой кислоты ( МШУ)23,24,25,26,27,28,,2930,31. Для повышения эффективности доставки в естественных условиях antagomir могут быть изменены путем фосфоротиоат (PS) связей, которые увеличили нуклеиназы сопротивления28. Кроме того изменения позвоночника Л.С. также повысить связывание с белками плазмы, снижения экскреции. Таким образом PS-модифицированных antagomirs показывают значительное улучшение фармакокинетические свойства, содействие их системные поставки32. Также было показано, что использование пептида нуклеиновой кислоты (PNA) или Морфолино олигомеров, предназначенные для конкретных Мирна, может использоваться для изучения Мирна потери функции фенотипов33,34,35, 36 , 37 , 38 , 39. Polylysine конъюгированных и наночастиц complexed ПНА antagomirs эффективно подавляют Мирна функционировать как in vitro и in vivo36,,3738, 39. Несмотря на недавние успехи, эффективной и ткани конкретных доставки Мирна-производных остается проблемой. К ним относятся возможности пробить эффектов, вызывая врожденные иммунные реакции и, самое главное, получения конкретных доставки в клетки целевых органов/тканей.

Кроме того уровни выражения Мирна варьироваться в зависимости от клетки и ткани введите40. Кроме того Мирна выражение может быть увеличивается или уменьшается в болезни. Следствием выражения изменены Мирна и влияние на клеточные и тканевые функции с губкой тормозится Мирна выражение необходимо проверить и определяется эмпирически. Обширные доклинические исследования болезней животных моделей необходимо определить оптимальный уровень торможения для целевого объекта данной Мирна.

Интересно, что мир - 181c Мирна экспонатов субцеллюлярные дробления3,4,5. В частности как ожидается, мир-181s кодируются в ядре и транскрибируется как Лонг pri-miRNA стенограмм, которые обрабатываются в цитоплазме ножевой механизм и включены в RISC. Однако в отличие от канонических интерферирующим функционировать в цитоплазме, Зрелые формы мир - 181c translocates в митохондриях и функций в регуляции генов митохондрий конкретных3. Мы продемонстрировали, что мир-181-губки можно привязать зрелой формы в мир - 181c в цитоплазматических фракции, таким образом предотвращая транслокации митохондрий. Следовательно upregulation МТ-COX1, так можно наблюдать в митохондриях в условиях Даунрегуляция мир - 181c выражения.

Мы сообщили методологии, необходимых для разработки Мирна губкой, чтобы сбить выражение любого Мирна и изложил протокол для применения в vivo Мирна Губка. Ткани конкретных Мирна ингибирование в настоящее время развиты техника в области Мирна. Важность Даунрегуляция или функциональной ингибитирование upregulated интерферирующим в болезни человека свидетельствует о том, что он может быть использована Мирна биологии для терапевтической интервенции.

Это исследование позволило высветить стратегии для снижения Мирна, которые могут быть успешно использованы в ткани конкретным образом в естественных условиях. Мирна губки используют антисмысловых последовательность Мирна последовательность «семян». Таким образом, Мирна губки можно помощью все адаптивной, что одни и те же «семян», последовательность, viz., Мирна всей семьи. В этом исследовании, мы наблюдали значительное Даунрегуляция всей семьи мир-181 (мир 181a, мир 181b, мир - 181c и мир - 181d) с выражением мир-181-Губка, в пробирке и в естественных условиях. Если один из членов семьи обеспечивает защиту, в то время как другой член семьи имеет пагубные последствия в том же органе, с использованием технологии Мирна Губка не будет идеальный подход.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Мы благодарим Энтони K. L. Leung Кафедра биохимии и молекулярной биологии, Блумбергской школой общественного здравоохранения, Университет Джона Хопкинса для его технической помощи с проектирование конструкции мир-181-Губка. Мы также благодарим Полина Сыса-Шах и Кэтлин Габриелсон отдела молекулярной и сравнительной Pathobiology, Джонс Хопкинс медицинских учреждений для их технической помощи изображений в естественных условиях доставки Мирна Губка.

Эта работа было поддержано грантов из низ, HL39752 (для Charles Steenbergen) и ученый развития гранта от Американской ассоциации сердца 14SDG18890049 (до Samarjit дас). Крыса кардио конкретной промоутера щедро предоставляемые Джеффри D. Molkentin в Цинциннати детской больнице.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pEGFP-C1 vector Addgene 6084-1
In-fusion Clontech 121416
QIAprep Miniprep Qiagen 27104
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
miR-181-sponge synthesis Introgen GeneArt custome made
PCR primers Integrated DNA Technologies custome
EcoRI enzymes New Endland Biolabs R0101S
KpnI enzymes New Endland Biolabs R0142S
Rapid DNA Ligation Kit Sigma-Aldrich 11635379001
H9c2 cells ATCC CRL-1446
DMEM Media Thermo Fisher Scientific 11965092
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 10082139
Nucleofector 2b Device Lonza AAB-1001
Nucleofector Kits for H9c2 (2-1) Lonza VCA-1005
G418, Geneticin Thermo Fisher Scientific 11811023
FACSAria II Flow cytometer BD Bioscience 644832
Branson 450 sonifier Marshall Scientific EDP 100-214-239
The Xenogen IVIS Spectrum optical imaging device Caliper Life Sciences
Anti-MTCO1 antibody Abcam ab14705
α-tubulin antibody Abcam ab7291
Sequoia C256 ultrasound system Siemens

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hammond, S. M. microRNA detection comes of age. Nat Methods. 3 (1), 12-13 (2006).
  2. van Rooij, E., Olson, E. N. MicroRNAs: powerful new regulators of heart disease and provocative therapeutic targets. The Journal of Clinical Investigation. 117 (9), 2369-2376 (2007).
  3. Das, S., et al. Nuclear miRNA regulates the mitochondrial genome in the heart. Circulation Research. 110 (12), 1596-1603 (2012).
  4. Das, S., et al. miR-181c regulates the mitochondrial genome, bioenergetics, and propensity for heart failure in vivo. PLoS One. 9 (5), e96820 (2014).
  5. Das, S., et al. Divergent effects of miR-181 family members on myocardial function through protective cytosolic and detrimental mitochondrial microRNA targets. Journal of the American Heart Association. 6 (3), e004694 (2017).
  6. Sicard, F., Gayral, M., Lulka, H., Buscail, L., Cordelier, P. Targeting miR-21 for the therapy of pancreatic cancer. Molecular Therapy. 21 (5), 986-994 (2013).
  7. Jopling, C. L., Yi, M., Lancaster, A. M., Lemon, S. M., Sarnow, P. Modulation of hepatitis C virus RNA abundance by a liver-specific microRNA. Science. 309 (5740), 1577-1581 (2005).
  8. Lanford, R. E., et al. Therapeutic silencing of microRNA-122 in primates with chronic hepatitis C virus infection. Science. 327 (5962), 198-201 (2010).
  9. Ucar, A., et al. The miRNA-212/132 family regulates both cardiac hypertrophy and cardiomyocyte autophagy. Nature Communications. 3, 1078 (2012).
  10. Zhu, X., et al. Identification of micro-RNA networks in end-stage heart failure because of dilated cardiomyopathy. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (9), 1173-1187 (2013).
  11. Bandiera, S., et al. Nuclear outsourcing of RNA interference components to human mitochondria. PLoS One. 6 (6), e20746 (2011).
  12. Barrey, E., et al. Pre-microRNA and mature microRNA in human mitochondria. PLoS One. 6 (5), e20220 (2011).
  13. Bian, Z., et al. Identification of mouse liver mitochondria-associated miRNAs and their potential biological functions. Cell Research. 20 (9), 1076-1078 (2010).
  14. Kren, B. T., et al. MicroRNAs identified in highly purified liver-derived mitochondria may play a role in apoptosis. RNA Biology. 6 (1), 65-72 (2009).
  15. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
  16. Molkentin, J. D., Jobe, S. M., Markham, B. E. Alpha-myosin heavy chain gene regulation: delineation and characterization of the cardiac muscle-specific enhancer and muscle-specific promoter. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 28 (6), 1211-1225 (1996).
  17. Poliseno, L., et al. A coding-independent function of gene and pseudogene mRNAs regulates tumour biology. Nature. 465 (7301), 1033-1038 (2010).
  18. Henao-Mejia, J., et al. The microRNA miR-181 is a critical cellular metabolic rheostat essential for NKT cell ontogenesis and lymphocyte development and homeostasis. Immunity. 38 (5), 984-997 (2013).
  19. Williams, A., Henao-Mejia, J., Harman, C. C., Flavell, R. A. miR-181 and metabolic regulation in the immune system. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 78, 223-230 (2013).
  20. Hori, D., et al. miR-181b regulates vascular stiffness age dependently in part by regulating TGF-beta signaling. PLoS One. 12 (3), e0174108 (2017).
  21. Ebert, M. S., Sharp, P. A. MicroRNA sponges: progress and possibilities. RNA. 16 (11), 2043-2050 (2010).
  22. Ma, L., et al. Therapeutic silencing of miR-10b inhibits metastasis in a mouse mammary tumor model. Nature Biotechnology. 28 (4), 341-347 (2010).
  23. Davis, S., Lollo, B., Freier, S., Esau, C. Improved targeting of miRNA with antisense oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 34 (8), 2294-2304 (2006).
  24. Davis, S., et al. Potent inhibition of microRNA in vivo without degradation. Nucleic Acids Research. 37 (1), 70-77 (2009).
  25. Elmen, J., et al. LNA-mediated microRNA silencing in non-human primates. Nature. 452 (7189), 896-899 (2008).
  26. Esau, C. C. Inhibition of microRNA with antisense oligonucleotides. Methods. 44 (1), 55-60 (2008).
  27. Stenvang, J., Kauppinen, S. MicroRNAs as targets for antisense-based therapeutics. Expert Opinion on Biological Therapy. 8 (1), 59-81 (2008).
  28. Lennox, K. A., Behlke, M. A. A direct comparison of anti-microRNA oligonucleotide potency. Pharmaceutical Research. 27 (9), 1788-1799 (2010).
  29. Lennox, K. A., Behlke, M. A. Chemical modification and design of anti-miRNA oligonucleotides. Gene Therapy. 18 (12), 1111-1120 (2011).
  30. van Rooij, E., Olson, E. N. MicroRNA therapeutics for cardiovascular disease: opportunities and obstacles. Nature Reviews. Drug Discovery. 11 (11), 860-872 (2012).
  31. Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3 (1), 1 (2012).
  32. Levin, A. A. A review of the issues in the pharmacokinetics and toxicology of phosphorothioate antisense oligonucleotides. Biochimica et Biophysica Acta. 1489 (1), 69-84 (1999).
  33. Flynt, A. S., Li, N., Thatcher, E. J., Solnica-Krezel, L., Patton, J. G. Zebrafish miR-214 modulates Hedgehog signaling to specify muscle cell fate. Nature Genetics. 39 (2), 259-263 (2007).
  34. Kloosterman, W. P., Lagendijk, A. K., Ketting, R. F., Moulton, J. D., Plasterk, R. H. Targeted inhibition of miRNA maturation with morpholinos reveals a role for miR-375 in pancreatic islet development. PLoS Biology. 5 (8), e203 (2007).
  35. Martello, G., et al. MicroRNA control of Nodal signalling. Nature. 449 (7159), 183-188 (2007).
  36. Fabani, M. M., Gait, M. J. miR-122 targeting with LNA/2'-O-methyl oligonucleotide mixmers, peptide nucleic acids (PNA), and PNA-peptide conjugates. RNA. 14 (2), 336-346 (2008).
  37. Fabani, M. M., et al. Efficient inhibition of miR-155 function in vivo by peptide nucleic acids. Nucleic Acids Research. 38 (13), 4466-4475 (2010).
  38. Babar, I. A., et al. Nanoparticle-based therapy in an in vivo microRNA-155 (miR-155)-dependent mouse model of lymphoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), E1695-E1704 (2012).
  39. Torres, A. G., et al. Chemical structure requirements and cellular targeting of microRNA-122 by peptide nucleic acids anti-miRs. Nucleic Acids Research. 40 (5), 2152-2167 (2012).
  40. Kent, O. A., McCall, M. N., Cornish, T. C., Halushka, M. K. Lessons from miR-143/145: the importance of cell-type localization of miRNAs. Nucleic Acids Research. 42 (12), 7528-7538 (2014).

Tags

Биология выпуск 136 микроРНК Мирна Мирна Губка Мирна ингибирование наночастиц nanovector мир-181 сердце митохондриальных Мирна
<em>В естественных условиях</em> Nanovector поставка сердца конкретных микроРНК Губка
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kent, O. A., Steenbergen, C., Das,… More

Kent, O. A., Steenbergen, C., Das, S. In Vivo Nanovector Delivery of a Heart-specific MicroRNA-sponge. J. Vis. Exp. (136), e57845, doi:10.3791/57845 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter